Síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de ADN lineal

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la preparación y calibración tampón de extractos celulares de cepas knockout de exonucleasa V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD y ΔrecB). Este es un enfoque rápido, fácil y directo para la expresión en sistemas de síntesis de proteínas libres de células utilizando plantillas de ADN lineal.

Resumen

La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se ha vuelto recientemente muy popular en el campo de la biología sintética debido a sus numerosas ventajas. El uso de plantillas de ADN lineal para CFPS permitirá que la tecnología alcance su máximo potencial, disminuyendo el tiempo experimental al eliminar los pasos de clonación, transformación y extracción de plásmidos. El ADN lineal puede ser rápida y fácilmente amplificado por PCR para obtener altas concentraciones de la plantilla, evitando la posible toxicidad de la expresión in vivo. Sin embargo, los moldes lineales de ADN son degradados rápidamente por exonucleasas que están naturalmente presentes en los extractos celulares. Hay varias estrategias que se han propuesto para abordar este problema, como la adición de inhibidores de nucleasa o la modificación química de los extremos lineales del ADN para la protección. Todas estas estrategias cuestan tiempo y recursos adicionales y aún no han obtenido niveles cercanos al plásmido de expresión de proteínas. Aquí se presenta un protocolo detallado para una estrategia alternativa para usar plantillas de ADN lineal para CFPS. Mediante el uso de extractos celulares de células knockout deficientes en exonucleasa, las plantillas de ADN lineal permanecen intactas sin requerir ninguna modificación final. Presentamos los pasos de preparación del lisado celular de la cepa Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lisis de sonicación y calibración de tampón para Mg-glutamato (Mg-glu) y K-glutamato (K-glu) específicamente para ADN lineal. Este método es capaz de alcanzar niveles de expresión de proteínas comparables a los del ADN plásmido en CFPS de E. coli.

Introducción

Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se utilizan cada vez más como un método rápido, simple y eficiente para la ingeniería de biosensores, la fabricación descentralizada y la creación de prototipos de circuitos genéticos¹. Debido a su gran potencial, los sistemas CFPS se utilizan regularmente en el campo de la biología sintética. Sin embargo, hasta ahora los sistemas CFPS dependen de plásmidos circulares que pueden limitar la tecnología de alcanzar su máximo potencial. La preparación del ADN plásmido depende de muchos pasos que consumen mucho tiempo durante la clonación y de grandes cantidades de aislamiento de ADN. Por otro lado, la amplificación por PCR de un plásmido, o una plantilla de ADN sintetizado, se puede utilizar simplemente para preparar plantillas CFPS en unas pocas horas ^2,3. Por lo tanto, la aplicación de ADN lineal ofrece una solución prometedora para CFPS. Sin embargo, el ADN lineal es rápidamente degradado por exonucleasas naturalmente presentes en extractos celulares⁴. Existen soluciones que abordan este problema, como utilizar^{la proteína 5} del λ-fago GamS o el ADN que contiene los sitios Chi⁶ como agentes protectores, o proteger directamente el ADN lineal mediante la modificación química de sus extremos 2,7,8,9. Todos estos métodos requieren suplementos al extracto celular, que son costosos y requieren mucho tiempo. Se sabe desde hace mucho tiempo que el complejo exonucleasa V (RecBCD) degrada el ADN lineal en lisados celulares⁴. Recientemente, demostramos que el ADN lineal puede protegerse mucho mejor en lisados de células eliminadas para genes de exonucleasa (recBCD⁾¹⁰.

