硬骨動物モデルにおける精子採取とコンピュータ支援精子解析 メダカ

要約

この記事では、小型モデル魚メダカ(Oryzias latipes)から精子を採取するための2つの迅速かつ効率的な方法と、コンピューター支援精子分析(CASA)を使用して精子の質を確実に評価するためのプロトコルについて説明します。

要約

日本のメダカ(Oryzias latipes)は、硬骨魚であり、生態毒性学、発生学、遺伝学、生理学の研究のための新しい脊椎動物モデルです。メダカは脊椎動物の繁殖を調べるためにも広く使用されており、これは種が永続することを可能にするため、不可欠な生物学的機能です。精子の質は男性の生殖能力、したがって生殖の成功の重要な指標です。精子を抽出するための技術と精子分析は、硬骨魚を含む多くの種について十分に文書化されています。精子の採取は、大きな魚では比較的簡単ですが、小さなモデル魚では精子が少なく、繊細であるため、より複雑になる可能性があります。そこで本稿では、小型モデル魚であるメダカの精子採取方法について、精巣解離と腹筋マッサージの2つについて述べる。本稿では、メダカに対して両方のアプローチが実行可能であることを示し、魚が手順からすぐに回復するため、腹部マッサージを何度も繰り返し実行できることを示しています。この記事では、メダカの精子の質のいくつかの重要な指標(運動性、進行性、運動持続時間、相対濃度)を客観的に評価するための、メダカでのコンピューター支援精子分析のプロトコルについても説明します。この有用な小型硬骨動物モデルのために指定されたこれらの手順は、脊椎動物の男性の生殖能力に影響を与える環境的、生理学的、および遺伝的要因の理解を大幅に強化します。

概要

日本のメダカは、東アジア原産の小さな産卵淡水硬骨魚です。メダカは、生態毒性学、発生遺伝学、ゲノミクス、進化生物学および生理学研究のための優れた脊椎動物モデルシステムになりました^1,2。人気のあるゼブラフィッシュと同様に、それらは比較的繁殖しやすく、多くの一般的な魚の病気に対して非常に耐性があります^1,2。メダカをモデルとして使用することには、世代時間が短い、透明な胚^1,2、配列決定されたゲノム³など、いくつかの利点があります。ゼブラフィッシュとは異なり、メダカは性決定遺伝子4と高温(⁴〜40°C)および塩分(ユーリハリン種)耐性⁵を持っています。また、多くの遺伝的および解剖学的ツール、ならびにプロトコル6,7,8,9,10,11,12がメダカで開発され、その生物学の研究を容易にする。

生殖は、種が永続することを可能にするため、不可欠な生理学的機能です。脊椎動物の繁殖には、雌の卵母細胞の産生や雄の精子の産生など、正確に調整された無数のイベントが必要です。精子は、精子形成の複雑なプロセスを通じて生成されるユニークな細胞であり、高品質の製品の配送を保証するためにいくつかのチェックポイントがあります¹³。配偶子の品質は、受精の成功と幼虫の生存に影響を与えるため、水産養殖と魚の個体数研究の焦点となっています。したがって、精子の質は脊椎動物の男性の生殖能力の重要な指標です。

魚の精子の質を評価するための3つの有用な要素は、運動性、進行性、および寿命です。運動率と進行性運動性は、漸進的な運動が受精の成功に必要であり、強く相関しているため、精子の質の一般的な指標です^14,15。ほとんどの硬骨魚種で精子が2分未満完全に運動したままであり、精子の軌跡は一般に哺乳類よりも直線的ではないため、移動時間も魚の重要な指標です¹⁵。しかし、過去に精子の運動性を評価した多くの研究は、精子を分析する主観的または半定量的方法に依存していました^15,16。例えば、メダカの精子運動性は、過去に顕微鏡下で目視で推定されてきた¹⁷。また、精子の動きを記録し、イメージングソフトウェアを使用してフレームをマージし、遊泳経路と速度を測定することによって推定されています^18,19,20。そのようなアプローチはしばしば堅牢性を欠き、分析を実行する人に応じて異なる結果を提供する^15,21。

