Recolección de espermatozoides y análisis de espermatozoides asistido por computadora en el modelo teleósteo japonés Medaka (Oryzias latipes)

Resumen

Este artículo describe dos métodos rápidos y eficientes para recolectar esperma del pequeño pez modelo medaka (Oryzias latipes), así como un protocolo para evaluar de manera confiable la calidad del esperma utilizando el análisis de esperma asistido por computadora (CASA).

Resumen

La medaka japonesa (Oryzias latipes) es un pez teleósteos y un modelo emergente de vertebrados para la investigación en ecotoxicología, desarrollo, genética y fisiología. Medaka también se utiliza ampliamente para investigar la reproducción de vertebrados, que es una función biológica esencial, ya que permite que una especie se perpetúe. La calidad del esperma es un indicador importante de la fertilidad masculina y, por lo tanto, del éxito de la reproducción. Las técnicas para extraer espermatozoides y el análisis de espermatozoides están bien documentadas para muchas especies, incluido el pez teleósteo. La recolección de esperma es relativamente simple en peces más grandes, pero puede ser más complicada en peces modelo pequeños, ya que producen menos espermatozoides y son más delicados. Este artículo, por lo tanto, describe dos métodos de recolección de esperma en el pequeño pez modelo, la medaka japonesa: disección de testículos y masaje abdominal. Este documento demuestra que ambos enfoques son factibles para medaka y muestra que el masaje abdominal se puede realizar un número repetido de veces a medida que los peces se recuperan rápidamente del procedimiento. Este artículo también describe un protocolo para el análisis de espermatozoides asistido por computadora en medaka para evaluar objetivamente varios indicadores importantes de la calidad del esperma medaka (motilidad, progresividad, duración de la motilidad, concentración relativa). Estos procedimientos, especificados para este útil modelo de teleósteos pequeños, mejorarán en gran medida la comprensión de los factores ambientales, fisiológicos y genéticos que influyen en la fertilidad en los machos vertebrados.

Introducción

La medaka japonesa es un pequeño pez teleósteos de agua dulce nativo del este de Asia. Medaka se ha convertido en un excelente sistema modelo de vertebrados para ecotoxicología, genética del desarrollo, genómica y biología evolutiva y estudios de fisiología ^1,2. Al igual que el popular pez cebra, son relativamente fáciles de criar y altamente resistentes a muchas enfermedades comunes de los peces ^1,2. Hay varias ventajas de usar medaka como modelo, incluyendo un corto tiempo de generación, embriones transparentes ^1,2 y un genoma secuenciado³. A diferencia del pez cebra, la medaka tiene^{un gen 4} determinante del sexo, así como una alta tolerancia a la temperatura (de 4-40 °C) y a la salinidad (especies eurihalinas)⁵. Además, muchas herramientas genéticas y anatómicas, así como los protocolos 6,7,8,9,10,11,12^, se han desarrollado en medaka para facilitar el estudio de su biología.

La reproducción es una función fisiológica esencial, ya que permite que una especie se perpetúe. La reproducción de vertebrados requiere una miríada de eventos orquestados con precisión, incluida la producción de ovocitos en las hembras y la producción de esperma en los machos. Los espermatozoides son células únicas, producidas a través del complejo proceso de espermatogénesis, en el que existen una serie de puntos de control para garantizar la entrega de un producto de alta calidad¹³. La calidad de los gametos se ha convertido en un foco en la acuicultura y los estudios de poblaciones de peces debido a su impacto en el éxito de la fertilización y la supervivencia larval. La calidad del esperma es, por lo tanto, un indicador importante de la fertilidad masculina en vertebrados.

Tres factores útiles para evaluar la calidad del esperma de los peces son la motilidad, la progresividad y la longevidad. El porcentaje de motilidad y la motilidad progresiva son indicadores comunes de la calidad del esperma, ya que el movimiento progresivo es necesario y se correlaciona fuertemente con el éxito de la fertilización^14,15. La duración del movimiento también es un indicador importante en los peces, ya que los espermatozoides permanecen completamente móviles durante menos de 2 minutos en la mayoría de las especies de teleósteos y la trayectoria de los espermatozoides es generalmente menos lineal que en los mamíferos¹⁵. Sin embargo, muchos estudios que evaluaron la motilidad de los espermatozoides en el pasado se basaron en métodos subjetivos o semicuantitativos para analizar los espermatozoides^15,16. Por ejemplo, la motilidad de los espermatozoides en medaka ha sido estimada visualmente en el pasado bajo un microscopio¹⁷. También se ha estimado mediante el registro del movimiento de los espermatozoides y el uso de software de imágenes para fusionar marcos y medir la trayectoria y la velocidad de natación^18,19,20. Tales abordajes muchas veces carecen de robustez, proporcionando resultados diferentes según la persona que realiza el análisis^15,21.

