Просвечивающая электронная микроскопия: инструмент хирургической патологии при нейробластоме

Резюме

Небольшие круглые синеклеточные опухоли у детей представляют собой интригующую и сложную коллекцию новообразований. Поэтому просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и профессиональные знания об опухолях у детей могут быть чрезвычайно ценными в хирургической патологии. Здесь мы представляем протокол проведения ПЭМ для диагностики нейробластомы, одной из наиболее распространенных солидных опухолей в детском возрасте.

Аннотация

Малые круглые синеклеточные опухоли у детей (PSRBCT) представляют собой интригующую и сложную коллекцию новообразований. Световая микроскопия небольших круглых опухолей голубых клеток выявляет маленькие круглые клетки. Они содержат в целом гиперхроматическое ядро и относительно скудную базофильную цитоплазму. Детские небольшие круглые синеклеточные опухоли включают в себя несколько образований. Обычно они включают опухоль Вильмса, нейробластому, рабдомиосаркому, саркому Юинга, ретинобластому, лимфому и мелкоклеточную остеосаркому, среди прочих. Даже с помощью иммуногистохимии дифференциальный диагноз этих новообразований может быть спорным при световой микроскопии. Слабое окрашивание или неоднозначный фон могут отпугнуть патологоанатомов от принятия правильного диагностического решения. Кроме того, молекулярная биология может предоставить огромное количество данных, которые трудно различить, а некоторые транслокации могут быть замечены более чем в одной категории. Таким образом, просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) может быть чрезвычайно ценной. Здесь мы делаем акцент на современном протоколе обработки данных ПЭМ нейробластомы. Опухолевые клетки с клубками цитоплазматических отростков, содержащими нейросекреторные гранулы, могут диагностировать нейробластому.

Введение

Работа патологоанатома может быть довольно сложной как в клинической диагностике, так и в исследовательской сфере. Эволюция световой микроскопии в^18-м и^19-м веках была замечательной. Мощность электронного микроскопа опирается в первую очередь на длину волны электронов, которая короче светового ^1,2,3. До появления поликлональных и моноклональных антител и их применения в иммуногистохимии ПЭМ играл важную роль в диагностике небольших круглых синеклеточных опухолей.

Начиная с 90-х годов прошлого века, иммуногистохимический подход заменил морфологический инструмент в диагностике⁴. В настоящее время существуют тысячи новых поликлональных и моноклональных антител, направленных на антигены небольшой круглой синеклеточной опухоли группы 4,6,7,8. В последнее десятилетие очень плодотворного^20-го века и в первом десятилетии начала^21-го века молекулярная биология, включая флуоресцентную гибридизацию in situ, от геномных зондов до секвенирования следующего поколения, по-видимому, вытеснила значительную прикладную роль иммуногистохимии в нескольких лабораториях. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в Соединенных Штатах Америки, Канадское агентство по контролю за продуктами питания (CFIA) в Канаде, Агентство по охране окружающей среды (EPA) или аналогичные правительственные органы в других странах не всегда одобряют протоколы молекулярной биологии⁹. Кажется, что существует много информации, которую довольно сложно вставить в отчет о патологии, которая может быть использована в терапевтических целях, и выбор хорошо финансируемой и функционирующей лабораторной информационной^{системы имеет решающее} значение. В то же время иммуногистохимия выявила многочисленные подводные камни: эпителиальные опухоли демонстрируют мезенхимальные маркеры и наоборот¹¹. Эпителиально-мезенхимальный переход спутал некоторые границы в группах патологии^12,13. В последние несколько лет стало очевидным, что электронная микроскопия процветает в нескольких лабораториях^{по всему} миру. В частности, время обработки образцов тканей сократилось с недель до всего лишь 3 дней и даже меньше при использовании нескольких протоколов, приближающихся к окрашиванию моноклональными или поликлональными антителами ^4,10.

Кроме того, применение электронной камеры, соединенной с электронным микроскопом, помогло патологоанатомам получить быстрое изображение, которое является универсальным в различных операционных системах. Наконец, некоторые антитела, даже после забора антигена, трудно выявить в некоторых областях некроза или изменений, связанных с аутофагией/ишемией. В то же время электронная микроскопия в надежных руках все еще может дать отличные результаты и подсказки для правильной классификации неизвестных патологических^{опухолей.}

