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Resumen

Aquí, describimos el método para establecer un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica basado en células endoteliales microvasculares primarias del cerebro humano, astrocitos y pericitos. Este modelo multicelular es adecuado para estudios de disfunción de unidades neurovasculares durante el ictus isquémico in vitro o para el cribado de candidatos a fármacos.

Resumen

El accidente cerebrovascular isquémico es una causa importante de muerte y discapacidad en todo el mundo con opciones terapéuticas limitadas. La neuropatología del accidente cerebrovascular isquémico se caracteriza por una interrupción en el suministro de sangre al cerebro que conduce a la muerte celular y la disfunción cognitiva. Durante y después del accidente cerebrovascular isquémico, la disfunción de la barrera hematoencefálica (BHE) facilita la progresión de la lesión y contribuye a una recuperación deficiente del paciente. Los modelos actuales de BBB incluyen principalmente monocultivos endoteliales y cocultivos dobles con astrocitos o pericitos.

Tales modelos carecen de la capacidad de imitar completamente un microambiente cerebral dinámico, que es esencial para la comunicación de célula a célula. Además, los modelos de BBB comúnmente utilizados a menudo contienen células endoteliales humanas inmortalizadas o cultivos celulares derivados de animales (roedores, porcinos o bovinos) que plantean limitaciones de traducción. Este artículo describe un nuevo modelo de BBB basado en bien insertados que contiene solo células humanas primarias (células endoteliales microvasculares cerebrales, astrocitos y pericitos vasculares cerebrales) que permite la investigación de la lesión cerebral isquémica in vitro.

Los efectos de la privación de oxígeno-glucosa (OGD) sobre la integridad de la barrera se evaluaron mediante mediciones de permeabilidad pasiva, resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y visualización directa de células hipóxicas. El protocolo presentado ofrece una clara ventaja al imitar el entorno intercelular de la BHE in vivo, sirviendo como un modelo de BHE in vitro más realista para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas en el contexto de la lesión cerebral isquémica.

Introducción

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad a largo plazo en todo el mundo1. La incidencia de accidente cerebrovascular aumenta rápidamente con la edad, duplicándose cada 10 años después de los 55 años2. El accidente cerebrovascular isquémico ocurre como resultado de la interrupción del flujo sanguíneo cerebral debido a eventos trombóticos y embólicos, que abarca más del 80% de todos los casos de accidente cerebrovascular3. Incluso ahora, hay relativamente pocas opciones de tratamiento disponibles para minimizar la muerte del tejido después de un accidente cerebrovascular isquémico. Los tratamientos que existen son sensibles al tiempo y, en consecuencia, no siempre conducen a buenos resultados clínicos. Por lo tanto, se necesita urgentemente investigación sobre los mecanismos celulares complejos del accidente cerebrovascular isquémico que afectan la recuperación posterior al accidente cerebrovascular.

La barrera hematoencefálica es una interfaz dinámica para el intercambio de moléculas entre la sangre y el parénquima cerebral. Estructuralmente, la BHE está compuesta por células endoteliales microvasculares cerebrales interconectadas por complejos de unión rodeados por una membrana basal, pericitos y patas terminales astrocíticas4. Los pericitos y astrocitos juegan un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica a través de la secreción de diversos factores necesarios para la formación de uniones fuertes y estrechas 5,6. La ruptura de la barrera hematoencefálica es una de las características distintivas del accidente cerebrovascular isquémico. La respuesta inflamatoria aguda y el estrés oxidativo asociado con la isquemia cerebral dan como resultado la interrupción de los complejos de proteínas de unión estrecha y la diafonía desregulada entre astrocitos, pericitos y células endoteliales, lo que conduce a una mayor permeabilidad al soluto paracelular a través de la barrera hematoencefálica7. La disfunción BBB promueve aún más la formación de edema cerebral y aumenta el riesgo de transformación hemorrágica8. Teniendo en cuenta todo lo anterior, existe un gran interés en comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren a nivel de BBB durante y después del accidente cerebrovascular isquémico.