El análisis de esperma asistido por computadora (CASA) se desarrolló inicialmente para mamíferos. CASA es un método cuantitativo rápido para evaluar la calidad del esperma mediante el registro y la medición de la velocidad y la trayectoria de manera automatizada¹⁵. En peces, se ha utilizado en diferentes especies para monitorear los efectos de varios contaminantes del agua en la calidad del esperma, para identificar progenitores interesantes para mejorar los reproductores, para mejorar la eficiencia de la criopreservación y almacenamiento, y para optimizar las condiciones para la fertilización¹⁵. Por lo tanto, es una herramienta poderosa para evaluar de manera confiable la calidad del esperma en diferentes especies de vertebrados. Sin embargo, debido a la importante diversidad en las estrategias reproductivas entre los peces, el esperma de los peces teleósteos difiere del de los mamíferos y de una especie de pez a otra. Los peces teleósteos, que fertilizan principalmente los huevos externamente liberando gametos en el agua, tienen espermatozoides altamente concentrados que son relativamente simples en estructura sin acrosoma, a diferencia de los mamíferos, que fertilizan internamente y, por lo tanto, no tienen que compensar la dilución en el agua, pero sí tienen que soportar fluidos más viscosos¹⁴. Además, los espermatozoides de la mayoría de los peces se mueven rápidamente, pero son completamente móviles durante menos de 2 minutos después de la activación, aunque hay varias excepciones^15,22. Debido a que la motilidad puede disminuir rápidamente en la mayoría de los peces, se debe tener extremo cuidado con el momento del análisis después de la activación al determinar un protocolo de análisis de esperma para peces.

La reproducción es uno de los campos de la biología en los que los teleósteos y medaka se han utilizado ampliamente como organismos modelo. De hecho, los machos medaka muestran comportamientos reproductivos y sociales interesantes, como la protección de la pareja^23,24. Además, existen varias líneas transgénicas para estudiar el control neuroendocrino de la reproducción en esta especie^25,26,27. El muestreo de esperma, un procedimiento que es relativamente simple en peces más grandes, puede ser más complicado en peces modelo pequeños, ya que producen menos espermatozoides y son más delicados. Por esta razón, la mayoría de los estudios que involucran muestreo de espermatozoides en extracto de medaka (semen de pescado) mediante aplastamiento de testículos disecados 17,28,29,30. Algunos estudios también utilizan un masaje abdominal modificado para expresar la lecha directamente en el medio activador^18,19,20; Sin embargo, con este método es difícil visualizar la cantidad y el color de la lecha extraída. En el pez cebra, el masaje abdominal se usa comúnmente para expresar la lecha, que se recoge inmediatamente en un tubo capilar^31,32,33. Este método permite estimar el volumen de la leche, así como la observación del color de la eyaculación, que es un indicador rápido y simple de la calidad del esperma^32,33. Por lo tanto, falta un protocolo claro y bien descrito para la recolección y análisis de espermatozoides para medaka.

Por lo tanto, este artículo describe dos métodos de recolección de esperma en el pequeño pez modelo japonés medaka: disección de testículos y masaje abdominal con tubos capilares. Demuestra que ambos enfoques son factibles para medaka y muestra que el masaje abdominal se puede realizar un número repetido de veces a medida que el pez se recupera rápidamente del procedimiento. También describe un protocolo para el análisis de espermatozoides asistido por computadora en medaka para medir de manera confiable varios indicadores importantes de la calidad del esperma medaka (motilidad, progresividad, longevidad y concentración relativa de espermatozoides). Estos procedimientos, especificados para este útil modelo de teleósteos pequeños, mejorarán en gran medida la comprensión de los factores ambientales, fisiológicos y genéticos que influyen en la fertilidad en los machos vertebrados.

