Imágenes químicas de alta resolución espacial de infecciones asociadas a implantes con imágenes químicas de luminiscencia excitada por rayos X a través de tejidos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la detección óptica de alta resolución de información química alrededor de dispositivos médicos implantados con imágenes químicas de luminiscencia excitada por rayos X (XELCI). Esta novedosa técnica de imagen se desarrolla en nuestro laboratorio que permite estudiar la bioquímica de infecciones asociadas a implantes.

Resumen

Las infecciones microbianas asociadas con dispositivos médicos implantables son una preocupación importante en la falla de fijación de fracturas. El diagnóstico temprano de dicha infección permitirá la erradicación exitosa con antibióticos sin un costo adicional para una segunda cirugía. En este documento, describimos XELCI como una técnica con alta resolución de rayos X, especificidad del implante y sensibilidad química a concentraciones químicas de imágenes no invasivas cerca de la superficie de los dispositivos médicos implantados. Los dispositivos están recubiertos con superficies que informan químicamente. Esta superficie químicamente sensible consta de dos capas recubiertas de un dispositivo médico implantable; una capa sensible al pH (hidrogel incorporado azul de bromotimol o verde bromocresol) que se recubre sobre una capa de centelleador emisor de luz roja (Gd 2O₂S: Eu) para monitoreo. Un haz de rayos X enfocado irradia un punto en el implante, y la luz roja generada por el centelleador (con picos de 620 nm y 700 nm) se transmite a través de la capa de detección que altera la relación espectral dependiendo del pH. Se genera una imagen escaneando el haz de rayos X a través del implante y midiendo la relación espectral de la luz que pasa a través del tejido punto por punto. Utilizamos esta técnica de imagen para monitorear infecciones asociadas a implantes previamente en la superficie ósea del fémur con un sensor de placa implantable modificado. Ahora estamos estudiando los cambios de pH que ocurren a partir de las infecciones intramedulares de la varilla tibial. Se utilizan dos tipos diferentes de diseños de varillas intramedulares en estudios de conejos prepiloto, y aprendimos que la técnica XELCI podría usarse para monitorear cualquier cambio químico que ocurra no solo en la superficie ósea sino también dentro del hueso. Por lo tanto, esto permite imágenes no invasivas, de alta resolución espacial y bajo pH local de fondo para estudiar la bioquímica de la infección asociada al implante.

Introducción

En los Estados Unidos, alrededor de 2 millones de dispositivos de fijación de fracturas se insertan anualmente, y 5% -10% de ellos conducen a infecciones asociadas a implantes¹. Estas infecciones son más difíciles de tratar con antibióticos en etapas posteriores debido a la heterogeneidad y la naturaleza resistente a los antibióticos de los biofilms ^2,3. Si se diagnostican temprano, las infecciones se pueden tratar con antibióticos y desbridamiento quirúrgico para evitar costos médicos adicionales para una segunda cirugía para reemplazar el hardware en el sitio de la fractura tratada. La radiografía simple y otras técnicas radiográficas avanzadas se aplican en el diagnóstico de infecciones ortopédicas asociadas a implantes, no uniones y complicaciones relacionadas. Aunque estas técnicas se utilizan con frecuencia para adquirir información estructural del hueso y el tejido circundante en el implante ortopédico, no pueden proporcionar información bioquímica en el entorno específico. Por lo tanto, desarrollamos una nueva técnica de imágenes químicas de luminiscencia excitada por rayos X (XELCI) para obtener imágenes de alta resolución de información bioquímica de forma no invasiva en el sitio del implante. El diagnóstico de infecciones asociadas a implantes ortopédicos se lleva a cabo comúnmente por uno o una combinación de diferentes medios. Las observaciones clínicas (dolor, hinchazón, enrojecimiento, secreción de la herida, etc.) sugieren los primeros signos de infección. Posteriormente, se realizan experimentos radiológicos y de laboratorio para confirmar el fracaso de la progresión de la cicatrización ósea e identificar el organismo patógeno ^4,5. Las técnicas medicinales nucleares como la tomografía computarizada (TC), la resonancia magnética (RM) y los métodos de radionucleótidos como la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y la tomografía por emisión de positrones (PET) están en uso para una mejor visualización del implante infectado y la infección asociada ^6,7. La TC y la RM son ventajosas para determinar la necrosis ósea y las anomalías de los tejidos blandos, respectivamente, pero causan interferencias a corta distancia de los implantes metálicos⁸. Diferentes metodologías de rayos X como SPECT y PET en combinación con analitos marcados con radioisótopos como agentes de contraste de imágenes in vivo se utilizan ampliamente para diagnosticar la osteomielitis asociada a implantes². Las aplicaciones actuales combinan tanto los datos de la tomografía computarizada como los datos de etiquetado de SPECT o PET para generar información anatómica⁹. Aunque una o más de estas modalidades de imagen se utilizan para ayudar al diagnóstico de la infección, no pueden detectar las variaciones de pH asociadas con la infección temprano para iniciar los tratamientos con antibióticos para evitar gastos médicos y quirúrgicos adicionales.

