Microscopía electrónica de transmisión: una herramienta de patología quirúrgica para el neuroblastoma

Resumen

Los tumores pediátricos pequeños y redondos de células azules son una colección de neoplasias intrigante y desafiante. Por lo tanto, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el conocimiento profesional de los tumores pediátricos pueden ser extremadamente valiosos en la patología quirúrgica. En este trabajo presentamos un protocolo para la realización de TEM en el diagnóstico de neuroblastoma, uno de los tumores sólidos más frecuentes en la infancia.

Resumen

Los tumores pediátricos de células azules pequeñas y redondas (PSRBCT, por sus siglas en inglés) son una colección de neoplasias intrigante y desafiante. La microscopía óptica de tumores pequeños y redondos de células azules identifica las células pequeñas y redondas. Albergan un núcleo generalmente hipercromático y un citoplasma basófilo relativamente escaso. Los tumores pediátricos de células azules redondas pequeñas incluyen varias entidades. Por lo general, incorporan tumor de Wilms, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing, retinoblastoma, linfoma y osteosarcoma de células pequeñas, entre otros. Incluso mediante el uso de la inmunohistoquímica, el diagnóstico diferencial de estas neoplasias puede ser controvertido en la microscopía óptica. Una tinción tenue o un fondo ambiguo pueden disuadir a los patólogos de tomar la decisión diagnóstica adecuada. Además, la biología molecular puede proporcionar una cantidad abrumadora de datos difíciles de distinguir, y algunas translocaciones pueden observarse en más de una categoría. Por lo tanto, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) puede ser extremadamente valiosa. Aquí destacamos el protocolo moderno para los datos TEM del neuroblastoma. Las células tumorales con ovillos de procesos citoplasmáticos que contienen gránulos neurosecretores pueden diagnosticar neuroblastoma.

Introducción

El trabajo de un patólogo puede ser bastante desafiante tanto en el diagnóstico clínico como en los campos de investigación. La evolución de la microscopía óptica en^{los siglos XVIII} y XIX fue notable. La potencia de un microscopio electrónico se basa principalmente en la longitud de onda de los electrones, que es más corta que la luz ^1,2,3. Antes de la llegada de los anticuerpos policlonales y monoclonales y su aplicación en inmunohistoquímica, la TEM desempeñaba un papel influyente en el diagnóstico de tumores pequeños y redondos de células azules.

A partir de los años 90 del siglo pasado, el abordaje inmunohistoquímico ha sustituido a la herramienta morfológica en el diagnóstico⁴. En la actualidad, existen miles de nuevos anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos a antígenos del grupo de tumores de células azules pequeñas y redondas 4,6,7,8. En la última década del prolífico siglo^XX y la primera década de principios^{del siglo XXI}, la biología molecular, incluida la hibridación fluorescente in situ, desde sondas genómicas hasta la secuenciación de nueva generación, parece haber reemplazado el importante papel de aplicación de la inmunohistoquímica en varios laboratorios⁴. La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos de América, la Agencia Canadiense de Inspección de Alimentos (CFIA) de Canadá, la Agencia de Protección Ambiental (EPA) u organismos gubernamentales similares de otros países no siempre aprueban los protocolos de biología molecular⁹. Parece que hay una gran cantidad de información bastante difícil de insertar en un informe de patología que puede ser utilizada con fines terapéuticos, y la elección oculatada de un sistema de información de laboratorio bien financiado y en funcionamiento es crítica¹⁰. Mientras tanto, la inmunohistoquímica ha revelado numerosos escollos, con tumores epiteliales que muestran marcadores mesenquimales y viceversa¹¹. La transición epitelio-mesenquimal ha confundido algunas fronteras en los grupos de patología ^12,13. En los últimos años, se ha hecho evidente que la microscopía electrónica floreció en varios laboratorios de todo el mundo¹⁴. En particular, el tiempo de respuesta de las muestras de tejido ha disminuido de semanas a solo 3 días o incluso menos utilizando varios protocolos que abordan la tinción con anticuerpos monoclonales o policlonales ^4,10.