Aunque muchos modelos de BBB in vitro han sido desarrollados en las últimas décadas y utilizados en una variedad de estudios, ninguno de ellos puede replicar completamente las condiciones in vivo 9. Si bien algunos modelos se basan en monocapas de células endoteliales cultivadas en soportes permeables bien insertados solos o en combinación con pericitos o astrocitos, solo estudios más recientes han introducido diseños de modelos de cultivo celular triple. Casi todos los modelos existentes de triple cultivo de BBB incorporan células endoteliales cerebrales primarias junto con astrocitos y pericitos aislados de especies animales o células derivadas de células madre pluripotentes humanas10,11,12,13.

Reconociendo la necesidad de recapitular mejor la BHE humana in vitro, establecimos un modelo de triple cultivo celular in vitro BBB compuesto por células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC), astrocitos humanos primarios (HA) y pericitos vasculares cerebrales humanos primarios (HBVP). Este modelo BBB de triple cultivo se configura en placas de 6 pocillos, insertos de membrana de poliéster con un tamaño de poro de 0,4 μm. Estos insertos de pozo proporcionan un entorno óptimo para la unión celular y permiten un fácil acceso a los compartimentos apical (sangre) y basolateral (cerebro) para el muestreo del medio o la aplicación de compuestos. Las características de este modelo propuesto de BBB de cultivo triple celular se evalúan midiendo TEER y flujo paracelular después de OGD imitando el accidente cerebrovascular isquémico in vitro, con una escasez de oxígeno (<1%O2) y nutrientes (mediante el uso de medio libre de glucosa) lograda mediante el uso de una cámara humidificada y sellada. Además, las condiciones isquémicas inducidas en este modelo se verifican con precisión mediante la visualización directa de células hipóxicas.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todas las células, materiales, equipos y soluciones utilizados en este protocolo.

1. Ajuste del modelo BBB de cultivo celular triple

  1. Siembra de pericitos
    1. Cultivar HBVP en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta que sea confluente. Una vez alcanzada la confluencia, aspire el medio pericito viejo y lave las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Aspirar el DPBS y separar las células del matraz utilizando una combinación de 4 ml de solución tibia de tripsina-EDTA y 1 ml de DPBS.
      NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P7.
    2. Incubar el matraz durante 5 min a 37 °C en una incubadora deCO2 . Ver bajo un microscopio para confirmar si las células están separadas del matraz. Añadir 5 ml de medio de pericito caliente (que contenga 2% de suero fetal bovino [FBS]) al matraz y transferir las células desprendidas a un tubo de centrífuga de 50 ml.
    3. Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 200 × g, permitiendo que las células formen un pellet en el fondo del tubo. Aspire el medio del tubo, asegurándose de que el pellet de la célula permanezca intacto.
    4. Resuspender el pellet celular en medio pericito; Calcule la cantidad de medio dependiendo de la confluencia de las células y el número de insertos de pozo necesarios. Tome 10 μL de las células resuspendidas, colóquelas en un portaobjetos de conteo de células y cuente el número de células.
    5. Determinar la densidad celular y sembrar 300.000 células/inserto en 1 mL de medio pericito en el lado abluminal de los insertos de pozo (formato de 6 pocillos).
      NOTA: Al sembrar HBVP en la parte inferior de los insertos, es muy importante voltear primero las placas de inserción de pozo al revés. Mientras la placa se coloca plana sobre una superficie, retire la sección inferior para exponer el lado abluminal de los insertos del pozo. Después de agregar la suspensión de células pericitarias en el lado abluminal, cubra los insertos de pozo con la placa volteada para evitar la evaporación. Mantener todas las placas boca abajo en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante la noche.
  2. Siembra de astrocitos
    1. Cultivar HA en matraces T75 dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta alcanzar la confluencia. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando medio de astrocito (que también contiene 2% de FBS) en lugar de medio de pericito.
      NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P9.
    2. Determinar la densidad celular y sembrar 300.000 células/pocillo en el fondo de las placas de cultivo de tejido de 6 pocillos. Cubra la placa para evitar la evaporación y mantenga todas las placas en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante la noche.
  3. Siembra de células endoteliales
    1. Cultivar HBMEC en placas de cultivo de tejidos dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta que sea confluente. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando un medio clásico completo (que contenga un 10% de FBS) en lugar de un medio pericito.
      NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P12.
    2. Extraer las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos que contienen astrocitos y los insertos de pocillos (formato de 6 pocillos) que contienen pericitos de la incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Aspirar el medio astrocito a partir de las placas de cultivo de tejido de 6 pocillos. Agregue 1 ml de medio de pericito y 1 ml de medio de astrocito a cada pocillo.
    3. Aspirar el medio pericito de los insertos de pocillos y colocarlos en las placas de cultivo de tejido de 6 pocillos que contienen los astrocitos sembrados. Semilla de HBMEC a una densidad de 300.000 células/pocillo en 2 ml de medio clásico completo en el lado apical de los mismos insertos de pozo.
      NOTA: Las células endoteliales deben sembrarse en el lado apical de los insertos de pocillos al día siguiente después de sembrar pericitos en el lado abluminal de los insertos de pocillos y astrocitos en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos. Las células deben mantenerse en cultivo triple durante 6 días para inducir propiedades similares a las de la barrera hematoencefálica. El medio de cultivo celular debe cambiarse en ambos compartimentos bien insertados 24 h antes de los experimentos.