En este protocolo, se describen en detalle los pasos para la preparación de lisados libres de células de la cepa de E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lisis de sonicación. La lisis de sonicación es una técnica común y asequible empleada por varios laboratorios^11,12. Los extractos producidos a partir de esta cepa no necesitan la adición de ningún componente adicional o modificación de la plantilla de ADN para apoyar la expresión de plantillas de ADN lineal. El método se basa en el paso esencial de la optimización del tampón para extractos celulares específicamente para la expresión lineal de ADN de promotores nativos de E. coli. Se ha demostrado que esta optimización específica del tampón para la expresión lineal del ADN es la clave para que los promotores nativos de σ70 produzcan una alta producción de proteínas sin suplementos de proteína GamS o ADN Chi, incluso evitando la purificación de los productos de PCR¹⁰. Se encontró que la concentración óptima de Mg-glu para la expresión lineal de ADN era similar a la del ADN plásmido. Sin embargo, la concentración óptima de K-glu mostró una diferencia sustancial entre el ADN lineal y el plásmido, probablemente debido a un mecanismo relacionado con la transcripción¹⁰. La funcionalidad de las proteínas expresadas mediante este método se ha demostrado para varias aplicaciones, como el cribado rápido de los interruptores de punto de apoyo y la evaluación de la actividad de las variantes enzimáticas¹⁰.

Este protocolo proporciona una solución simple, eficiente y rentable para el uso de plantillas de ADN lineal en sistemas libres de células de E. coli simplemente utilizando extractos de células ΔrecBCD mutantes y calibración específica para ADN lineal como plantilla.

Protocolo

1. Preparación de medios y búferes

1. Preparación de medio 2xYT+P (sólido y líquido)
   1. Prepare medios líquidos y sólidos como se describe en la Tabla 1, y luego esterilice en autoclave.
      NOTA: Este protocolo requiere una placa de agar 2xYT+P que contenga cloranfenicol (10 μg/ml). El volumen de medios líquidos es proporcional al volumen del lisado requerido. Aquí, se utiliza un volumen inicial de 5 L de medios líquidos 2xYT+P. Sin embargo, el volumen se puede ajustar según sea necesario, sabiendo que 1 L del cultivo celular da como resultado 2 a 3 ml del lisado celular final.
2. Preparación de cloranfenicol (34 mg/ml)
   1. Pesar 0,34 g de cloranfenicol, añadir etanol a 10 ml y disolver mezclando. Alícuota 1 ml cada uno en varios tubos, y conservar a -20 °C para utilizar más tarde.
3. Preparación del tampón S30A
   1. Prepare el tampón S30A de acuerdo con la Tabla 2, apuntando a 2 L de este tampón.
      NOTA: Una vez más, el volumen de este tampón es proporcional al volumen del lisado requerido.
   2. Antes de esterilizar en autoclave, ajuste el pH del tampón a 7,7 utilizando ácido acético glacial.
   3. Autoclave el búfer.
   4. Mantener este tampón a 4 °C después del autoclave.