Педиатрическая группа малых круглых синеклеточных опухолей включает в себя несколько опухолей, в основном нейробластому, опухоль Вильмса или нефробластому, рабдомиосаркому и саркому Юинга. Данные молекулярной биологии относительно педиатрической группы небольших круглых опухолей голубых клеток могут быть ошеломляющими из-за применяемых методов. Маленькие круглые голубые клетки могут не сильно отличаться при обычном окрашивании (окрашивание гематоксилином и эозином), а некоторые опухоли могут иметь аберрантные иммунофенотипические признаки. С момента открытия ПЭМ в молекулярной биологии были достигнуты огромные успехи. В группе небольших круглых синеклеточных опухолей некоторые новообразования могут встречаться чаще, чем другие, но их необходимо учитывать. Несмотря на то, что папиллярная почечно-клеточная карцинома по существу не является небольшой круглой синеклеточной опухолью, а в основном имеет сосочки, она может иметь некоторые круглые клеточные участки, которые, возможно, необходимо отличать от других хорошо известных небольших круглых синеклеточных опухолей (например, опухоли Вильмса) с использованием нескольких^{вспомогательных методов.} В конечном счете, метанефрические стромальные опухоли также могут нуждаться в дифференциальной диагностике¹⁷. Рабдоидная опухоль является особенно злокачественной опухолью у детей, относящейся к почечному и внепочечному подтипу¹⁸.

Нейробластома является одним из наиболее распространенных солидных злокачественных новообразований в младенчестве и детстве. Клетки нейробластомы – это злокачественные клетки этой солидной опухоли, которые коварно возникают из производных первичного нервного гребня. Его диагностика и дифференциальная диагностика могут быть затруднены. Его естественная биология претерпела замечательный прогресс за последние пару десятилетий. Семейство транскрипционных факторов forkhead характеризуется отчетливым доменом «forkhead» (FOXO3/FKHRL1). Эти факторы транскрипции функционируют как триггер апоптоза (запрограммированной гибели клеток) за счет экспрессии генов, необходимых для клеточной гибели. FOXO3/FKHRL1 активируется 5-аза-2-дезоксицитидином и индуцирует молчаливую каспазу-8, и этот комплекс играет решающую роль в развитии нейробластомы. Ядерный FOXO3 предсказывает неблагоприятные клинические исходы и способствует ангиогенезу опухоли при нейробластоме ^7,19. Несмотря на достижения в области молекулярной патологии, классификация Шимада остается стандартом практики для любого патологоанатома и детского онколога. Это имеет решающее значение для дифференциации между благоприятной и неблагоприятной гистологией 20,21,22,23.

Обоснование разработки простого протокола для электронной микроскопии опухолей с подозрением на нейробластому связано с целесообразностью и обоснованностью ультраструктурного исследования образца ткани. Он редко изменяется из-за проблем, обычно возникающих при использовании иммуногистохимии. Обоснование и протокол были положены в основу нескольких учебников и научных статей по детской патологии и электронной микроскопии ^4,24,25. Этот протокол охватывает опыт трех десятилетий работы автора и будет сосредоточен на нескольких PSRBCT, уделяя особое внимание личному опыту и обзору литературы.

протокол

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствовали этическим нормам институционального и/или национального исследовательского комитета, а также Хельсинкской декларации 1964 года и более поздним поправкам к ней или сопоставимым этическим стандартам. Исследование методом электронной микроскопии является частью обычной процедуры микроскопического исследования образцов, полученных в диагностических целях, и не требует одобрения Комитета по биоэтике. Данное исследование является ретроспективным и соблюдает полную анонимность образцов.

1. Протокол ПЭМ для забора FFPE (фиксированных формалином и парафином) и образцов тканей, фиксированных глутаральдегидом