2. Inducción de la privación de oxígeno-glucosa

  1. Lave las celdas 3 veces con DPBS. Para cultivos celulares triples sometidos a OGD, añadir medio libre de glucosa (sin L-glutamina y rojo fenol) a los compartimentos apical y basolateral. Sustituir el medio de cultivo por medio fresco en cultivos celulares de control normóxico. Colocar cultivos triples de control en la incubadora deCO2 al 5% a 37 °C.
    NOTA: Los cambios en el medio antes de la inducción de la OGD o inmediatamente después de la OGD pueden crear estrés mecánico que afectaría aún más a las monocapas de células endoteliales. Por lo tanto, se incluyen los pasos con reemplazo medio para cultivos celulares de control normóxico.
  2. Coloque una placa de Petri que contenga 20 ml de agua estéril en la cámara de la incubadora de hipoxia para proporcionar una humidificación adecuada de los cultivos. Abra la cámara soltando la abrazadera del anillo. Coloque los cultivos celulares en los estantes. Selle la cámara asegurando la abrazadera del anillo.
  3. Abra los puertos de entrada y salida de la cámara. Conecte el tubo que viene de la parte superior del medidor de flujo a la cámara. Conecte el tubo proveniente de la parte inferior del medidor de flujo al tanque de gas que contiene la mezcla de gases de 95% N 2/5% CO2a través de un filtro de aire. 
  4. Abra la válvula de control de flujo del tanque girándola en sentido contrario a las agujas del reloj para permitir un flujo de gas mínimo. Abra lentamente la válvula reguladora de presión girando en el sentido de las agujas del reloj.
  5. Enjuague la cámara con la mezcla de gases a un caudal de 20 L/min durante 5 min. Desconecte la cámara de la fuente de gas y cierre firmemente ambas abrazaderas de plástico blanco.
  6. Apague la válvula de control de flujo del tanque girando en el sentido de las agujas del reloj. Cierre la válvula reguladora de presión girando en sentido contrario a las agujas del reloj.
  7. Colocar la cámara de hipoxia en una incubadora convencional a 37 °C durante 4 h.
    NOTA: Para agregar el período de reoxigenación posterior, lave las células 3 veces con DPBS, agregue medio fresco en todos los cultivos triples y mantenga durante 24 h adicionales en la incubadora deCO2 al 5% a 37 ° C. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la concentración de oxígeno que queda en la cámara es del 0% después de no menos de 4 minutos de purga con mezcla de gases anaeróbicos a 20 L / min.

