X線励起発光によるインプラント関連感染症の高空間分解能化学イメージング 組織イメージング

要約

ここでは、X線励起発光化学イメージング(XELCI)を用いて、移植された医療機器周辺の化学情報を高解像度で光学的に検出するためのプロトコルを紹介します。この新しいイメージング技術は、インプラント関連感染症の生化学の研究を可能にする私たちの研究室で開発されています。

要約

埋め込み型医療機器に関連する微生物感染は、骨折固定不全の主要な懸念事項です。このような感染症の早期診断により、2回目の手術に追加費用をかけずに抗生物質による根絶を成功させることができます。ここでは、XELCIを、高いX線分解能、インプラント特異性、および埋め込み型医療機器の表面近くの化学物質濃度を非侵襲的に画像化する化学物質に対する化学物質感受性を備えた技術として説明します。デバイスは、化学的に報告する表面でコーティングされています。この化学的に応答する表面は、埋め込み型医療機器にコーティングされた2つの層で構成されています。pH感受性層(ブロモチモールブルーまたはブロモクレゾールグリーン組み込みヒドロゲル)を、モニタリング用の赤色発光シンチレータ(Gd2O2S:Eu)層上にコーティングする。集束X線ビームがインプラント上のスポットに照射され、シンチレータによって生成された赤色光(620nmおよび700nmのピークを持つ)は、pHに応じてスペクトル比を変化させる検出層を透過します。画像は、インプラントを横切ってX線ビームをスキャンし、組織を通過する光のスペクトル比をポイントごとに測定することによって生成されます。このイメージング技術を使用して、修正された埋め込み型プレートセンサーを使用して、以前は大腿骨の骨表面でのインプラント関連感染を監視していました。現在、脛骨髄内桿体感染によるpH変化について研究しています。パイロット前のウサギの研究では、2種類の髄内ロッド設計が使用されており、XELCI技術を使用して、骨表面だけでなく骨内部でも発生する化学変化を監視できることを学びました。したがって、これにより、インプラント関連感染症の生化学を研究するための非侵襲的、高空間分解能、低バックグラウンドの局所pHイメージングが可能になります。

概要

米国では、年間約200万個の骨折固定装置が挿入されており、そのうちの5%〜10%がインプラント関連感染症につながっています¹。これらの感染症は、バイオフィルムの不均一性と抗生物質耐性の性質のために、後の段階で抗生物質で治療するのが困難です^2,3。早期に診断された場合、感染症は抗生物質と外科的創面切除剤で治療され、治療された骨折部位のハードウェアを交換するための2回目の手術のための余分な医療費を防ぐことができます。プレーンX線撮影およびその他の高度なX線撮影技術は、整形外科インプラント関連感染症、非結合、および関連する合併症の診断に適用されます。これらの技術は、整形外科インプラントで周囲の骨や組織の構造情報を取得するために頻繁に使用されますが、特定の環境では生化学的情報を提供することはできません。そこで我々は、インプラント部位の生化学情報を非侵襲的に高解像度でイメージングする新しいX線励起発光化学イメージング(XELCI)技術を開発しました。整形外科インプラント関連感染症の診断は、一般に、異なる手段の1つまたは組み合わせによって行われる。臨床観察(痛み、腫れ、発赤、創傷分泌物など)は、感染の最初の兆候を示唆しています。その後、骨治癒進行の失敗を確認し、病原性生物を特定するために、放射線学的および実験室実験が行われる^4,5。感染したインプラントと関連する感染をよりよく視覚化するために、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)、および単一光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)や陽電子放出断層撮影(PET)などの放射性ヌクレオチド法などの核医学技術が使用されています^6,7。CTおよびMRIは、それぞれ骨壊死および軟部組織異常の判定に有利であるが、金属インプラント⁸に近い距離で干渉を引き起こす。SPECTやPETなどのさまざまなX線方法論と放射性同位元素標識分析物をin vivoイメージング造影剤として組み合わせることで、インプラント関連骨髄炎の診断に広く使用されています²。現在のアプリケーションは、CTスキャンからのデータとSPECTまたはPETのいずれかからのラベリングデータの両方を組み合わせて、解剖学的情報を生成します⁹。これらの画像診断の1つ以上は感染診断を支援するために使用されますが、余分な医療費や外科的費用を避けるために抗生物質による治療を開始するために感染に関連するpH変動を早期に検出することはできません。