Además, la aplicación de una cámara electrónica acoplada al microscopio electrónico ayudó a proporcionar a los patólogos una imagen rápida, que es versátil en diferentes sistemas operativos. Finalmente, algunos anticuerpos, incluso después de la recuperación de antígenos, son difíciles de revelar en algunas áreas de necrosis o cambios relacionados con la autofagia/isquemia. Al mismo tiempo, la microscopía electrónica en buenas manos aún puede ofrecer excelentes resultados y sugerencias para la correcta clasificación de tumores patológicos desconocidos¹⁵.

El grupo de tumores infantiles de células azules redondas pequeñas incluye varios tumores, principalmente neuroblastoma, tumor de Wilms o nefroblastoma, rabdomiosarcoma y sarcoma de Ewing. Los datos de biología molecular relativos al grupo pediátrico de tumores pequeños y redondos de células azules pueden ser abrumadores debido a las técnicas aplicadas. Es posible que las células azules redondas pequeñas no difieran mucho en las tinciones de rutina (tinción de hematoxilina y eosina), y algunos tumores pueden tener características inmunofenotípicas aberrantes. Los avances en biología molecular han sido enormes desde el descubrimiento de TEM. En el grupo de tumores pequeños y redondos de células azules, es posible que algunas neoplasias se encuentren con más frecuencia que otras, pero es necesario tenerlas en cuenta. Aunque el carcinoma papilar de células renales no es esencialmente un tumor pequeño y redondo de células azules, sino que presenta principalmente papilas, puede mostrar algunas áreas de células redondas que pueden necesitar ser distintas de otros tumores pequeños y redondos de células azules bien conocidos (por ejemplo, el tumor de Wilms) utilizando varias técnicas auxiliares¹⁶. En última instancia, los tumores del estroma metanéfrico también pueden necesitar ser tomados en cuenta para el diagnóstico diferencial¹⁷. El tumor rabdoide es un tumor pediátrico particularmente maligno, que se distingue en el subtipo renal y extrarrenal¹⁸.

El neuroblastoma es una de las neoplasias malignas sólidas más comunes en la infancia y la niñez. Las células del neuroblastoma son las células malignas de este tumor sólido que surgen insidiosamente a partir de derivados de la cresta neural primordial. Su diagnóstico y diagnóstico diferencial puede ser difícil. Su biología natural ha experimentado avances notables en las últimas dos décadas. La familia de factores de transcripción forkhead se caracteriza por un dominio "forkhead" distinto (FOXO3/FKHRL1). Estos factores de transcripción funcionan como desencadenantes de la apoptosis (muerte celular programada) a través de la expresión de genes necesarios para la muerte celular. FOXO3/FKHRL1 es activado por la 5-aza-2-desoxicitidina e induce la caspasa-8 silenciada, y este complejo desempeña un papel crucial en el neuroblastoma. El FOXO3 nuclear predice resultados clínicos adversos y promueve la angiogénesis tumoral en el neuroblastoma ^7,19. A pesar de los avances en patología molecular, la clasificación de Shimada sigue siendo el estándar de práctica para cualquier patólogo y oncólogo pediátrico. Es fundamental para diferenciar entre histología favorable y desfavorable 20,21,22,23.

La justificación para el desarrollo de un protocolo sencillo para la microscopía electrónica de tumores sospechosos de neuroblastoma está relacionada con la viabilidad y solidez del examen ultraestructural de la muestra de tejido. Rara vez se altera por problemas que se encuentran comúnmente mediante la inmunohistoquímica. La justificación y el protocolo han sido la base de varios libros de texto y contribuciones científicas a la patología pediátrica y a la microscopía electrónica ^4,24,25. Este protocolo abarca la experiencia de tres décadas del autor y se centrará en algunos PSRBCT, haciendo hincapié en la experiencia personal y la revisión de la literatura.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en los estudios con participantes humanos se ajustaron a las normas éticas del comité de investigación institucional y/o nacional y a la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o normas éticas comparables. El estudio de microscopía electrónica forma parte de la rutina habitual de investigación microscópica de las muestras recibidas con fines diagnósticos y no requiere la aprobación del Comité de Bioética. Este estudio es retrospectivo y respeta el completo anonimato de las muestras.