3. Mediciones TEER

  1. Coloque el instrumento TEER esterilizado en el gabinete de bioseguridad y enchufe los electrodos en el voltohmímetro epitelial. Esterilice los electrodos en 30 ml de solución de alcohol isopropílico al 70% durante un mínimo de 30 min.
  2. Encienda el instrumento TEER y ajuste la función a ohmios.
  3. Retire los electrodos de la solución de alcohol isopropílico al 70% y colóquelos en 20 ml de DPBS durante un mínimo de 30 minutos hasta que la lectura digital en el dispositivo TEER lea 0 ohmios.
  4. Inserte la clavija larga del electrodo a través de una de las tres aberturas en la percha de inserción de pozo del control de inserción de pozo en blanco, bajándola hasta que toque el fondo del pozo. Asegúrese de que la púa corta descanse sobre el cultivo apical en la parte inferior del inserto del pozo.
    NOTA: El control de inserción de pocillos en blanco está compuesto por 2 ml de medio clásico completo en el compartimiento apical y una combinación de 1 ml de medio pericito y 1 ml de medio de astrocito en el compartimiento basolateral. Asegúrese de que los electrodos se mantengan a 90° del inserto del pozo mientras realiza la medición TEER. Usar el promedio de dos o tres lecturas obtenidas en el mismo pozo (por apertura) puede ayudar a disminuir la variabilidad.
  5. Espere hasta que los valores de lectura digital en el instrumento TEER se nivelen antes de registrar el valor. Vuelva a colocar los electrodos en DPBS para lavarlos entre mediciones. Continúe recopilando todas las mediciones TEER para dos controles más de inserción de pozos en blanco.
  6. Recopile las mediciones TEER de las placas de muestra utilizando los pasos 3.4-3.5 tomados para las mediciones de control. Una vez que se hayan tomado todas las mediciones, vuelva a colocar el electrodo en la solución de alcohol isopropílico al 70% durante 30 minutos. Desconecte los electrodos del instrumento TEER y deje que se sequen al aire.
  7. Calcule los valores TEER. Use la ecuación (1) para restar el valor medio de ohmios del control de inserción de pozo en blanco del valor de ohmios de la muestra, y luego multiplique este valor de resistencia por el área del inserto de membrana (cm 2) para obtener el valor TEER informado en Ω∙cm2.
    figure-protocol-9647 (1)

4. Evaluación de la permeabilidad paracelular BBB

NOTA: Realice todos los pasos que involucren FITC-dextrano en un gabinete de bioseguridad de cultivo celular con las luces apagadas. Cubra las soluciones FITC-dextrano con papel de aluminio para minimizar el fotoblanqueo.

  1. Preparar soluciones que contengan FITC-dextranos de 20 y 70 kDa (0,1 mg/ml) utilizando medio de crecimiento de células endoteliales libres de rojo fenol y dejar agitar en un agitador de plataforma oscilante durante 1 h. Filtrar las soluciones con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
  2. Aspirar el medio del compartimiento basolateral y reemplazarlo con 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales libres de rojo de fenol en el modelo de BBB de cultivo de células triples. Lave las células en el compartimiento apical dos veces con la solución salina balanceada de Hanks (HBSS).
  3. Agregue 1 ml de la solución de FITC-dextrano en el compartimiento apical y cubra la placa con papel de aluminio. Colocar la placa en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 1 h.
  4. Tome 100 μL de medio de los compartimentos basolaterales y transfiéralo a una placa negra de 96 pocillos. Mida la fluorescencia utilizando un lector de microplacas con las longitudes de onda de excitación y emisión establecidas en 480 nm y 530 nm, respectivamente.