この研究で使用したイメージングシステムをインプラント関連感染症のモニタリングに利用する主な利点は、スペクトル参照を使用してバイオフィルム微小環境に関する生化学的情報を明らかにすることができることです。主な焦点は感染部位のpHのイメージングとマッピングですが、この方法は、インプラント関連感染症に特異的な他のバイオマーカーを監視するように変更できます。したがって、XELCIは感染症の病態生理学を理解することを可能にする。高空間分解能イメージングにより、感染の拡大に伴う不均一性をマッピングできます。バイオフィルム形成が起こる表面のpHは、生化学的変化を理解する上で非常に重要です。また、細菌^10,11による抗生物質関連のストレス応答により、他の微小環境の変化が発生する可能性があります。表面特異的で空間分解能の高いイメージングにより、バイオフィルム微小環境に対する抗生物質の影響をモニターすることができます。この技術は、標的薬物送達実験のためのバイオフィルム環境を研究するためにも使用できます。標的とした低pHの薬物放出やpHの上昇を研究して、高pHでの作業を受けやすくすることができます。

このイメージング技術の3つの特定の特性は、X線分解能、インプラント表面特異性、および化学物質感受性です(図1A)。これらの特性は、整形外科インプラント関連感染症を画像化するために現在利用可能な画像化技術と比較することができる(図1B)。X線を照射すると、インプラント表面にコーティングされた蛍光体粒子は、数センチメートルの組織を透過できる赤色および近赤外(NIR)光を生成します(多少の減衰はありますが)^12,13。表1は、バイオフィルム中または組織を通してpHを測定するために使用されてきた他の方法と比較した、開発されたイメージングシステムの特徴のいくつかを示しています。

XELCIは、図2に示すように、X線励起と組み合わせて、埋め込み型医療機器の近くで光学的に空間分解能の高い化学情報を取得するための新しいイメージング技術です。ここではX線励起性蛍光体粒子の選択的励起や光学的検出が利用される。インプラントは、シンチレータ粒子の層の上にポリマー層を組み込んだpH感受性色素の2つの層でコーティングされている。集束された一連のX線ビームがインプラントに照射されると、シンチレータ層は可視光(620nmおよび700nm)を生成する。この生成された光は、周囲の環境のpHに応じて発光スペクトルを調節するpH感受性層を通過します。低pHは一般に感染とバイオフィルム形成に関連しています。感染が進行するにつれて、pHは生理的pH(pH 7.2)から酸性(pH 7未満)に変化し、センサー内のpH染料は色を変え、したがって吸光度を変化させます。ルミネッセンススペクトルの変化を、pH 7およびpH 4におけるブロモクレゾールグリーンpH色素について図2Eに示す。組織と骨を透過した光が収集され、スペクトル比がpHを決定します。pH画像を生成するために、集束されたX線ビームはシンチレータフィルム内の一度に一点ずつ照射し、サンプルを横切ってビームを点ごとにスキャンします。以前、この技術は、整形外科インプラント¹⁴、¹⁵の表面のpH変動を画像化するために適用され^、骨および組織を通る髄内管内のpH変動を監視するためにそれを試験してきた。