Protocolo

Toda la experimentación y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida (NMBU). Los experimentos se realizaron utilizando medaka japonesa adulta (6-9 meses de edad) macho (cepa Hd-rR) criada en NMBU (Ås, Noruega). Los métodos también se probaron brevemente en medaka japonesa macho de 9 meses de edad (cepa CAB) criada en el Instituto Nacional de Investigación para la Agricultura, la Alimentación y el Medio Ambiente (INRAE, Rennes, Francia).

1. Preparación del instrumento y de la solución

1. Preparar solución madre anestésica (0,6% de tricocaína).
   1. Diluir 0,6 g de tricocaína (MS-222) en 100 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) 10x.
   2. Alícuota 2 ml de la solución madre anestésica en tubos de plástico de 50 2 ml y conservar a -20 °C hasta su uso para anestesia o eutanasia.
2. Prepare agua de recuperación (solución de cloruro de sodio [NaCl] al 0,9%).
   1. Agregue 27 g de NaCl en 3 L de agua de acuario.
   2. Guarde la solución a temperatura ambiente (RT) hasta su uso.
3. Ajuste el medio de activación si es necesario (solución salina balanceada de Hank [HBSS]).
   NOTA: HBSS se puede comprar comercialmente o hacer en el laboratorio (Tabla de materiales).
   1. Mida el pH del HBSS usando un medidor de pH. Ajuste el pH si es necesario, utilizando ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, para que el pH final sea 7.1-7.3.
   2. Mida la osmolalidad del HBSS utilizando un osmómetro para futuros informes.
      NOTA: El rango en el producto comercial es de 266-294 mOsmol / kg; en el presente estudio, la osmolalidad fue de 287 mOsmol/kg. Se puede diluir con agua destilada para reducir la osmolalidad si se desea, pero esto no es necesario ya que no hay una gran diferencia en la activación de los espermatozoides medaka en 150-300 mOsmol / kg HBSS.
   3. Guarde la solución en RT hasta su uso.
4. Prepare la esponja de sujeción.
   1. Corte una esponja suave para que quepa perfectamente en una placa de Petri.
   2. Corte una línea recta en el centro de la esponja que sea lo suficientemente larga como para recibir al pez (3-4 cm) y aproximadamente 1 cm de profundidad (Figura 1A). Esta hendidura en la esponja sostendrá el lado ventral del pez hacia arriba para exponer la cloaca.

2. Recolección de esperma

NOTA: La recolección de espermatozoides se puede lograr mediante dos métodos diferentes: masaje abdominal o disección de testículos.