   5. Antes de su uso, agregue TDT (filtrado por un filtro de membrana de 0,22 μm) al tampón S30A para alcanzar una concentración final de 2 mM (2 ml de TDT de 1 M de material a 1 L de tampón S30A).
      NOTA: Una vez más, el volumen de este tampón es proporcional al volumen del lisado requerido.
4. Preparación de solución energética
   NOTA: Esta solución energética se basa en el documento¹³ de Sun et al. (concentración de stock 14x). La Tabla 3 recapitula los componentes necesarios para la preparación del stock de soluciones energéticas, con números de catálogo para todos los productos químicos utilizados en este protocolo.
   1. Preparar las soluciones madre de acuerdo con la Tabla 3 y mantenerlas en hielo.
   2. Calibrar el pH según lo solicitado para los componentes indicados, ya sea con tampón Tris 2 M (60,57 g de Tris base en un volumen de 250 mL de agua estéril) o KOH 15% (15 g de KOH en un volumen de 100 mL de agua estéril) como se indica en la Tabla 3.
   3. En un tubo de 15 ml, añadir el volumen de cada componente en el orden indicado en la Tabla 3.
   4. Alícuota la solución energética, 150 μL por tubo.
   5. Congelar rápidamente las alícuotas en hielo seco y almacenar a -80 °C.
5. Preparación de solución de aminoácidos (AA)
   NOTA: La solución de aminoácidos se prepara mediante el kit RTS Amino Acid Sampler. Cada uno de los 20 aminoácidos se proporciona en este kit como un volumen de 1,5 ml a 168 mM, excepto la leucina que está a 140 mM. Aquí, la solución madre preparada se concentra 4 veces, en lugar de la solución de trabajo requerida. La concentración final de la solución de aminoácidos es de 6 mM para todos los aminoácidos, excepto la leucina, que está en 5 mM.
   1. Descongele los tubos de 20 aminoácidos mediante vórtice e incube a 37 °C hasta que se disuelvan por completo.
      NOTA: Cys no puede disolverse completamente.
   2. En un tubo de 50 mL, agregar 12 mL de agua estéril y 1.5 mL de cada uno de los aminoácidos en el orden indicado en la Tabla 4.
   3. Vortex hasta que la solución esté bastante clara, incubando a 37 °C si es necesario.
      NOTA: Cys no puede disolverse completamente.
   4. Alícuota 500 μL de la solución de aminoácidos por tubo sobre hielo.
   5. Congelar rápidamente las alícuotas en hielo seco y almacenar a -80 °C.
6. Preparación de soluciones para la calibración de tampones
   1. Preparar la solución madre para Mg-glu (100 mM) y K-glu (3 M) como se indica en la tabla 5. Haga una dilución en serie (en volumen de 1 ml) a partir de estos aceites para Mg-glu (0 a 20 mM) y K-glu (20 a 300 mM) como se indica en el Archivo suplementario 1 para los pasos de calibración.
      NOTA: Estas concentraciones madre son para el paso de calibración y es posible que deba cambiarse al configurar el experimento final. Las concentraciones más altas de las cepas analizadas para este protocolo son 1 M y 4,5 M para Mg-glu y K-glu, respectivamente.
7. Preparación del stock de soluciones PEG8000
   1. Preparar 50 ml de solución de PEG8000 al 40% (20 g de PEG8000 en un volumen de 50 ml de agua estéril).