下の図3は、イメージングシステムの概略図を示しています。イメージングシステムの基本コンポーネントは、ポリキャピラリー光学系を備えたX線励起源、2つの光電子増倍管に接続するワンピースのアクリルライトガイド、x、y、z電動ステージ(30 cm x 15 cm x 6 cmトラベル)、およびデータ収集用に接続されたコンピューターです。X線源、x、y、zステージ、および収集光学系(エルボ、ライトガイド、光電子増倍管(PMT))はX線防止エンクロージャ内にあり、X線コントローラ、PMT用電源、データ収集(DAQ)ボードに接続された関数発生器、およびコンピュータは外部に保管されています。エンクロージャとドアの前面の間に配置されたプッシュボタン、ノーマルオープンスイッチは、インターロックとして機能します。ドアが完全に閉じていない(インターロックスイッチが開いている)場合、X線源はオンにならず、動作中に開くと自動的にX線源がオフになります。モーターは連続スキャンを実行でき、任意の離散的な場所に移動できます。y軸のスキャン速度は通常1〜5 mm / sですが、x軸のステップサイズは通常150〜2000μmから選択できます。パラメータは、必要な空間分解能に応じて選択できます。露光時間でさえ、連続スキャンを通して一貫した速度によって確認されます。

集束されたX線ビームがX線発光粒子に照射されると、生成された光は周囲のpHに応じて光を変調することによってpH感受性膜を通過します。透過光は組織と相互作用(部分的に散乱および吸収)しますが、散乱および吸収による光減衰は、組織の厚さが増すにつれて増加します。コレクション光学系には、最初に反射アルミニウムエルボ(90°曲げと研磨された反射内面)が取り付けられたワンピースの二股アクリルライトガイドが含まれています。これは、光がライトガイドに到達するとすぐに光がコリメートされるようにするためです。これらの追加により、集光効率が大幅に向上しました。詳細については、図4にエルボとライトガイドの機械 図 を示します。90°エルボはアルミニウムから機械加工され、内面は鏡面仕上げに研磨され、ライトガイドはアクリルで機械加工されました。また、肘の始めに広範囲のロングパス青色光フィルター(350〜450nmの光を遮断)を取り付けて、赤色光のみが通過するようにしました。ワンピースのアクリルライトガイドの端は、2つの異なるPMTにつながる2つのストリームに分岐します。PMTは、PMTを~5°Cに冷却するために熱電冷却器と接触する小さな遮光金属ボックスに封入されています。 PMTの1つの開始時に、700nmの光のみを測定するために、狭い範囲のロングパスフィルター(570〜640nmの光を遮断し、640〜740nmの光を通過させる)が取り付けられています。したがって、620nmと700nmの光は別々に計算することができる。PMTはフォトンカウンティングモードで設定され、検出されたフォトンごとにトランジスタ-トランジスタロジック(TTL)パルスを生成します。DAQシステムは、USB通信を使用してパルス(飽和点2,000万パルス/秒)をカウントします。データを処理した後、2つの別々の強度マップが生成され、信号波長強度(620 nm)と参照波長強度(700 nm)の比を考慮して最終的な画像が作成されます。この比率は、集光光学系の位置、X線照射強度、組織の厚さに強く依存する総集光効率の違いを説明しています。さらに、pH指示色素のない空間的に分離された参照領域は、波長依存的な組織浸透によるスペクトル歪みを説明します。イメージングシステムの制御にはグラフィックベースのプログラミング言語が使用されており、動作の基本的なフローチャートを以下に示します。コンピュータ、X線コントローラ、およびDAQユニットを除くイメージングセットアップは、放射線被曝を最小限に抑えるために安全なX線エンクロージャに囲まれています。

プロトコル

この手順は、クレムゾン大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認された動物使用プロトコルに従います。実験は、クレムソン大学バイオセーフティ委員会(IBC)および放射線安全委員会(RSC)に従って実施され、関連するガイドラインおよび規制に従って実施されます。