1. Recogida de espermatozoides mediante masaje abdominal
   1. Prepare una solución anestésica al 0,03% diluyendo un tubo de cepas de tricocaína (0,6%) en 38 ml de agua de acuario en un recipiente de vidrio de 100 ml.
   2. Prepare los instrumentos, incluidas las pinzas lisas de extremo romo y un conjunto de micropipeta de vidrio calibrado desechable de 10 μL y un conjunto de tubo aspirador (Figura 1A). Humedezca la esponja de sujeción preparada en el paso 1.4 con la solución anestésica.
   3. Preparar tubos con 36 μL de la solución activadora para su análisis inmediato. Precaliente la solución activadora en un baño maría o incubadora a 27 °C durante al menos 5 minutos.
      NOTA: Aunque las muestras se pueden analizar de peces individuales, la variación individual se puede reducir agrupando muestras de varios machos en la misma solución activadora. Al agrupar muestras de varios peces, use 36 μL de solución activadora por pez. Esta dilución puede necesitar ser ajustada dependiendo de la cepa o las condiciones de crianza de la medaka utilizada, ya que estos factores pueden afectar la concentración y el volumen de los espermatozoides. El programa CASA indicará si la concentración es demasiado alta para identificar los espermatozoides.
   4. Anestesiar el pescado poniéndolo en solución anestésica durante 30-90 s.
      NOTA: La duración de la anestesia debe adaptarse ya que varía según el tamaño del pez. Para asegurarse de que el pez esté completamente anestesiado, pellizque suavemente el pedúnculo caudal con fórceps. Si el pez no reacciona, se puede iniciar el masaje.
   5. Saque el pescado de la solución anestésica y use una toalla de papel o limpie suavemente para secar el abdomen del pez. Coloque el pez en el canal de la esponja húmeda con el lado ventral hacia arriba para que sus branquias queden expuestas a la solución anestésica en la esponja (Figura 1B).
   6. Si el área alrededor de la cloaca está húmeda, seque suavemente la parte inferior del pescado con una toallita desechable.
   7. Colocar el pez en la esponja de retención bajo un microscopio de disección y colocar la micropipeta con un tubo aspirador unido contra la cloaca del pez (Figura 1C).
   8. Masajear el abdomen del pez apretando suavemente con pinzas lisas de extremo romo en un movimiento rostral a caudal mientras se succiona simultáneamente para recoger la lecha expulsada en la pipeta (Figura 1D).
   9. Suelte el pez de la esponja en el agua de recuperación. Permítales recuperarse en la solución durante al menos 15 minutos antes de devolverlos al sistema del acuario.
   10. Transfiera la lecha a un tubo preparado con solución activadora precalentada y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces succionando y soplando el conjunto del tubo aspirador.
   11. Homogeneice suavemente los espermatozoides diluidos moviendo los tubos antes del análisis.
       NOTA: Para obtener los mejores resultados, analice las muestras inmediatamente (por ejemplo, 5 s) después de la activación. En medaka, el análisis puede retrasarse, si es necesario, ya que los espermatozoides permanecen móviles durante varias horas, pero el tiempo debe permanecer constante entre las muestras a medida que la motilidad disminuye con el tiempo.
2. Recolección de espermatozoides por disección de testículos
   1. Prepare una solución de eutanasia al 0,08% diluyendo dos tubos de caldo de tricocaína (0,6%) en 26 ml de agua de acuario en un recipiente de vidrio de 100 ml.
   2. Prepare herramientas de disección, incluyendo pinzas romas y finas y tijeras pequeñas para disección (Figura 1E).
   3. Preparar un tubo para cada muestra con 120 μL de solución activadora para su análisis inmediato. Precaliente la solución activadora en un baño maría o incubadora a 27 °C durante al menos 5 minutos.
      NOTA: Aunque las muestras se pueden analizar de peces individuales, la variación individual se puede reducir agrupando muestras de varios machos en la misma solución activadora. Para agrupar muestras de varios peces, use 120 μL de solución activadora por pez. Esta dilución puede necesitar ser ajustada dependiendo de la cepa o las condiciones de crianza de la medaka utilizada, ya que estos factores pueden afectar la concentración y el volumen de los espermatozoides. El programa CASA indicará si la concentración es demasiado alta para identificar los espermatozoides.
   4. Eutanasia del pescado poniéndolo en la solución anestésica al 0,08% durante 30-90 s.
      NOTA: La duración depende del tamaño del pez. Para asegurarse de que el pez sea sacrificado, espere a que cesen los movimientos del opérculo. El pez no debe reaccionar al tacto de los fórceps.
   5. Retire el pescado de la solución de eutanasia y séquelo suavemente con una toalla de papel o limpie suavemente.
      NOTA: En este paso, se puede pesar el pez para posteriormente calcular el índice gonadosomático (GSI, peso gonadal / peso corporal).
   6. Coloque el pez bajo un microscopio de disección con su lado lateral izquierdo hacia arriba (Figura 1F).
   7. Usando pequeñas tijeras de disección, corte un colgajo dorsalmente desde la cloaca, y luego a través de las costillas hasta las branquias para exponer los órganos internos (Figura 1G).
   8. Localice los testículos, corte el accesorio en ambos extremos con pinzas finas y retire los testículos (Figura 1H).
      NOTA: Para calcular el GSI, los testículos se pueden pesar en este paso. Trabaje rápidamente para evitar el secado del tejido.
   9. Transfiera los testículos a un tubo preparado con la solución activadora precalentada.
   10. Use fórceps para aplastar los testículos varias veces contra el costado del tubo para liberar los espermatozoides. La liberación de espermatozoides generalmente se puede visualizar y hará que la solución sea ligeramente turbia.
   11. Homogeneice suavemente los espermatozoides diluidos moviendo los tubos antes del análisis.
       NOTA: Para obtener los mejores resultados, analice las muestras inmediatamente (por ejemplo, 5 s) después de la activación. En medaka, el análisis puede retrasarse, si es necesario, ya que los espermatozoides permanecen móviles durante varias horas, pero el tiempo debe permanecer constante entre las muestras a medida que la motilidad disminuye con el tiempo.