2. Cultivo celular y preparación de lisado (experimento de 4 días)

1. Día 1
   1. Raya BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tabla 6) de -80 °C de glicerol en una placa de agar 2xYT+P que contiene 10 μg/ml de cloranfenicol. Alternativamente, también se puede utilizar BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tabla 6)¹⁰.
   2. Incubar durante la noche a 37 °C.
2. Día 2
   1. Inocular una sola colonia de la placa de agar anterior en 10 ml de 2xYT+P suplementado con 10 μg/ml de cloranfenicol.
   2. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm.
3. Día 3
   1. Haga un subcultivo diluyendo el cultivo durante la noche 100 veces en 4 L de medios frescos 2xYT+P que contengan 10 μg/ml de cloranfenicol.
      NOTA: Por ejemplo, se agregan 40 ml del cultivo nocturno en 3960 ml de medios frescos. Después de la dilución, el medio de 4 L se divide en 4 matraces (volumen de 5 L) de tal manera que cada matraz contiene 1 L.
   2. Incubar a 37 °C, 200 rpm durante aproximadamente 3 a 4 h de crecimiento para alcanzar un OD₆₀₀ de 1.5-2.0. Diluir el cultivo 4 veces si se mide_{OD 600} > 0,8.
      NOTA: El tiempo exacto de incubación puede variar según la cepa, el inóculo inicial, el material de laboratorio y los instrumentos utilizados. Las cepas knockout ΔrecB/ΔrecBCD tienen tasas de crecimiento comparables a las del progenitor BL21 Rosetta2 (Figura complementaria 1).
   3. Pon la cultura en hielo.
   4. Girar las células a 5.000 x g durante 12 min a 4 °C, y luego desechar el sobrenadante por decantación.
   5. Resuspender los gránulos celulares en 800 ml de S30A+DTT refrigerado.
      NOTA: El volumen de S30A+DTT es 5 veces menor que el volumen de cultivo celular original. Por ejemplo, para un volumen inicial de 1 L del cultivo celular, resuspender los gránulos celulares en 200 ml de S30A+DTT. También se recomienda realizar este paso en una cámara frigorífica a 4 °C, así como mantener todos los materiales en hielo.
   6. Girar las células a 5.000 x g durante 12 min a 4 °C, y luego desechar el sobrenadante por decantación.
   7. Repita los pasos 2.3.5 y 2.3.6.
   8. Resuspender pellets de células en 160 mL de S30A+DTT refrigerado.
      NOTA: Esta vez el volumen de S30A+DTT es 25 veces menor que el volumen de cultivo celular original. Por ejemplo, para un volumen inicial de 1 L del cultivo celular, resuspender los gránulos celulares en 40 ml de S30A+DTT. Una vez más, se recomienda llevar a cabo este paso en una cámara frigorífica a 4 ° C, así como mantener los materiales en hielo.
   9. Transfiera las células a tubos refrigerados y prepesados de 50 ml.
   10. Girar las células a 2.000 x g durante 8 min a 4 °C, y luego desechar el sobrenadante por decantación.
   11. Girar las células a 2.000 x g durante 4 min a 4 °C y, a continuación, retirar el sobrenadante restante con cuidado utilizando una pipeta.
   12. Vuelva a medir el peso del tubo para calcular el peso del pellet celular.
   13. Mantener los gránulos celulares a -80 °C.
4. Día 4
   1. Tomar los gránulos celulares a -80 °C y descongelarlos en hielo durante 1-2 h.
   2. Resuspender los pellets celulares en 0,9 mL de tampón S30A+DTT por gramo del peso de los pellets. Pipetear lentamente para resuspender las células, evitando la espuma superior tanto como sea posible, si la hay.
   3. Colocar 1 ml de alícuotas de las células resuspendidas en microtubos de 1,5 ml y mantenerlas en hielo o en un bloque frío preenfriado a 4 °C (es preferible utilizar bloques metálicos).
      NOTA: Si la última alícuota es mucho menor que 1 ml, es mejor descartarla que sonicar un volumen subóptimo. El volumen óptimo (1 ml) para la sonicación se determinó para esta configuración (tubo, sonicador y sonda), y puede variar para uno diferente.
   4. Sonicar cada tubo en un sonicador (sonda de 3 mm, frecuencia 20 kHz), con una configuración de 20% de amplitud durante tres ciclos (sonicación de 30 s, pausa de 1 minuto).
      NOTA: La energía total entregada durante los tres ciclos fue ~ 266 Joules (~ 80-110 Joules por ciclo). Durante este paso, mantenga los tubos en el bloque frío que está rodeado de hielo. Alterne entre dos bloques fríos para evitar el sobrecalentamiento de la sonda (el bloque frío de reserva también se mantiene frío sobre hielo). Ambos bloques fríos fueron pre-enfriados en la nevera el día antes de la sonicación.
   5. Girar el lisado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   6. Recoja el sobrenadante (lisado celular) con una pipeta y transfiéralo a un tubo de 50 ml.
   7. Incubar el lisado celular a 37 °C a 200 rpm agitación durante 80 min.
   8. Girar el lisado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   9. Recoja el sobrenadante y la alícuota de 30 μL cada uno en microtubos de 1,5 ml preenfriados, manteniendo todos los tubos en hielo.
   10. Congelar rápidamente las alícuotas de lisado en hielo seco y almacenar a -80 °C.

3. Calibración de tampón libre de células para ADN lineal

NOTA: El tampón libre de células se calibró para concentraciones óptimas de Mg-glu y K-glu como se describe en Sun et ^al.13. El archivo complementario 1 es necesario para los pasos de calibración. Las reacciones se ajustaron a un volumen final de 10,5 μL cada una. Los extractos se calibraron utilizando 1 nM de ADN lineal (ver sección 4) o plásmido. Los experimentos se pueden realizar el mismo día en que se preparan los tampones, o los tampones preparados se pueden congelar a -80 °C para realizar el experimento otro día. Para todos los pasos de calibración, cada componente se descongeló en hielo antes de mezclarlo y pipetearlo en una placa de 384 pocillos.