注:XELCIスキャンを完了するフロー図を 以下の図5 に示し、その後にイメージング手順の詳細なステップバイステップの説明を示します。

1.システムを初期化し、プレーンX線写真を取得します

1. PMTクーラーをオンにすると、通常、設定値に達するまでに~15分かかります(例:4°C)。残りの初期化手順は、PMT をオンにする前に実行してください。
2. イメージングシステム制御ソフトウェアを開きます。制御ソフトウェアプログラムは、x-y-z軸電動ステージを通信および初期化します。ステージの X 軸と Y 軸を目的の開始位置に移動します。
3. サンプルを可動x-y-zステージに置きます。X線源および/またはステージを上下させることにより、放射発光装置がポリキャピラリーフォーカス光学系より5〜5.5cm下になるように、サンプルの高さ(z軸)を配置します。また、レーザークロスヘッド(X線集束キャピラリーに取り付けられた2つの赤い線状のレーザーポインター)を使用して標本をx-y平面に配置し、X線が焦点を合わせる場所で線が交差するように互いに90°に配置します。X線とPMTをオンにする前に、レーザーをオフにしてください。
4. 押しボタン式インターロックをイメージングエンクロージャの前面ドアに固定します。光線ソースの電源をオンにします。サンプルのプレーンX線写真を取得するための集束光学系を取り外します。
5. X線制御ソフトウェアを開き、X線パワーを設定します(電圧と電流を調整)。X線制御ソフトウェアでX線シャッターを開きます。
6. X線カメラ用のソフトウェアを開きます。露出ボタンを押して、プレーンX線写真を撮ります。露出をオフにし、X線をオフにします。
   注意: 必要に応じて、サンプルを移動してサンプルの位置を改善するか、さまざまな位置で一連のX線を取得して、照合してより大きなX線写真を取得できます view.別のシステムでX線写真を取得することもできますが、標本が移動すると、XELCIとX線撮影の間の共同登録がより困難になります。
7. エンクロージャーのドアを開きます。

2.オプションで、X線をオフにしてバックグラウンドスキャンを実行します

1. ポリキャピラリー光学系をX線源に再度接続します。
2. エンクロージャーを閉じ、インターロックを固定します。PMT 電源をオンにします。
   注意: 光に過度にさらされないように、ドアが開いているとき、または開こうとしているときはいつでも、PMT電源を常にオフにする必要があります。
3. イメージングシステム制御ソフトウェアを開き、ステップサイズ、スキャン速度、およびスキャン領域を指定します。すべてのパラメータを設定したら、[ 実行 ]ボタンを押してスキャンを開始します。
   注:高解像度スキャンの場合、ステップサイズは1000μmになり、低解像度スキャンの場合、ステップサイズは250μmになります。スキャン速度は5mm/sから1mm/sまで選択できます。スキャンの面積は、サンプルの寸法によって異なります。
4. X線をオフにしてバックグラウンドスキャンを実行し、サンプル以外のエンクロージャーに存在するライトからのダークカウントを決定します。

3.X線をオンにしてサンプルスキャンを実行します

1. スキャンを開始するには、サンプルがレーザークロスヘッドで正しい位置にあることを確認してください。
2. エンクロージャーを閉じ、インターロックを固定します。PMTがオフの場合(たとえば、ドアを開ける前にオフになっている場合)、PMT電源をオンにします。
3. イメージングシステム制御ソフトウェアを開きます。ステップサイズ、スキャン速度、スキャン領域の値を入力します。すべてのパラメータを設定したら、[ 実行 ]ボタンを押してスキャンを開始します。
   注:高解像度スキャンの場合、ステップサイズは1000μmになり、低解像度スキャンの場合、ステップサイズは250μmになります。スキャン速度は5mm/sから1mm/sまで選択できます。スキャンの面積は、サンプルの寸法によって異なります。
4. X線をオンにした状態でサンプルのスキャンを取得します。
5. まず、より大きなステップサイズとより高いスキャン速度で低解像度スキャンを実行して、ターゲットの予備画像を取得します。サンプルの目的の領域の低解像度スキャンを取得した後、より小さなステップサイズとより低いスキャン速度で高解像度スキャンを取得します。
6. ドアを開ける前に、PMT電源をオフにしてください。