1. Извлеките последние препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, и тканевый блок FFPE.
2. С помощью перманентного маркера выберите интересующую область на предметном стекле и сопоставьте ее с областью на тканевом блоке.
3. Вырежьте выбранный участок новым лезвием бритвы из блока и аккуратно нарежьте его на кубики по 5 мм на фильтровальной бумаге.
4. Поместите фильтровальную бумагу с извлеченной салфеткой в чашку Петри с этикеткой. Поместите чашку Петри в духовку при температуре 60-70 °C на 15 минут, т.е. пока парафин не расплавится (парафин состоит из смеси твердых углеводородов с прямой цепью в температуре плавления 48-66 °C (от 120 до 150 °F)) и не впитается фильтровальной бумагой.
5. Переложите извлеченную ткань без парафина в сцинтилляционный флакон, наполненный 4 мл 100% толуола (метилбензола) v/v [100% толуол означает 100 мл толуола]. Убедитесь, что образцы непрерывно вращаются в процессе депарафинизации (скорость вращения: 24 оборота/мин).
6. Пройдите через две замены толуола, по 1 часу каждая, и одну замену 4 мл 100% толуола по 30 минут каждая, используя вращающееся устройство под углом.
7. Проведите через одну замену 4 мл 100% абсолютного этанола (C₂H₅OH) в течение 1 ч, а затем две замены 4 мл 100% абсолютного этанола в течение 30 мин каждая. Затем еще одна смена 30 мин в 4 мл 70% этанола.
8. Проведите через одну замену 4 мл 0,1 М буфера какодилата натрия в течение 30 минут. Перенесите образцы в 4 мл 2,5% глутаральдегида и держите при 4 °C до обработки.
9. Используйте следующие шаги в автоматизированном тканевом процессоре для стандартизации обработки: 0,1 М буфер какодилата натрия в течение 5 мин, 2% тетраоксид осмия в течение 1 ч и 50 мин, dH₂O в течение 5 мин, 50% этанол в течение 15 мин, 70% этанол в течение 30 мин, 100% этанол в течение 15 мин (три раза), 100% этанол в течение 30 мин (три раза), 100% этанол в течение 45 минут, ацетон в течение 50 минут, смола в течение 1 часа (два раза) и свежая смола в течение ночи. Объем всех растворов составляет 15 мл.
10. Залейте свежей смолой прямо из тканевого процессора.
    1. Поместите полиэтиленовые капсулы в держатель с пронумерованными полосками бумаги. Капните в капсулы свежую смолу, переложите образец в соответствующие блоки и оставьте блоки на ночь в духовке при температуре 60 °C (140 °F).
11. Полутонкие (500 нм) срезы окрасить 1% толуидинового синего на конфорку, минимальный нагрев в течение 30 с, прополоскать при dH₂O, а затем установить покровную крышку.
12. Здесь микротом Ultracut (UCM) используется для резки полутонких секций.
    1. Возьмите закладной блок из смолы и установите его в держатель блока UCM. Затем установите держатель блока на столик UCM и затяните его.
    2. Разрежьте излишки смолы вокруг образца с помощью лезвия бритвы с однолезвием с помощью окуляра. Вырежьте лицевую сторону блока в форме трапеции.
    3. Снимите держатель блока со сцены и установите его в кронштейн UCM, плотно затянув. Далее установите держатель лезвия на столик UCM. Наконец, затяните стеклянный нож на держателе лезвия.
    4. Используя окуляры и свет, обеспечиваемый UCM, медленно, как можно ближе подведите край стеклянного ножа к поверхности смоляного блока, который нужно разрезать. Затяните держатель лезвия на месте на сцене.
    5. Установите толщину резки UCM на 500 нм и обрежьте смоляной блок до 75% по всей поверхности.
    6. Поменяйте стеклянный нож на новый. Добавьте стерильную воду в резервуар для стеклянного ножа.
    7. Нанесите на предметное стекло микроскопа маркировку с номером случая и капните на предметное стекло четыре отдельные капли стерильной воды.
    8. Еще при настройке 500 нм вырезаем четыре секции из блока. С помощью тонких щипцов переведите по 1 секции за раз в одну из капель воды на предметное стекло. Каждая капля на слайде будет содержать одну секцию. Сушите предметное стекло на горячей плите при самом низком нагреве до полного высыхания (30 с).
13. Окрашиваем методом Толуидина синего. Промойте в воде и накройте крышкой. Рассмотрите срезы толуидинового синего под световым микроскопом. Если видны нужные тканевые структуры, разрежьте ультратонкие срезы. Если желаемые тканевые структуры не видны, вырежьте более глубокие срезы и окрашивайте их, используя те же шаги, пока желаемые структуры не обнажаются и не будут показаны на синем предметном стекле толуидина.
14. Когда из толуидинового синего среза будет определена нужная область для электронной микроскопии, вырежьте ультратонкие срезы на медных сетках. Ультратонкие ломтики нарезать с помощью ультрамикротома (образцы, предназначенные для просмотра в ПЭМ, должны быть нарезаны очень тонкими ломтиками (80 нм)).
    1. Возьмите закладной блок из смолы и установите его в держатель блока UCM. Затем установите держатель блока на столик UCM и затяните его.
    2. С помощью окуляра разрежьте смолу вокруг нужной области для электронной микроскопии с помощью лезвия бритвы с однолезвийным покрытием. Разрежьте лицевую сторону блока в форме трапеции, размером не более 1 мм квадрата. Если желаемую область для электронной микроскопии трудно увидеть из-за яркого света, используйте каплю хлороформа, чтобы выделить структуры в блоке смолы.
    3. Снимите держатель блока со сцены и установите его в кронштейн UCM, плотно затянув. Далее установите держатель лезвия на столик UCM. Наконец, затяните алмазный нож на держателе лезвия.
    4. Используя окуляры и свет, обеспечиваемый UCM, медленно, как можно ближе сдвиньте край алмазного ножа к поверхности смоляного блока, который нужно резать. Затяните держатель лезвия на месте на сцене.
    5. Отрегулируйте различные углы наклона алмазного ножа с помощью винтов UCM. Следите за тем, чтобы край алмазного ножа был максимально точно выровнен с поверхностью разрезаемого блока. Наполните резервуар алмазного ножа стерильной водой.
    6. Установите UCM на толщину 80 нм и скорость 1 мм/с. Здесь для ультратонкой резки используется автоматизированная функция. Установите окно резки на UCM (верх и низ грани блока).
    7. Нажмите кнопку «Пуск » на UCM, чтобы начать секционирование. Секции будут плавать на стерильном резервуаре алмазного ножа.
    8. Когда будет срезано достаточное количество секций, используйте пары хлороформа, чтобы выпрямить срезы. Обмакните ватный тампон в хлороформ и проведите им над срезами, не касаясь их.
15. Опустите медную сетку в 100% спирт, а затем в стерильную воду с помощью тонких щипцов. Очистите каждую решетку перед использованием. Выделите секции на нескольких сетках.
16. Оставьте сетки с секциями на маркированной фильтровальной бумаге. Поместите эту фильтровальную бумагу в чашку Петри и поставьте в духовку при температуре 60 °C на 30 минут, чтобы секции высохли на решетках.
17. Затем выполните контрастное окрашивание.
    1. Окрасить решетки в уранилацетат или любой экологически чистый заменитель на 1 мин. Затем промойте их в стерильной воде для инъекций (40 погружений в четыре разные емкости с водой для каждого полоскания после уранилацетата и цитрата свинца). Шаг цитрата свинца также составляет 1 мин.
18. Вставьте решетку в ПЭМ, позволив высоковольтному электронному пучку излучаться катодом и создаваться магнитными линзами. Луч, частично прошедший через тонкий (электронно-полупрозрачный) образец, формирует на экране ПЭМ-информацию (см. ниже).