Figura 1: Recolección de lecha mediante masaje abdominal (A-D) y disección testicular (E-H). (A) Instrumentos para masaje abdominal: esponja de sujeción, pinzas lisas romas y micropipeta de vidrio calibrada desechable de 10 μL con conjunto de tubo aspirador; (B) Posición de los peces en la esponja de retención, con las branquias expuestas a anestesia en la esponja y la cloaca hacia arriba; C) Colocación de fórceps lisos romos en el abdomen y micropipeta contra la cloaca; (D) Suave en micropipeta después de un suave masaje y succión. (E) Instrumentos para la disección de testículos: fórceps romos, fórceps finos y tijeras pequeñas de disección; (F) Posición de los peces para la disección de testículos; G) Vista lateral de los órganos internos; (H) Retire los testículos cortando el accesorio en ambos extremos con pinzas finas. Barra de escala: 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Análisis de espermatozoides con sistema CASA

1. El sistema CASA (SCA Evolution) debe configurarse de acuerdo con el manual con un microscopio utilizando un filtro verde y un objetivo 10x con contraste de fase.
2. Preparar portaobjetos desechables de cámara de conteo de 20 μm precalentando en una placa de calentamiento o en una incubadora a 27 °C durante al menos 5 min.
3. Abra el software de análisis de esperma y seleccione el módulo de motilidad.
4. Establezca la configuración para el medaka como se muestra en la Figura 2B.
5. Coloque un portaobjetos desechable precalentado de la cámara de conteo de 20 μm bajo el microscopio en una platina calentada ajustada a 27 °C.
6. Pipete la muestra en la cámara del portaobjetos hasta que llene la cámara sin sobrellenarla. Limpie cuidadosamente el exceso de muestras de la entrada de la cámara con una punta de algodón o limpie suavemente para evitar que queden células flotantes.
7. Seleccione Analizar para observar la muestra bajo el microscopio.
   NOTA: Si el icono del microscopio es rojo, la iluminación del microscopio debe ajustarse para que el programa rastree los espermatozoides con precisión. Ajuste el brillo del microscopio, para que el movimiento de la cola de los espermatozoides se vea claramente. El icono debe ser azul.
8. Asegúrese de que el microscopio esté enfocado y seleccione Analizar nuevamente para registrar los espermatozoides en el campo. Mueva la diapositiva para que quede una nueva área de la muestra en el marco y repita para capturar de 3 a 5 campos de visión diferentes. Evite los campos con burbujas de aire, masas celulares o artefactos.
9. Seleccione Resultados para ver los resultados.
   NOTA: Si los campos de la página de resultados están delineados en rojo, siga las indicaciones del sistema para eliminar los campos que varían demasiado en concentración o motilidad.
10. Haga doble clic en un campo para ver los resultados del campo individual o para comprobar manualmente si hay espermatozoides mal etiquetados o no rastreados. Haga clic derecho en los espermatozoides individuales para volver a etiquetar la motilidad, si es necesario (Figura 2A).

Figura 2: Captura de pantalla del software SCA Evolution . (A) Resultados de seguimiento de espermatozoides para un campo. Ver datos de campo en el lado derecho y hacer doble clic en los espermatozoides para ver los datos individuales; (B) Resumen de resultados para todos los campos con el menú de configuración abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Tipo de datos obtenidos
El análisis de la motilidad de los espermatozoides del software SCA Evolution proporciona datos sobre la motilidad (porcentaje de espermatozoides móviles e inmóviles), así como la progresividad (porcentaje de espermatozoides progresivos y no progresivos) y la velocidad (porcentaje de espermatozoides de movimiento rápido, medio y lento). También combina progresividad y velocidad (progresiva rápida, progresiva media, no progresiva). Estas etiquetas se basan en mediciones (...

Discusión

La osmolalidad es un factor importante en la activación de los espermatozoides de peces^36,37. Generalmente, los espermatozoides son inmóviles en los testículos y se vuelven móviles en medios que son hiperosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces marinos, e hipoosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces de agua dulce³⁷. Al igual que en la sangre, el plasma seminal en los peces de agua dulce es t?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040