1. Protocolo TEM para la recuperación de FFPE (fijado en formol e integrado en parafina) y muestras de tejido fijadas en glutaraldehído

1. Recupere los últimos portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina y el bloque de tejido FFPE.
2. Con un marcador permanente, seleccione el área de interés en el portaobjetos de tejido y hágala coincidir con el área del bloque de tejido.
3. Recorta el área seleccionada con una nueva cuchilla de afeitar del bloque y córtala con precisión en cubos de 5 mm sobre papel de filtro.
4. Coloque el papel de filtro con el pañuelo recuperado en una placa de Petri etiquetada. Coloque la placa de Petri en un horno a 60-70 °C durante 15 minutos, es decir, hasta que la parafina se derrita (la cera de parafina consiste en una mezcla de hidrocarburos sólidos de cadena lineal con un punto de fusión de 48 °C-66 °C (120 a 150 °F)) y sea absorbida por el papel de filtro.
5. Transfiera el tejido recuperado libre de parafina a un vial de centelleo lleno de 4 mL de 100% de tolueno (metilbenceno) v/v [100% de tolueno significa 100 mL de tolueno]. Asegúrese de que las muestras roten continuamente a través del proceso de desparafinación (Velocidad de rotación: 24 rotaciones/min).
6. Realice dos cambios de tolueno, de 1 h cada uno, y un cambio de 4 mL de tolueno al 100% de 30 min cada uno, utilizando un dispositivo giratorio en ángulo.
7. Proceda con un cambio de 4 mL de etanol absoluto al 100% (C₂H₅OH) durante 1 h, y luego dos cambios de 4 mL de etanol absoluto al 100% durante 30 min cada uno. Luego, otro cambio de 30 min en 4 mL de etanol al 70%.
8. Proceda con un cambio de 4 mL de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, 30 min. Transfiera las muestras en 4 mL de glutaraldehído al 2,5% y manténgalas a 4 °C hasta el procesamiento.
9. Utilice los siguientes pasos en un procesador de tejidos automatizado para estandarizar el procesamiento: tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante 5 min, tetróxido de osmio al 2% durante 1 h y 50 min, dH₂O durante 5 min, etanol al 50% durante 15 min, etanol al 70% durante 30 min, etanol al 100% durante 15 min (tres veces), etanol al 100% durante 30 min (tres veces), Etanol al 100% durante 45 minutos, acetona durante 50 minutos, resina durante 1 h (dos veces) y resina fresca durante la noche. El volumen de todas las soluciones es de 15 mL.
10. Incrustar con resina fresca directamente del procesador de tejidos.
    1. Coloque las cápsulas de polietileno en un soporte con tiras de papel numeradas. Coloque resina fresca en las cápsulas, transfiera la muestra a los bloques apropiados y manténgalos durante la noche en un horno a 60 °C (140 °F).
11. Teñir las secciones semifinas (500 nm) con azul de toluidina al 1% en la placa calefactora, ajustar el calor mínimo durante 30 s, enjuagar en dH₂O y luego colocar un cubreobjetos.
12. En este caso, el micrótomo Ultracut (UCM) se utiliza para seccionar secciones semifinas.
    1. Tome el bloque incrustado de resina e instálelo en el soporte de bloques del UCM. A continuación, instale el soporte del bloque en la platina del UCM y apriételo.
    2. Corta el exceso de resina alrededor de la muestra con una cuchilla de afeitar recubierta de un solo borde con los oculares. Corta la cara del bloque en forma trapezoidal.
    3. Retire el soporte del bloque de la platina e instálelo en el brazo UCM, apretado. A continuación, instale el portacuchillas en la etapa UCM. Finalmente, apriete un cuchillo de vidrio en el soporte de la hoja.
    4. Con los oculares y la luz que proporciona el UCM, deslice el filo del cuchillo de vidrio lentamente, lo más cerca posible, de la superficie del bloque de resina a cortar. Apriete el soporte de la cuchilla en su lugar en el escenario.
    5. Establezca el grosor de corte del UCM en 500 nm y recorte el bloque de resina hasta que el 75% esté completo.
    6. Cambia el cuchillo de vidrio por uno nuevo. Agregue agua estéril al depósito del cuchillo de vidrio.
    7. Etiquete un portaobjetos de microscopio con el número de caja y coloque cuatro gotas separadas de agua estéril en el portaobjetos de vidrio.