2. Протокол ПЭМ для сканирования и фотографирования образцов

1. После того, как срезы на сетках будут окрашены, просвечивайте их с помощью электронного микроскопа. На электронном микроскопе включите напряжение ACC до заранее установленного значения (200-300 кВ), которое зависит от используемого электронного микроскопа.
2. На компьютере включите программное обеспечение цифровой камеры и введите номер корпуса. Это важно, потому что микрофотографии сохраняются в соответствующем файле дела.
3. Загрузите сетку в электронный микроскоп, вытяните образец пистолета наполовину и переключите переключатель в положение ВОЗДУХ , чтобы вакуум из камеры пистолета заполнился окружающим (комнатным) воздухом.
4. Как только он наполнится воздухом, вытащите образец пистолета. Поместите образец пистолета на предназначенный для этого держатель. Затем откройте держатель сетки на кончике пистолета.
5. Установите сетку на место. Закройте держатель решетки и убедитесь, что решетка надежно закреплена.
6. Поместите образец пистолета обратно в камеру для образцов на полпути и переключите переключатель в положение EVAC , чтобы создать вакуум в камере для образцов.
7. Зеленый световой индикатор загорится, когда в камере для образцов будет достигнут вакуум. Затем осторожно вставьте образец пистолета в колонку электронного микроскопа и убедитесь, что он не движется слишком быстро. В противном случае он мог бы повредить объект на кончике образца оружия.
8. Как только сетка прочно встанет на место в колонке электронного микроскопа, включите нить накала на промежуточную (заранее установленную) настройку насыщения.
9. Включите камеру с помощью переключателя ВКЛ/ВЫКЛ. На компьютере нажмите « Изображение в реальном времени » в программном обеспечении для обработки изображений.
10. На электронном микроскопе нажмите кнопку «Малое увеличение » и откройте диафрагму объектива. Это позволяет выбрать желаемую зону грохочения. Затем расположите нужную область сечения в центре экрана компьютера, используя два контроллера по обе стороны от колонны электронного микроскопа.
11. На электронном микроскопе нажмите кнопку «Зум» и закройте диафрагму объектива, чтобы получить лучший контраст.
12. Начните просмотр разреза с микрофотографий с увеличением 2500x. Затем отрегулируйте фокусировку с помощью кнопки воблера и кнопки яркости на электронном микроскопе, чтобы обеспечить качество микрофотографии.
13. Нажмите на кнопку «Итоговое изображение» на компьютере, чтобы сделать микроснимок. Если цвета неровные, выполните коррекцию фона в программном обеспечении камеры. Кроме того, отрегулируйте контраст на конечном изображении с помощью программного обеспечения перед сохранением микрофотографии.
14. Когда микрофотография сохраняется, дважды проверьте номер корпуса и увеличение, чтобы обеспечить надлежащую идентификацию сделанных микрофотографий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях пользователь также может ввести дополнительные подписи, а также ввести инициалы технолога электронной микроскопии.
15. Выполните процесс микрофотографирования по всей площади исследуемого среза. После достаточного 2500-кратного увеличения микрофотографии сохраняются, чтобы охватить интересующую область, захватить микрофотографии с 4000-кратным и 8000-кратным увеличением и сохранить их на компьютере с соответствующей идентификацией по номеру дела.
16. Сделайте крупный план раздела для конкретных ультраструктурных деталей, если даны очень конкретные инструкции по скринингу. Затем сохраните измерения конкретных ультраструктурных деталей в компьютере с учетом большего увеличения, если это необходимо.
17. Когда просеивание образцов будет завершено, последовательно выключите нить накала, камеру, высокое напряжение и программное обеспечение камеры. Далее снимите сетку с колонки электронного микроскопа, пропустив воздух в камеру для образца пистолета.
18. Поместите сетку в желатиновую капсулу и храните капсулу в коробке с соответствующей маркировкой вместе с блоками смолы в том же футляре. Поместите образец оружия обратно в патронник пистолета и храните его в прохладном и сухом месте, чтобы сохранить используемый материал.
19. Передавайте цифровые микрофотографии на общие платформы для совместной работы (например, SharePoint) или внутренние серверы, чтобы патологоанатом мог их просмотреть.
20. Введите рабочие единицы в информационную систему лаборатории (ЛИС).
21. Если требуются более конкретные микрофотографии, вытащите сетку полей и повторно используйте их для дополнительного скрининга или конкретных вопросов.