La principal ventaja de utilizar el sistema de imágenes utilizado en este estudio para monitorear infecciones asociadas a implantes es su capacidad para revelar información bioquímica sobre el microambiente de biopelícula con una referencia espectral. Aunque el enfoque principal es la obtención de imágenes y el mapeo del pH en el sitio infectado, este método puede modificarse para monitorear otros biomarcadores específicos de las infecciones asociadas a implantes. Por lo tanto, XELCI permite comprender la fisiopatología de la infección. Las imágenes de alta resolución espacial permiten mapear la heterogeneidad a medida que crece la infección. El pH en la superficie donde se produce la formación de biopelículas es muy importante para comprender los cambios bioquímicos. Además, otros cambios en el microambiente pueden ocurrir debido a las respuestas de estrés relacionadas con los antibióticos por parte de las bacterias^10,11. Debido a las imágenes específicas de la superficie y de alta resolución espacial, se puede monitorear el efecto antibiótico en el microambiente de la biopelícula. La técnica también se puede utilizar para estudiar el entorno de biopelícula para experimentos específicos de administración de fármacos. Podemos estudiar la liberación de fármacos de pH bajo o elevar el pH para hacerlos más susceptibles a trabajar a pH más alto.

Tres características específicas de esta técnica de imagen son la resolución de rayos X, la especificidad de la superficie del implante y la sensibilidad química (Figura 1A). Estas características se pueden comparar con las técnicas de imagen actualmente disponibles para obtener imágenes de infecciones relacionadas con implantes ortopédicos (Figura 1B). Una vez irradiadas con rayos X, las partículas de fósforo recubiertas en la superficie del implante generan luz roja e IR cercana (NIR) que puede penetrar a través de unos pocos centímetros de tejido (aunque con cierta atenuación)^12,13. La Tabla 1 muestra algunas de las características del sistema de imágenes desarrollado en comparación con otras formas que se han utilizado para medir el pH en biopelículas o a través del tejido.

XELCI es una novedosa técnica de imagen para adquirir información química de alta resolución espacial ópticamente cerca de dispositivos médicos implantados en combinación con excitación de rayos X, como se muestra en la Figura 2. Aquí se utiliza la excitación selectiva y la detección óptica de partículas de fósforo excitables por rayos X. El implante está recubierto con dos capas, una capa de polímero incorporada con tinte sensible al pH sobre una capa de partículas centelleadoras. Una vez que una secuencia de haces de rayos X enfocados irradia el implante, la capa centelleadora genera luz visible (620 nm y 700 nm). Esta luz producida pasa a través de la capa sensible al pH modulando el espectro de luminiscencia dependiendo del pH del entorno circundante. El pH bajo generalmente se asocia con infección y formación de biopelículas; a medida que la infección progresa, el pH cambia de pH fisiológico (pH 7.2) a ácido (menos de pH 7), y el tinte de pH en el sensor cambia de color y, por lo tanto, de absorbancia. La variación del espectro de luminiscencia se muestra en la Figura 2E para el colorante de pH verde Bromocresol a pH 7 y pH 4. La luz transmitida a través del tejido y el hueso se recoge y la relación espectral determina el pH. Para generar una imagen de pH, el haz de rayos X enfocado irradia un punto a la vez en la película centelleadora y escanea el haz punto por punto a través de la muestra. Anteriormente, esta técnica se aplicaba para obtener imágenes de variación del pH en la superficie de los implantes ortopédicos^14,15 y se había probado para monitorizar las variaciones de pH en el canal intramedular a través del hueso y el tejido.