    8. Todavía en la configuración de 500 nm, corte cuatro secciones del bloque. Con pinzas finas, transfiera 1 sección a la vez en una de las gotas de agua en el portaobjetos de vidrio. Cada gota en la diapositiva contendrá una sección. Seque el portaobjetos en una placa caliente a la temperatura más baja hasta que se seque (30 s).
13. Teñir con el método del azul de toluidina. Enjuague con agua y coloque un cubreobjetos. Examine las secciones de azul de toluidina con un microscopio óptico. Si las estructuras de tejido deseadas son visibles, corte secciones ultrafinas. Si las estructuras de tejido deseadas no son visibles, corte secciones más profundas y tíñalas usando los mismos pasos hasta que las estructuras deseadas queden expuestas y se muestren en el portaobjetos de azul de toluidina.
14. Cuando se identifique el área deseada para la microscopía electrónica a partir de las secciones de azul de toluidina, corte las secciones ultradelgadas en las rejillas de cobre. Cortar rodajas ultrafinas con un ultramicrótomo (las muestras destinadas a la visualización en el TEM deben cortarse en rodajas muy finas (80 nm)).
    1. Tome el bloque incrustado de resina e instálelo en el soporte de bloques del UCM. A continuación, instale el soporte del bloque en la platina del UCM y apriételo.
    2. Con los oculares, corte la resina alrededor del área deseada para la microscopía electrónica con una hoja de afeitar recubierta de un solo filo. Corta la cara del bloque en forma de trapecio, no más grande de 1 mm cuadrado. Si el área deseada para la microscopía electrónica es difícil de ver debido al resplandor de la luz, use un poco de cloroformo para resaltar las estructuras en el bloque de resina.
    3. Retire el soporte del bloque de la platina e instálelo en el brazo UCM, apretado. A continuación, instale el portacuchillas en la etapa UCM. Finalmente, apriete un cuchillo de diamante en el soporte de la hoja.
    4. Utilizando los oculares y la luz proporcionada por el UCM, deslice el filo del cuchillo de diamante lentamente, lo más cerca posible, de la superficie del bloque de resina a cortar. Apriete el soporte de la cuchilla en su lugar en el escenario.
    5. Ajuste los diferentes ángulos del cuchillo de diamante con los tornillos del UCM. Asegúrese de que el filo del cuchillo de diamante esté alineado lo más perfectamente posible con la superficie del bloque a cortar. Llene el depósito del cuchillo de diamante con agua estéril.
    6. Ajuste el UCM a 80 nm de grosor y velocidad de 1 mm/s. En este caso, la función automatizada se utiliza para el corte ultrafino. Establezca la ventana de corte en el UCM (parte superior e inferior de la cara del bloque).
    7. Presione el botón Inicio del UCM para comenzar a seccionar. Las secciones flotarán en el depósito estéril del cuchillo de diamante.
    8. Cuando se corten suficientes secciones, use vapores de cloroformo para enderezar las secciones. Sumerge un bastoncillo de algodón en cloroformo y pásalo por encima de las secciones sin tocarlas.
15. Sumerja una rejilla de cobre en alcohol al 100% y luego agua estéril con pinzas finas. Limpie cada rejilla antes de usarla. Elija las secciones en algunas cuadrículas.
16. Deje las cuadrículas con secciones en papel de filtro etiquetado. Coloque este papel de filtro en una placa de Petri y póngalo en el horno a 60 °C durante 30 min para permitir que las secciones se sequen en las rejillas.
17. A continuación, realice la tinción de contraste.
    1. Teñir las rejillas con acetato de uranilo o cualquier sustituto alternativo respetuoso con el medio ambiente durante 1 min. Luego, enjuáguelos en agua estéril para inyección (40 inmersiones en cuatro recipientes de agua diferentes para cada enjuague después del acetato de uranilo y el citrato de plomo). El paso del citrato de plomo también es de 1 min.
18. Inserte la rejilla en el TEM, permitiendo que un haz de electrones de alto voltaje sea emitido por un cátodo y creado por lentes magnéticas. El haz que se ha transmitido parcialmente a través de la muestra delgada (semitransparente electrónicamente) forma la información TEM en la pantalla (ver más abajo).