1. Prepare una mezcla maestra, de acuerdo con la pestaña 'Preparación del tampón' en el archivo Excel Supplementary File 1, que contenga: (a) extracto celular (33% del volumen total de reacción), (b) ADN reportero (como ADN lineal y / o plásmido) a una concentración final de 1 nM, (c) tampón libre de células (PEG8000, solución AA y solución energética), y (d) K-glu a una concentración final de 80 mM.
2. Para un volumen de reacción de 10,5 μL, tomar 1,05 μL (10% de reacción total) de diferentes concentraciones de Mg-glu 10x concentrados (rangos de concentración finales: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 y 20 mM) y añadir 9,45 μL (90% de reacción total) de la mezcla maestra. Mezclar suavemente.
   NOTA: Utilice tubos de PCR de ocho tiras para preparar las diluciones y mezclar con una pipeta multicanal. Si es necesario, se puede utilizar un rango diferente de concentraciones de Mg-glu.
3. Pipetear 10 μL de las reacciones anteriores en una microplaca de fondo cuadrado de 384 pocillos, cubrirla con un sello de placa adhesiva y medir la expresión génica como salida de fluorescencia. Registre datos de fluorescencia con un lector de placas (Ej: 485 nm; Em: 528 nm) a intervalos regulares (por ejemplo, 5 min) durante 8 h de incubación a 30 °C con agitación orbital continua a 307 cpm.
   NOTA: Si es necesario, gire la microplaca de 384 pocillos (<2,500 x g, 1 min, temperatura ambiente) antes de comenzar la adquisición de datos. Se utilizaron mediciones de punto final para comparar la expresión de GFP en las diferentes composiciones de tampón. Los valores de fluorescencia se pueden convertir en unidades estandarizadas para el trazado (ver más abajo).
4. Identifique la concentración de Mg-glu que da como resultado el valor de fluorescencia más alto en el punto final.
   NOTA: Si no está seguro acerca de la concentración óptima de Mg-glu obtenida, repita el paso 3.2 con rangos de concentración más diversos.
5. Con la concentración optimizada de Mg-glu, proceda a la calibración de K-glu para un rango de concentraciones (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mM), utilizando los mismos volúmenes indicados en el paso 3.2. Ejecute el experimento e identifique el valor de fluorescencia más alto entre las concentraciones de K-glu probadas. Esto indica la composición tampón óptima para Mg-glu y K-glu para este lisado.
   NOTA: Si no está seguro acerca de la concentración óptima de K-glu obtenida, repita el paso con rangos de concentración más diversos.
6. Una vez establecidos los valores de Mg-glu y K-glu, preparar tubos de stock de la composición de tampón optimizada según el volumen de lote obtenido. Utilice la ficha «Preparación de tampón» del archivo complementario 1 para calcular el número de tubos tampón necesarios, alícuota de 38 μL por tubo y almacenar a -80 °C.

4. Preparación lineal del ADN

NOTA: Para la calibración del lisado, se utiliza el plásmido P70a-deGFP. Este plásmido se mantuvo en E. coli KL740 cl857+ (Tabla 6) para miniprep usando el Plasmid Miniprep Kit, o maxiprep usando el Plasmid Maxiprep Kit. Los fragmentos lineales de ADN utilizados como plantillas de expresión en las reacciones libres de células se amplificaron por PCR utilizando los cebadores y plantillas enumerados en la Tabla 7 y la Tabla 8.

1. La PCR se amplifica a partir del plásmido P70a-deGFP utilizando ADN polimerasa con oligocebadores enumerados en la Tabla 7. Configure las reacciones de PCR en un volumen de 50 μL, de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando el programa termociclador: [98 °C durante 2 min; 40 ciclos x (98 °C durante 30 s → 66 °C durante 30 s → 72 °C durante 60 s); 72 °C durante 10 min; 4 °C durante ∞].
2. Digerir el ADN molde en las reacciones de PCR añadiendo 1 μL de enzima de restricción DpnI por reacción de PCR de 50 μL e incubar a 37 °C durante 1 h. A continuación, purifique la reacción de PCR utilizando un kit de limpieza de PCR y ADN y eluya en agua libre de nucleasas.
3. Verifique los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% (1x TAE) antes de usarlos.
4. Cuantificar los productos de PCR purificados (o las preparaciones de plásmidos) utilizando Nanodrop (ND-1,000).
   NOTA: Si se utiliza una ADN polimerasa/tampón que es directamente compatible con la reacción libre de células aguas abajo, el paso de purificación (paso 2) se puede omitir por completo y la concentración de ADN no purificado se puede medir mediante un ensayo fluorométrico con colorante de unión al ADN en su lugar (ver Batista et ^al.10).