La figura 3 a continuación muestra un esquema del sistema de imágenes. Los componentes básicos del sistema de imágenes son la fuente de excitación de rayos X con óptica policapilar, una guía de luz acrílica de una sola pieza que se conecta a dos tubos fotomultiplicadores, la etapa motorizada x, y y z (30 cm x 15 cm x 6 cm de recorrido) y la computadora conectada para la adquisición de datos. La fuente de rayos X, la etapa x, y, z y la óptica de recolección (codo, guía de luz, tubos fotomultiplicadores (PMT)) se encuentran en el recinto a prueba de rayos X, mientras que el controlador de rayos X, la fuente de alimentación para PMT, el generador de funciones conectado a la placa de adquisición de datos (DAQ) y la computadora se mantienen afuera. Un pulsador, normalmente abierto, colocado entre el recinto y la parte delantera de la puerta sirve como enclavamiento. Si la puerta no está completamente cerrada (el interruptor de enclavamiento está abierto), la fuente de rayos X no se encenderá y apagará automáticamente la fuente de rayos X si se abre durante el funcionamiento. Los motores pueden ejecutar un escaneo continuo, así como se pueden mover a cualquier ubicación discreta. La velocidad de escaneo para el eje y suele ser de 1-5 mm / s, mientras que el tamaño del paso en el eje x se puede elegir típicamente de 150 a 2000 μm. Los parámetros se pueden elegir en función de la resolución espacial requerida. Incluso los tiempos de exposición se confirman mediante una velocidad constante a lo largo de un escaneo continuo.

Una vez que el haz de rayos X enfocado se irradia en las partículas de luminiscencia de rayos X, la luz generada pasará a través de la película sensible al pH modulando la luz dependiendo del pH circundante. La luz transmitida interactuará (dispersará y absorberá parcialmente) con un tejido, mientras que la atenuación de la luz por dispersión y absorción aumentará a medida que aumente el grosor del tejido. La óptica de la colección incluye una guía de luz acrílica bifurcada de una sola pieza equipada con un codo de aluminio reflectante (con una curva de 90 ° y una superficie interior reflectante pulida) al principio. Esto es para asegurar que la luz se colimate tan pronto como la luz llegue a la guía de luz. Estas adiciones mejoraron significativamente la eficiencia de la recolección de luz. Para más detalles, la Figura 4 muestra los dibujos de la máquina del codo y la guía de luz. El codo de 90 ° se mecanizó en aluminio con la superficie interna pulida a un acabado de espejo y la guía de luz se mecanizó con acrílico. También hemos conectado un filtro de luz azul de paso largo de amplio rango (bloqueando la luz de 350-450 nm) al comienzo del codo para garantizar que solo pase la luz roja. El extremo de la guía de luz acrílica de una sola pieza se bifurca en dos corrientes que conducen a dos PMT diferentes. Los PMT están encerrados en una pequeña caja de metal hermética a la luz que está en contacto con un enfriador termoeléctrico para enfriar los PMT a ~ 5 ° C. Al comienzo de uno de los PMT, se adjunta un filtro de paso largo de rango estrecho (que bloquea la luz de 570-640 nm y pasa la luz de 640-740 nm) para medir solo la luz de 700 nm. Por lo tanto, la luz de 620 nm y 700 nm se puede calcular por separado. Los PMT se configuran en modo de conteo de fotones y generan pulsos de lógica transistor-transistor (TTL) para cada fotón detectado. Un sistema DAQ cuenta los pulsos (punto de saturación 20 millones de pulsos por segundo) mediante comunicación USB. Se generan dos mapas de intensidad separados después de procesar los datos, y se crea una imagen final considerando la relación entre la intensidad de la longitud de onda de la señal (620 nm) y la intensidad de la longitud de onda de referencia (700 nm). Esta relación explica las diferencias en la eficiencia total de la recolección de luz, que dependen en gran medida de la posición de la óptica de recolección, la intensidad de la irradiación de rayos X y el grosor del tejido. Además, una región de referencia separada espacialmente sin ningún colorante indicador de pH explica la distorsión espectral de la penetración del tejido dependiente de la longitud de onda. Se utiliza un lenguaje de programación basado en gráficos para controlar el sistema de imágenes, y a continuación se muestra un diagrama de flujo básico de la operación. La configuración de imágenes, a excepción de la computadora, el controlador de rayos X y la unidad DAQ, está encerrada en un recinto de rayos X seguro para minimizar la exposición a la radiación.