4.イメージの形成

1. 現在のスキャンがターゲットの関心領域をイメージングしていることを検証します。そうでない場合は、[ 停止 ]ボタンを押して現在のスキャンを停止します。
2. 制御ソフトウェアのスキャン位置を再度調整し、[ 実行 ]ボタンをもう一度押します。
   注意: Y軸は、スキャンの最初の行から連続的に記録されます。スキャンの実行中に、各波長ごとのカウント数と、最後に更新されたモーター位置からの時間が記録されます。記録された時間は、モーター速度の変化、つまり露出時間を考慮します。ピクセルごとに、カウント/秒が正規化されます。Y軸モーターはY軸の現在の行の終わりをスキャンするために移動し、モーターは開始位置に戻ります。次に、x軸モーターは、ユーザーが定義したステップサイズだけその位置を拡大し、y軸の2行目をスキャンします。このプロセスは、x軸モーターがx方向に指定された幅に達するまで繰り返されます。ユーザーは、スキャンサイズ、モーター速度、およびモーターの開始位置を制御できます。ステップサイズは、y軸の最終画像のピクセルのサイズを決定します。

5.無菌状態でイメージングするための細菌の培養(細菌増殖センサーをイメージングする場合)

1. 黄色ブドウ球菌1945(ATCC 25923)の新鮮な培養物を調製するには、1週間以内に縞模様のTSA(トリプシン大豆寒天培地)プレートからの1つのコロニーを使用して、5 mLの滅菌トリプシン大豆ブロス(TSB)を接種します。
2. 細菌培養物を37°Cで16〜18時間、固定相になるまで穏やかに振とうします。
3. 次に、TSBからの培養物を室温(RT)で4000 x g で10分間遠心分離してペレット化し、リン酸緩衝液(PBS)でペレットを2回洗浄し、ペレットを5 mLの滅菌PBSに再懸濁します。
4. ランベルトベールの法則が検証されるOD範囲である線形範囲(OD = kN、 k は分子消滅と光路の長さに対する係数、 N は細菌濃度)を用いて、600nmでの光学濃度を用いて細菌濃度を定量化する¹⁶。次に、滅菌PBSを使用してサンプルを10⁵ 細胞/ mLに希釈します。
5. トリプシン大豆寒天培地(TSA)をオートクレーブ滅菌し、温度が45°Cに達するまで混合して冷却します。 細菌をTSAに接種します。
6. 希釈した細菌培養物(100 μL)を埋め込み型センサーの表面にピペットで貼り付けます。
   注:インプラントは、70%エタノールに5分間浸漬して滅菌し、滅菌PBSに保存しました。
7. コントロールとして、別の滅菌インプラントの上に100 μLの未接種TSAをピペットで
8. 移植前に37°Cで48時間インキュベートする前に、植込み型センサーの上に100 μLの未接種TSAを追加します。

結果

予備検討として、ウサギ死体¹⁴のリーマ脛骨に髄内ロッドセンサを画像化した。センサーには、基準領域、pH 8領域(塩基性pH)、pH 4領域(酸性pH)の3つの異なる領域があります。基準領域は、粗化処理されたエポキシフィルムに組み込まれたシンチレータ(_Gd2O2S:Eu)粒子である。特徴的な酸性および塩基性pH領域は、髄内管内の感染状況と非感染状況を表しています(...

ディスカッション

骨髄炎や二次手術による合併症を回避するために、整形外科インプラント関連感染症を早期に検出および研究できるようにするために、新しい機能的イメージング技術としてXELCIを導入しました。これは、組織を介したpHモニタリングのために現在利用可能な技術に匹敵します。

イメージングのためにサンプルを配置する際には、ポリキャピラリーフォーカシング光学系?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150