5. Detección de hipoxia en células vivas

  1. Semilla de 200 μL de HBMEC, HA y HBVP en el centro de platos con fondo de vidrio de 35 mm recubiertos de poli-d-lisina a una densidad de 150.000 células/plato. Antes de sembrar HBMEC, cubra la parte inferior de los platos con el factor de fijación. Permita que las células se adhieran a la superficie del vidrio dejándolas durante la noche a 37 °C en una incubadora deCO2 .
    NOTA: Es importante colocar platos con células primarias humanas al mismo tiempo con un modelo de BBB de triple inserción en una cámara de hipoxia para OGD.
  2. Una vez alcanzada la confluencia, desechar el medio de cultivo y añadir 2 ml de medio libre de glucosa precalentado (para OGD) o medio normal (para controles) que contenga 2 μL de 1 mM Hoechst 33342 (concentración final 0,2 μM) y 0,5 μL de solución madre de 5 mM del reactivo de hipoxia verde Image-iT referenciado (concentración final 1 μM). Después del tratamiento con OGD, reemplace el medio con un medio optimizado para imágenes en todos los platos.
  3. Realice imágenes fluorescentes de células vivas con el filtro GFP y la incubadora de microscopio confocal de etapa superior como se describió anteriormente14,15.

Resultados

Para examinar los efectos de los astrocitos y pericitos en la función de barrera de HBMEC, construimos el modelo BBB de cultivo celular triple en insertos de cultivo celular (Figura 1A) junto con monocultivo HBMEC y dos modelos de doble cocultivo como controles (Figura 1B). Los controles de cocultivo doble incluyeron un cocultivo sin contacto de HBMEC con AH y un cocultivo de contacto de HBMEC con HBVP. Después de 6 días en cocultivo, todas las configuracione...

Discusión

En este protocolo, describimos un método para establecer un modelo fiable de cultivo de BBB triple de células endoteliales-pericito-astrocitos para estudiar la disfunción de la BHE en el contexto de un accidente cerebrovascular isquémico in vitro. Teniendo en cuenta que los pericitos son los vecinos más cercanos de las células endoteliales in vivo, el HBVP está plateado en la parte inferior de los insertos de pocillos en este modelo16. Aunque esta configuración carece de ...

Divulgaciones

Todos los autores revelaron que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 y DA047157.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane InsertCorning3450
35 mm Glass Bottom DishesMatTek Life Sciences (FISHERSCI)P35GC-1.5-14-C
Astrocyte MediumScience Cell1801
Attachment FactorCell Systems (Fisher Scientific)4Z0-201
BD 60 mL SyringeBD309653
BrainPhys Imaging Optimized MediumSTEMCELL Technologies5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost4Z0-500Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar CapVWR430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask Corning431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene MicroplatesCorning3340
Countes Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228
Countess II FL Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution Fisher Scientific 04-355-71
Disposable Petri DishesVWR25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)ThermoFisherA14430-01Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)ThermoFisher14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mLLonzaCC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodesWorld Precison InstrumentsNC9792051Epithelial voltohmmeter 
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)Millipore SigmaFD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)Millipore SigmaFD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal MicroscopeOlympusFV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)AirgasX02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)Thermofisher14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in WaterThermoFisherH3570
Human AstrocytesScience Cell1800
Human Brain Vascular PericytesScience Cell1200
Hypoxia Incubator ChamberSTEMCELL Technologies27310
Image-iT Green Hypoxia ReagentThermoFisherI14834
Pericyte MediumScience Cell1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial CellsACBRI 376Cell Systems
Rocking Platform Shaker, DoubleVWR10860-658
Single Flow MeterSTEMCELL Technologies27311
SpectraMax iD3 Microplate ReaderMolecular Devices75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, SterileNEST Scientific380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)MidSciTP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 FlasksMidSciTP90075Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermoFisher25200056
UltraPure Distilled WaterInvitrogen (Life Technologies)10977-015
Uno Stage Top Incubator-Oko LabUNO-T-H-CO2-TTL

Referencias

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