Protocolo

Este procedimiento sigue los protocolos de uso de animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Clemson (IACUC). Los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con el Comité de Bioseguridad de la Universidad de Clemson (IBC) y el Comité de Seguridad Radiológica (RSC), así como siguiendo las pautas y regulaciones relevantes.

NOTA: Un diagrama de flujo para completar una exploración XELCI se muestra a continuación en la Figura 5 seguido de una descripción detallada paso a paso del procedimiento de imagen.

1. Inicialice el sistema y adquiera una radiografía simple

1. Encienda el enfriador PMT, normalmente tarda ~ 15 minutos en alcanzar el punto de ajuste (por ejemplo, 4 ° C). Realice el resto de los pasos de inicialización antes de activar los PMT.
2. Abra el software de control del sistema de imágenes. El programa de software de control comunica e inicializa la etapa motorizada del eje x-y-z. Mueva los ejes x e y de la etapa a la posición inicial deseada.
3. Coloque la muestra en la plataforma móvil x-y-z. Coloque la altura de la muestra (eje z), de modo que el dispositivo radioluminiscente esté 5-5,5 cm por debajo de la óptica de enfoque policapilar subiendo o bajando la fuente de rayos X y/o el escenario. Además, coloque la muestra en el plano x-y con la ayuda de la cruceta láser (dos punteros láser en forma de línea roja unidos al capilar de enfoque de rayos X y colocados a 90 ° entre sí para que las líneas se crucen donde se enfocará la radiografía). Apague los láseres antes de encender los rayos X y los PMT.
4. Asegure el enclavamiento del botón pulsador en la puerta principal de la carcasa de imágenes. Encienda la fuente de rayo. Retire la óptica de enfoque para obtener la radiografía simple de la muestra.
5. Abra el software de control de rayos X y ajuste la potencia de rayos X (ajustando el voltaje y la corriente). Abra el obturador de rayos X con el software de control de rayos X.
6. Abra el software para la cámara de rayos X. Presione el botón de exposición para tomar la radiografía simple. Apague la exposición y apague la radiografía.
   NOTA: Si es necesario, mueva la muestra para mejorar la posición de la muestra o adquiera una serie de rayos X en diferentes posiciones para que puedan cotejarse para obtener una vista radiográfica más grande. También se puede adquirir una radiografía en un sistema separado, pero el registro conjunto entre XELCI y la radiografía se vuelve más difícil si la muestra se mueve.
7. Abra la puerta del recinto.

2. Opcionalmente, realice un escaneo de fondo con la radiografía apagada

1. Conecte la óptica policapilar de nuevo a la fuente de rayos X.
2. Cierre la carcasa y asegure el enclavamiento. Encienda la fuente de alimentación PMT.
   NOTA: La fuente de alimentación PMT siempre debe apagarse siempre que la puerta esté abierta o a punto de abrirse para evitar la sobreexposición a la luz.
3. Abra el software de control del sistema de imágenes y especifique el tamaño del paso, la velocidad de escaneo y el área de escaneo. Una vez que todos los parámetros estén configurados, inicie el escaneo presionando el botón Ejecutar .
   NOTA: Para un escaneo de alta resolución, el tamaño del paso será de 1000 μm y para un escaneo de baja resolución, el tamaño del paso será de 250 μm. La velocidad de escaneo se puede elegir desde 5 mm/s hasta 1 mm/s. El área de la exploración depende de las dimensiones de la muestra.
4. Ejecute un escaneo de fondo con la radiografía apagada para determinar los recuentos oscuros de cualquier luz presente en el recinto que no sea la muestra.

3. Realice una exploración de muestra con la radiografía encendida

1. Asegúrese de que la muestra todavía esté en la posición correcta con la cruceta láser para comenzar el escaneo.
2. Cierre la carcasa y asegure el enclavamiento. Si los PMT están apagados (por ejemplo, apagados antes de abrir la puerta), encienda la fuente de alimentación PMT.
3. Abra el software de control del sistema de imágenes. Introduzca los valores de tamaño de paso, velocidad de escaneo y área de escaneo. Una vez que todos los parámetros estén configurados, presione el botón Ejecutar para iniciar el escaneo.
   NOTA: Para un escaneo de alta resolución, el tamaño del paso será de 1000 μm y para un escaneo de baja resolución, el tamaño del paso será de 250 μm. La velocidad de escaneo se puede elegir desde 5 mm/s hasta 1 mm/s. El área de la exploración depende de las dimensiones de la muestra.
4. Obtenga la exploración de la muestra con la radiografía encendida.
5. Primero, realice el escaneo de baja resolución con tamaños de paso más grandes y una mayor velocidad de escaneo para obtener una imagen preliminar del objetivo. Después de obtener un escaneo de baja resolución del área deseada de la muestra, obtenga el escaneo de mayor resolución con un tamaño de paso más pequeño y una velocidad de escaneo más baja.
6. Apague la fuente de alimentación PMT antes de abrir la puerta.