Результаты

Здесь представлены отличительные особенности нейробластомы в ПЭМ. Здесь мы проиллюстрируем отличительные особенности нейробластомы в ПЭМ.

Нейробластома является одним из наиболее распространенных солидных злокачественных новообразований в младен?...

Обсуждение

В этом повествовательном обзоре с соответствующим протоколом мы выделили отличительные ультраструктурные особенности нейробластомы. В конце концов, мы предполагаем, что электронная микроскопия далеко не «мертвая» или древняя техника, постулирующая открытие новой ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	10014	Reagent as established by the American Chemical Society (ACS Reagent).
Automated tissue processor	Electron Microscopy Sciences	L12600	LYNX II Automated Tissue Processor for Histology and Microscopy.
Digital camera software	Gatan	L12600	Digital Micrograph
Spurr's resin	Electron Microscopy Sciences	14300	Embedding resin. It provides excellent penetration for embedding tissues and rapid infiltration. The blocks have excellent trimming and sectioning qualities, while thin sections reveal tough qualities under the electron beam.
Ethyl Alcohol	Electron Microscopy Sciences	15058	100% Ethyl alcohol with molecular sieve, 50% and 70%.
Glutaraldehyde, 25% EM Grade Aqueous in Serum Vial	Electron Microscopy Sciences	16214	2.5% gluteraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2-7.4 made from 25% gluteraldehyde, primary fixative for TEM tissue specimens.
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19110	Second fixative during TEM tissue processing used as OsO4 in distilled water
Polyethylene capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	Flat Bottom Embedding Capsules, Size 00
Scintillator	Electron Microscopy Sciences	82010	Phillip Quad Detector
Single Edge Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71952-10	Blade for Clean Rm., 10/Disp. .
Sodium Cacodylate Buffer	Electron Microscopy Sciences	11655	Sodium Cacodylate Buffer, 0.4M, pH 7.2, prepared from Sodium Cacodylate Trihydrate
Tannic Acid, Reagent, A.C.S., EM Grade	Electron Microscopy Sciences	21700	Reagent as established by the American Chemical Society (ACS Reagent).
Transmission Electron Microscope (1)	Hitachi	Hitachi 7100	We use it at the HV 75 setting
Transmission Electron Microscope (2)	JEOL	JEM-1010	We use it at the HV 38 setting
Toluene	Electron Microscopy Sciences	22030	Reagent as established by the American Chemical Society (ACS Reagent)
Ultracut microtome	Leica	11865766	Ultramicrotome
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Uranyless, substitute for uranyl acetate