コンピュータ支援精子分析(CASA)は、当初哺乳類向けに開発されました。CASAは、速度と軌跡を自動化された方法で記録および測定することにより、精子の質を評価するための迅速な定量的方法です¹⁵。魚類では、精子の質に対するいくつかの水質汚染物質の影響を監視し、家畜を改善するための興味深い前駆細胞を特定し、凍結保存と貯蔵の効率を改善し、受精の条件を最適化するために、さまざまな種で使用されてきました¹⁵。したがって、さまざまな脊椎動物種の精子の品質を確実に評価するための強力なツールです。しかし、魚類間の繁殖戦略の重要な多様性のために、硬骨魚の精子は哺乳類の精子とは異なり、魚種ごとに異なります。配偶子を水中に放出することによって主に卵子を外部から受精させる硬骨魚は、内部で受精するため、水中での希釈を補う必要はありませんが、より粘性のある液体に耐える必要がある哺乳類とは異なり、先体のない構造が比較的単純な高濃度の精子を持っています¹⁴。さらに、ほとんどの魚の精子は急速に動きますが、活性化後2分未満は完全に運動しますが、いくつかの例外があります^15,22。ほとんどの魚で運動性が急速に低下する可能性があるため、魚の精子分析プロトコルを決定する際には、活性化後の分析のタイミングに細心の注意を払う必要があります。

生殖は生物学の中でも、硬骨魚やメダカがモデル生物として広く利用されてきた分野の一つです。確かに、メダカの男性は、配偶者を守る^23,24など、興味深い生殖行動と社会的行動を示します。さらに、この種の生殖の神経内分泌制御を研究するために、いくつかのトランスジェニック系統が存在する^25,26,27。精子サンプリングは、大きな魚では比較的簡単な手順ですが、小さなモデル魚では精子が少なく、繊細であるため、より複雑になる可能性があります。このため、メダカ抽出物白子(魚精液)における精子採取を含むほとんどの研究は、解剖精巣を粉砕することによって¹⁷、^28、29、30である。いくつかの研究では、整形腹部マッサージを使用して、白子を活性化培地に直接表現しています^18,19,20;しかし、この方法では、抽出された白子の量と色を視覚化することは困難です。ゼブラフィッシュでは、腹部マッサージは白子を表現するために一般的に使用され、これは直ちに毛細管^31、32、33に集められる。この方法は、白子の体積の推定、ならびに精子の質の迅速かつ簡単な指標である射精色の観察を可能にする^32,33。したがって、精子の収集と分析のための明確でよく記述されたプロトコルは、メダカには欠けています。

そこで本稿では,小型モデル魚メダカにおける精巣郭清と毛細血管による腹式マッサージの2つの精子採取方法について述べる.これは、両方のアプローチがメダカにとって実行可能であることを示し、魚が手順からすぐに回復するため、腹部マッサージを何度も繰り返すことができることを示しています。また、メダカの精子の質(運動性、進行性、寿命、および相対的な精子濃度)のいくつかの重要な指標を確実に測定するためのメダカでのコンピューター支援精子分析のプロトコルについても説明します。この有用な小型硬骨動物モデルのために指定されたこれらの手順は、脊椎動物の男性の生殖能力に影響を与える環境的、生理学的、および遺伝的要因の理解を大幅に強化します。

プロトコル

すべての実験と動物の取り扱いは、ノルウェー生命科学大学(NMBU)の実験動物福祉に関する推奨事項に従って実施されました。実験は、NMBU(ノルウェー、オース)で飼育された成体(6〜9ヶ月齢)のオスの日本メダカ(Hd-rR株)を用いて行った。また、国立研究開発法人農業・食品・環境研究所(INRAE、フランス、レンヌ)で飼育した生後9ヶ月のオスのメダカ(CAB株)でも簡単に試験した。