2. Protocolo TEM para escanear y fotografiar los especímenes

1. Después de teñir las secciones de las rejillas, examínelas con el microscopio electrónico. En el microscopio electrónico, encienda el voltaje ACC a un ajuste preestablecido (200-300 kV), que depende del microscopio electrónico utilizado.
2. En la computadora, encienda el software de la cámara digital e ingrese el número de caso. Esto es importante porque las microfotografías se guardan en el expediente correspondiente.
3. Cargue la rejilla en el microscopio electrónico, extraiga la muestra de la pistola hasta la mitad y gire el interruptor a AIR para permitir que el vacío de la cámara de la pistola de muestras se llene con aire ambiente (ambiente).
4. Una vez que esté lleno de aire, saca la muestra de la pistola. Coloque la muestra de la pistola en el soporte diseñado. Luego, abra el soporte de rejilla en la punta de la pistola.
5. Coloque la rejilla en su lugar. Cierre el soporte de rejilla y asegúrese de que la rejilla esté asegurada.
6. Vuelva a colocar la muestra de pistola en la cámara de muestras a mitad de camino y accione el interruptor a EVAC para crear un vacío en la cámara de muestras.
7. El indicador de luz verde se encenderá cuando se alcance el vacío en la cámara de muestras. Luego, empuje la muestra de pistola con cuidado en la columna del microscopio electrónico y asegúrese de no permitir que vaya demasiado rápido. De lo contrario, dañaría el objeto en la punta de la muestra del arma.
8. Una vez que la rejilla esté bien colocada en la columna del microscopio electrónico, encienda el filamento a la configuración de saturación intermedia (preestablecida).
9. Encienda la cámara a través del interruptor ON/OFF . En la computadora, haga clic en Imagen en vivo en el software de imágenes.
10. En el microscopio electrónico, presione el botón de aumento bajo y abra la apertura del objetivo. Esto permite elegir el área de cribado deseada. A continuación, coloque el área deseada de la sección en el centro de la pantalla de la computadora, usando los dos controladores a cada lado de la columna del microscopio electrónico.
11. En el microscopio electrónico, presione el botón Zoom y cierre la apertura del objetivo para obtener un mejor contraste.
12. Comience la proyección de la sección tomando microfotografías con un aumento de 2.500x. A continuación, ajuste el enfoque con el botón de bamboleo y el botón de brillo del microscopio electrónico para garantizar la calidad de la microfotografía.
13. Haga clic en Imagen final en la computadora para tomar la microfotografía. Si los colores no son uniformes, realice una corrección de fondo en el software de la cámara. Además, ajuste el contraste en la imagen final usando el software antes de guardar la microfotografía.
14. Cuando se guarde la microfotografía, verifique dos veces el número de caja y el aumento para garantizar la identificación adecuada de las microfotografías tomadas.
    NOTA: En algunos casos, el usuario también puede ingresar subtítulos adicionales y también se ingresan las iniciales del tecnólogo de microscopía electrónica.
15. Realizar el proceso de micrografía a través de toda el área de la sección a cribar. Después de un aumento suficiente de 2.500x, las microfotografías se guardan para cubrir el área de interés, capturar microfotografías de 4.000x y 8.000x de aumento y guardarlas en la computadora con la identificación del número de caso apropiado.
16. Haga un primer plano de la sección para obtener detalles ultraestructurales específicos si se dan instrucciones de detección muy específicas. A continuación, guarde las mediciones de detalles ultraestructurales específicos en el ordenador considerando aumentos más altos si es necesario.
17. Cuando se complete el cribado de la muestra, apague el filamento, la cámara, el alto voltaje y el software de la cámara en secuencia. A continuación, retire la rejilla de la columna del microscopio electrónico, permitiendo la entrada de aire en la cámara de muestras de la pistola.
18. Lima la rejilla en una cápsula de gelatina y guarda la cápsula en una caja debidamente etiquetada, junto con los bloques de resina de la misma caja. Vuelva a colocar la muestra de la pistola en la recámara de la pistola y guárdela en un ambiente fresco y seco para preservar el material utilizado.
19. Transfiera las microfotografías digitales a plataformas colaborativas comunes (por ejemplo, SharePoint) o servidores internos para permitir que el patólogo las vea.
20. Introduzca las unidades de trabajo en el Sistema de Información de Laboratorio (LIS).
21. Si se requieren microfotografías más específicas, extraiga la cuadrícula de campo y reutilícelas para una proyección adicional o preguntas específicas.