5. Ejecución experimental

NOTA: Además de utilizar el archivo complementario 1 para calibrar la reserva reguladora para cada lote de lisado preparado (arriba), se recomienda utilizar la pestaña 'Preparación de reacción' en el archivo para configurar las reacciones posteriores sin células. Como antes, el volumen de las reacciones se establece en 10,5 μL por reacción, de los cuales solo 10 μL finalmente se pipetean en la placa de 384 pocillos para la adquisición de datos. Aquí, 5 nM de cada plantilla se utilizan para la expresión libre de celdas. Es importante ser consistente al pipetear las reacciones: use la misma pipeta y el tipo de puntas. Dispense con cuidado para evitar burbujas en el pozo o cualquier líquido que se adhiera a las paredes del pozo. Si es necesario, gire la placa (<2,500 x g, 1 min, temperatura ambiente).

1. Calcule los volúmenes a pipetear introduciendo las descripciones de las muestras y las réplicas necesarias por muestra en la pestaña "Preparación de la reacción" del Archivo complementario 1.
   NOTA: Si se requiere un volumen de reacción distinto de 10,5 μL, también se puede introducir en el archivo complementario 1. El archivo calculará el número de tubos de existencias reguladoras previamente optimizadas y los tubos de extracción de células que se descongelarán en hielo.
2. Etiquete un microtubo de 1,5 ml para la preparación de la mezcla maestra óptima (por separado para el ADN lineal y plásmido), agregue los volúmenes correctos del tampón y el lisado, y mezcle suavemente.
   NOTA: Debido a las diferencias en las concentraciones óptimas de K-glu en sus tampones, se deben hacer copias de la pestaña 'Preparación de reacción' para usar por separado para el ADN lineal y plásmido.
3. Pipetear primero las muestras de ADN, seguidas de agua libre de nucleasas y, finalmente, la mezcla maestra óptima (MM) del paso 5.2. Mezcle suavemente la reacción sin células con la pipeta justo antes de añadirla al lector de placas y evite cualquier burbuja.
   NOTA: Utilice un tubo de PCR de ocho tiras para mezclar el volumen de reacción para una réplica adicional. Por ejemplo, si se pretenden triplicados técnicos, prepare una mezcla para cuatro reacciones y deje un volumen muerto en el tubo para reducir los errores de pipeteo mientras agrega las muestras a la placa.
4. Configurar las reacciones en el lector de placas (Ex 485 nm; Em 528 nm). Las corridas cinéticas registraron datos de fluorescencia a intervalos regulares (por ejemplo, 5 min) durante 8 h de incubación a 30 °C, con agitación orbital continua a 307 cpm.
   NOTA: Las mediciones del punto final se informaron como el punto de tiempo de 8 h. Los valores de fluorescencia recogidos están en unidades arbitrarias (u.a.), pero se pueden convertir en unidades estandarizadas para trazar (ver más abajo).

6. Cuantificación relativa de FITC y GFP

NOTA: La expresión de GFP es exportada por el lector de placas en unidades de fluorescencia arbitrarias (u.a.). Sin embargo, se recomienda utilizar unidades de medida estandarizadas para comparar los valores de fluorescencia entre diferentes configuraciones (lotes, equipos, usuarios y laboratorios). Aquí se presentan pasos detallados para convertir los valores de fluorescencia (u.a.) a valores equivalentes a FITC y eGFP (μM), utilizando curvas estándar de NIST-FITC y eGFP recombinante. Conservar la solución madre de NIST-FITC a 4 °C y conservar la eGFP recombinante a -20 °C. Asegúrese de que la solución madre y las diluciones en serie estén protegidas de la luz. En el momento de la entrega, se recomienda alícuota de la eGFP recombinante en volúmenes más pequeños para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación.