1. 装置と溶液の調製

1. 麻酔薬ストック溶液(0.6%トリカイン)を準備します。
   1. 0.6 gのトリカイン(MS-222)を100 mLの10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈します。
   2. 2 mLの麻酔薬ストック溶液を50 2 mLプラスチックチューブに分注し、麻酔または安楽死に使用するまで-20°Cで保存します。
2. 回収水(0.9%塩化ナトリウム[NaCl]溶液)を準備します。
   1. 27 gのNaClを3 Lの水槽水に加えます。
   2. 使用するまで室温(RT)で溶液を保管してください。
3. 必要に応じて活性化培地を調整します(ハンクの平衡塩溶液[HBSS])。
   注:HBSSは、商業的に購入することも、実験室で製造することもできます(材料表)。
   1. pHメーターを使用してHBSSのpHを測定します。必要に応じて塩酸または水酸化ナトリウムを使用してpHを調整し、最終的なpHが7.1〜7.3になるようにします。
   2. 将来の報告のために、浸透圧計を使用してHBSSの浸透圧を測定します。
      注:市販製品の範囲は266-294 mOsmol / kgです。現在の研究では、浸透圧は287mOsmol / kgでした。必要に応じて蒸留水で希釈して浸透圧を下げることもできますが、150〜300 mOsmol / kg HBSSではメダカ精子の活性化に大きな差がないため、これは必要ありません。
   3. 使用するまでRTで溶液を保管してください。
4. 保持スポンジを準備します。
   1. 柔らかいスポンジをペトリ皿にぴったりと収まるように切ります。
   2. スポンジの中央に、魚を受け入れるのに十分な長さ(3〜4 cm)、深さ約1 cmの直線を切ります(図1A)。スポンジのこのスリットは、魚の腹側を上にしてクロアカを露出させます。