Resultados

Aquí se muestran las características distintivas de TEM del neuroblastoma. Aquí ilustraremos las características distintivas de la TEM del neuroblastoma.

El neuroblastoma es una de las neoplasias malignas sólidas más comunes en la infancia y la niñez. Las células del neuroblastoma son las células malignas de este tumor sólido que surgen insidiosamente a partir de derivados de la cresta neural primordial. Esta histogénesis explica algunas caracterís...

Discusión

En esta revisión narrativa con protocolo asociado, destacamos las características ultraestructurales distintivas del neuroblastoma. Al final, sugerimos que la microscopía electrónica está lejos de ser una técnica "muerta" o antigua, postulando el descubrimiento de un nuevo papel si se combina con tecnologías ómicas unicelulares. Esta contribución quiere destacar el papel nunca antiguo de la microscopía electrónica en la patología pediátrica ^4,27<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	10014	Reagent as established by the American Chemical Society (ACS Reagent).
Automated tissue processor	Electron Microscopy Sciences	L12600	LYNX II Automated Tissue Processor for Histology and Microscopy.
Digital camera software	Gatan	L12600	Digital Micrograph
Spurr's resin	Electron Microscopy Sciences	14300	Embedding resin. It provides excellent penetration for embedding tissues and rapid infiltration. The blocks have excellent trimming and sectioning qualities, while thin sections reveal tough qualities under the electron beam.
Ethyl Alcohol	Electron Microscopy Sciences	15058	100% Ethyl alcohol with molecular sieve, 50% and 70%.
Glutaraldehyde, 25% EM Grade Aqueous in Serum Vial	Electron Microscopy Sciences	16214	2.5% gluteraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2-7.4 made from 25% gluteraldehyde, primary fixative for TEM tissue specimens.
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19110	Second fixative during TEM tissue processing used as OsO4 in distilled water
Polyethylene capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	Flat Bottom Embedding Capsules, Size 00
Scintillator	Electron Microscopy Sciences	82010	Phillip Quad Detector
Single Edge Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71952-10	Blade for Clean Rm., 10/Disp. .
Sodium Cacodylate Buffer	Electron Microscopy Sciences	11655	Sodium Cacodylate Buffer, 0.4M, pH 7.2, prepared from Sodium Cacodylate Trihydrate
Tannic Acid, Reagent, A.C.S., EM Grade	Electron Microscopy Sciences	21700	Reagent as established by the American Chemical Society (ACS Reagent).
Transmission Electron Microscope (1)	Hitachi	Hitachi 7100	We use it at the HV 75 setting
Transmission Electron Microscope (2)	JEOL	JEM-1010	We use it at the HV 38 setting
Toluene	Electron Microscopy Sciences	22030	Reagent as established by the American Chemical Society (ACS Reagent)
Ultracut microtome	Leica	11865766	Ultramicrotome
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Uranyless, substitute for uranyl acetate