1. Preparar una solución de borato de sodio de 100 mM, pH 9,5, y conservar a temperatura ambiente o a 4 °C.
2. Prepare 12 diluciones (70 μL cada una) para la curva estándar, 2x por paso (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390, 0.195, 0.097, 0.048 y 0 μM) del estándar FITC trazable por NIST a partir del material de 50 μM utilizando la solución de borato de sodio. Preparar la serie de dilución por triplicado.
3. Similar al paso 6.2, preparar diluciones seriadas (70 μL cada una) de la eGFP recombinante utilizando la solución de borato de sodio (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 y 0 μM). Para el cálculo de la molaridad, considere el tamaño total de la proteína (28 kDa) y la concentración de la eGFP purificada (1 g / L). Preparar la serie de dilución por triplicado.
4. Agregue 20 μL de cada dilución (nueve pocillos cada uno = tres series de diluciones x tres réplicas técnicas) en una microplaca de fondo cuadrado de 384 pocillos, cubierta por un sello de placa adhesiva, e incube en un lector de placas para su medición.
   NOTA: Aquí, los ajustes utilizados fueron Excitación: 485/20, Emisión: 528/20, con ganancia 50. Sin embargo, también se pueden usar combinaciones adicionales de longitud de onda / ganancia para calibrar otras moléculas fluorescentes y / o configuraciones de ganancia. Para calcular el factor de conversión, se requieren los mismos ajustes de longitud de onda y ganancia para adquirir los datos de fluorescencia GFP de los experimentos libres de células y los datos de curva estándar.
5. Utilice el rango de señal lineal (aquí, por ejemplo, [FITC] ≤ 0,781 μM) para ajustar la pendiente [y = ax y R²] para cada condición.
   NOTA: El rango puede diferir para diferentes máquinas y soluciones estándar utilizadas.
6. Guarde los datos para la calibración FITC y eGFP para calcular las mediciones relativas para el laboratorio siguiendo el ejemplo de la Tabla 9. Divida los valores obtenidos en unidades arbitrarias de fluorescencia (u.a.) por el valor de la pendiente de la curva "a" (y = ax) para estimar la producción de GFP en términos de FITC o eGFP.

Resultados

Aquí se muestran resultados representativos después de la calibración del lisado para los niveles óptimos de Mg-glutamato y K-glutamato por separado para el ADN lineal y plásmido (Figura 1). La concentración óptima de Mg-glutamato es similar en los extractos de Δ recB y ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). Sin embargo, la concentración óptima de K-glutamato para el ADN plásmido es de 140 mM, mientras que la concentración óptima de K-glutam...

Discusión

Aquí, mostramos que el lisado celular preparado a partir de E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genómico para el operón recB o recBCD admite una alta expresión de proteínas a partir de plantillas de ADN lineal. Este protocolo elabora un procedimiento de calibración de lisado paso a paso específico para plantillas de ADN lineal (Figura 2), que es un paso crítico que conduce a la alta expresión de promotores σ70 en ADN lineal, alcanzando niveles cercanos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-YT Broth	Invitrogen	22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate	Thermo Scientific Nunc	142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)	Sigma-Aldrich	P8877
adhesive plate seal	Thermo Scientific Nunc	232701
Agar	Invitrogen	30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	A8937
BL21 Rosetta2	Merck Millipore	71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB	Addgene	176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD	Addgene	176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
CoA (Coenzyme A hydrate)	Sigma-Aldrich	C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430790	15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430828	50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)	Alfa Aesar	J62238
DpnI	NEB	R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)	Sigma-Aldrich	F7878
GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate,  Disodium Salt)	Sigma-Aldrich	371701
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4)	Carl Roth	231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P)	Sigma-Aldrich	P5655
K-glutamate	Alfa Aesar	A17232
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone	Merck Millipore	SLGP033RB	membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit	NEB	T1030S	PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)	Sigma-Aldrich	N6522
NIST-traceable FITC standard	Invitrogen	F36915	NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit	Macherey-Nagel	740414.1	Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
plate reader	Biotek	Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein	Chromotek	egfp-250	recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	M0492S	DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492L	DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo	Q32850	fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler	biotechrabbit	BR1401801
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Sterile water			Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base	Life Science products Cytiva	17-1321-01
tRNA	Roche	10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505	SONICS	VC505	sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)	Acros Organics	226310010
Water, nuclease-free	Thermo	R0581	nuclease-free water