2.精子採取

注:精子の収集は、腹部マッサージまたは精巣解剖の2つの異なる方法で達成できます。

1. 腹部マッサージによる精子採取
   1. 1本のチューブのトリカインストック(0.6%)を100 mLのガラス容器内の38 mLの水槽水で希釈することにより、0.03%麻酔液を調製します。
   2. 平滑端平滑鉗子、10 μLの使い捨て校正済みガラスマイクロピペットおよびアスピレーターチューブアセンブリを含む機器を準備します(図1A)。手順1.4で準備した保持スポンジを麻酔液で湿らせます。
   3. すぐに分析できるように、36 μLの活性化溶液でチューブを準備します。活性化溶液を27°Cに設定された水浴またはインキュベーターで少なくとも5分間予熱します。
      注:サンプルは個々の魚から分析できますが、同じ活性化溶液に複数のオスからのサンプルをプールすることで、個体差を減らすことができます。複数の魚からのサンプルをプールする場合は、魚ごとに36 μLの活性化溶液を使用します。この希釈は、精子の濃度や量に影響を与える可能性があるため、使用するメダカのひずみや飼育条件に応じて調整する必要があります。CASAプログラムは、濃度が高すぎて精子を特定できないかどうかを示します。
   4. 魚を麻酔液に30〜90秒間入れて麻酔します。
      注:麻酔時間は魚のサイズによって異なるため、調整する必要があります。魚が完全に麻酔されていることを確実にするために、鉗子で尾の茎をそっとつまみます。魚が反応しない場合は、マッサージを開始できます。
   5. 麻酔液から魚を取り出し、ペーパータオルを使用するか、そっと拭いて魚の腹部を乾かします。湿った保持スポンジの腹側を上にして、魚の谷がスポンジの麻酔液にさらされるように、魚を置きます(図1B)。
   6. クロアカの周りが濡れている場合は、使い捨てのティッシュワイプで魚の下側をそっと乾かします。
   7. 解剖顕微鏡下で魚を保持スポンジに入れ、魚のクロアカにアスピレーターチューブを取り付けたマイクロピペットを置きます(図1C)。
   8. 鈍い端の滑らかな鉗子で吻側から尾側への動きでそっと絞ると同時に、排出された白子をピペットに集めるために吸いながら、魚の腹部をマッサージします(図1D)。
   9. 魚をスポンジから回収水に放します。水槽システムに戻す前に、少なくとも15分間溶液中で回復させてください。
   10. 白子を予熱した活性化溶液を入れた準備されたチューブに移し、アスピレーターチューブアセンブリを吸ったり吹いたりして数回上下にピペットします。
   11. 分析前にチューブをフリックして、希釈した精子を穏やかに均質化します。
       注意: 最良の結果を得るには、アクティベーション後すぐに(たとえば、5秒)サンプルを分析してください。メダカでは、精子が数時間運動性を維持するため、必要に応じて分析を遅らせることがありますが、運動性は時間とともに低下するため、サンプル間で時間は一定である必要があります。
2. 精巣解剖による精子採取
   1. 100 mLガラス容器中の2本のチューブのトリカインストック(0.6%)を26 mLの水槽水で希釈することにより、0.08%安楽死溶液を調製します。
   2. 鈍くて細かい鉗子や小さな解剖ハサミなどの解剖ツールを準備します(図1E)。
   3. 即時分析のために、120 μLの活性化溶液を含む各サンプル用のチューブを準備します。活性化溶液を27°Cに設定された水浴またはインキュベーターで少なくとも5分間予熱します。
      注:サンプルは個々の魚から分析できますが、同じ活性化溶液に複数のオスからのサンプルをプールすることで、個体差を減らすことができます。複数の魚からのサンプルをプールするには、魚ごとに120 μLの活性化溶液を使用します。この希釈は、精子の濃度や量に影響を与える可能性があるため、使用するメダカのひずみや飼育条件に応じて調整する必要があります。CASAプログラムは、濃度が高すぎて精子を特定できないかどうかを示します。
   4. 魚を0.08%麻酔液に30〜90秒間入れて安楽死させます。
      注:期間は魚のサイズによって異なります。魚が安楽死させられることを確実にするために、オペラキュラムの動きが止まるのを待ちます。魚は鉗子のタッチに反応してはいけません。
   5. 安楽死液から魚を取り除き、ペーパータオルで魚をやさしく乾かすか、やさしく拭きます。
      注:このステップでは、魚の体重を量って、後で性腺体指数(GSI、生殖腺重量/体重)を計算することができます。
   6. 魚を解剖顕微鏡の下に置き、左側の側面を上に向けています(図1F)。
   7. 小さな解剖ハサミを使用して、クロアカから背側のフラップを切り取り、次に肋骨を横切ってえらまで内臓を露出させます(図1G)。
   8. 精巣を見つけ、両端のアタッチメントを細かい鉗子で切断し、精巣を取り外します(図1H)。
      注:GSIを計算するために、このステップで精巣を計量することができます。組織の乾燥を避けるために迅速に作業してください。
   9. 予熱した活性化溶液と共に調製したチューブに精巣を移す。
   10. 鉗子を使用して精巣をチューブの側面に対して数回押しつぶし、精子を放出します。精子の放出は通常視覚化することができ、溶液をわずかに曇らせます。
   11. 分析前にチューブをフリックして、希釈した精子を穏やかに均質化します。
       注意: 最良の結果を得るには、アクティベーション後すぐに(たとえば、5秒)サンプルを分析してください。メダカでは、精子が数時間運動性を維持するため、必要に応じて分析を遅らせることがありますが、運動性は時間とともに低下するため、サンプル間で時間は一定である必要があります。