4. Formar la imagen

1. Valide que el escaneo actual está creando imágenes del área de interés del objetivo. De lo contrario, detenga el escaneo actual presionando el botón Detener .
2. Ajuste las posiciones de escaneo en el software de control nuevamente y presione el botón Ejecutar nuevamente.
   NOTA: El eje y se graba continuamente a partir de la primera fila del escaneo. Al realizar un escaneo, se registra el número de recuentos por cada longitud de onda y tiempo desde la última posición actualizada del motor. El tiempo registrado tendrá en cuenta cualquier cambio en la velocidad del motor, por lo tanto, el tiempo de exposición. Para cada píxel, los recuentos/segundo se normalizan. El motor del eje y viaja para escanear el final de la fila actual del eje y y el motor vuelve a la posición inicial. Luego, el motor del eje X aumenta su posición en un tamaño de paso definido por el usuario y escanea la segunda fila del eje y. Este proceso se cicla hasta que el motor del eje x alcanza el ancho especificado para la dirección x. El usuario puede controlar el tamaño del escaneo, la velocidad del motor y las posiciones de arranque del motor. El tamaño del paso determinará el tamaño de los píxeles en la imagen final del eje y.

5. Cultivo de bacterias para obtener imágenes en condiciones estériles (si se obtienen imágenes de sensores cultivados con bacterias)

1. Para preparar un cultivo fresco de Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923), use una colonia de una placa TSA (agar de soja tríptico) rayada dentro de 1 semana para inocular 5 ml de caldo de soja tríptico estéril (TSB).
2. Agitar suavemente el cultivo bacteriano a 37 °C durante 16-18 h hasta la fase estacionaria.
3. A continuación, pellet del cultivo de la TSB mediante centrifugación a 4000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y lavar el pellet dos veces con solución tampón de fosfato (PBS) y resuspender el pellet en 5 ml de PBS estéril.
4. Cuantificar la concentración bacteriana utilizando la densidad óptica a 600 nm utilizando el rango lineal, que es el rango OD donde se verifica la ley de Beer-Lambert (OD = kN; k es un coeficiente relativo a la extinción molecular y la longitud de la trayectoria óptica, N es la concentración bacteriana)¹⁶. Luego diluir la muestra a 10⁵ células/ml usando PBS estéril.
5. Esterilizar el agar tríptico de soja (TSA) en autoclave y luego enfriar mezclando hasta que la temperatura alcance los 45 °C. Inocular las bacterias en la TSA.
6. Pipetear el cultivo bacteriano diluido (100 μL) sobre la superficie del sensor implantable.
   NOTA: Los implantes se esterilizaron por inmersión en etanol al 70% durante 5 min y se almacenaron en PBS estéril.
7. Pipetear 100 μL de TSA no inoculada sobre otro implante estéril como control
8. Añadir 100 μL adicionales de TSA no inoculada sobre el sensor implantable antes de incubarlo a 37 °C durante 48 h antes de la implantación.

Resultados

Como estudio preliminar, obtuvimos imágenes del sensor de varilla intramedular en una tibia escariada de un cadáver de conejo¹⁴. El sensor tiene tres regiones distintas: la región de referencia, la región pH 8 (pH básico) y la región pH 4 (pH ácido). La región de referencia es la partícula centelleadora (Gd 2 O₂S:Eu) incorporada en una película epoxi rugosa. Las regiones distintivas de pH ácido y básico representan situaciones infectadas y no infectadas dentro del...

Discusión

Para poder detectar y estudiar precozmente las infecciones ortopédicas asociadas a implantes y evitar complicaciones por osteomielitis y procedimientos quirúrgicos secundarios, hemos introducido XELCI como una novedosa técnica de imagen funcional. Es comparable con las técnicas actualmente disponibles para el monitoreo del pH a través del tejido.

Al colocar la muestra para la obtención de imágenes, utilizamos una cruz láser conectada a una óptica de enfoque policapilar con dos puntero...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150