図1:腹部マッサージ(A-D)と精巣解剖(E-H)による白子採取 。 (A)腹部マッサージ用器具:スポンジ、鈍い滑らかな鉗子、およびアスピレーターチューブアセンブリを備えた10μLの使い捨て校正済みガラスマイクロピペットを保持します。(B)保持スポンジ内の魚の位置、スポンジ内の麻酔にさらされた鰓、およびクロアカが上を向いている。(C)腹部の鈍い滑らかな鉗子の位置とクロアカに対するマイクロピペット。(D)穏やかなマッサージと吸引後のマイクロピペットで白子。(E)精巣解剖用器具:鈍器鉗子、細鉗子、および小型解剖ハサミ。(F)精巣解剖のための魚の位置。(G)内臓の側面図。(h)両端のアタッチメントを細かい鉗子で切って精巣を取り除きます。スケールバー:2 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. CASAシステムによる精子分析

1. CASAシステム(SCA Evolution)は、緑色のフィルターを使用した顕微鏡と位相差のある10倍の対物レンズを使用して、マニュアルに従ってセットアップする必要があります。
2. 使い捨ての20 μm計数チャンバースライドを、加温プレートまたは27°Cに設定されたインキュベーターで少なくとも5分間予熱して準備します。
3. 精子分析ソフトウェアを開き、運動性モジュールを選択します。
4. メダカの構成を 図2Bのように設定します。
5. 予熱した使い捨ての20 μm計数チャンバースライドを、27°Cに設定された加熱ステージ上に顕微鏡下に置きます。
6. サンプルをスライド上のチャンバーにピペットで入れ、過充填せずにチャンバーを満たします。チャンバーの入り口から余分なサンプルを綿の先端で慎重に拭き取るか、細胞の浮遊を防ぐためにそっと拭きます。
7. [ 分析] を選択して、顕微鏡でサンプルを確認します。
   注意: 顕微鏡アイコンが赤の場合、精子を正確に追跡するために、プログラムが顕微鏡の照明を調整する必要があります。顕微鏡の明るさを調整して、精子の尾の動きがはっきりと見えるようにします。アイコンは青色である必要があります。
8. 顕微鏡の焦点が合っていることを確認し、もう一度 [分析] を選択して、フィールドの精子を記録します。サンプルの新しい領域がフレーム内になるようにスライドを移動し、繰り返して3〜5の異なる視野をキャプチャします。気泡、細胞塊、またはアーチファクトのあるフィールドは避けてください。
9. [ 結果 ] を選択して結果を表示します。
   注: 結果ページのフィールドが赤で囲まれている場合は、システムの指示に従って、濃度または運動性が大きく異なるフィールドを削除します。
10. フィールドをダブルクリックして、個々のフィールドの結果を表示するか、ラベル付けされていない精子や追跡されていない精子を手動で確認します。必要に応じて、個々の精子を右クリックして運動性を再ラベル付けします(図2A)。

図2:SCAエボリューションソフトウェアのスクリーンショット 。 (A)1つのフィールドの精子追跡結果。右側のフィールドデータを表示し、精子をダブルクリックして個々のデータを表示します。(B) 設定メニューが開いているすべてのフィールドの結果の概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

取得するデータの種類
SCA Evolutionソフトウェアの精子運動性分析は、運動性(運動性および不動性の精子の割合)、および進行性(進行性および非進行性の精子の割合)、および速度(急速、中、およびゆっくりと動く精子の割合)に関するデータを提供します。また、プログレッシブと速度(ラピッドプログレッシブ、ミディアムプログレッシブ、非プログレッシブ)を兼ね備えていま?...

ディスカッション

浸透圧は、魚の精子の活性化における重要な要素^です36,37。一般に、精子は精巣内で不動であり、海産魚では精液に対して高浸透圧性であり、淡水魚では精液に対して低浸透圧性である培地中で運動性になる³⁷。血液と同様に、淡水魚の精漿は通常、海産魚の精漿よりも低い(400 mOsmol / kgと比較して約300 mOsmol / kg)^22,37

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040