Um Modelo de Cultura de Células Primárias Triplas da Barreira Hematoencefálica Humana para o Estudo do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico In Vitro

Resumo

Aqui, descrevemos o método para estabelecer um modelo de cultura de células triplas da barreira hematoencefálica baseado em células endoteliais microvasculares cerebrais humanas primárias, astrócitos e pericitos. Este modelo multicelular é adequado para estudos de disfunção da unidade neurovascular durante acidente vascular cerebral isquêmico in vitro ou para a triagem de candidatos a medicamentos.

Resumo

O acidente vascular cerebral isquêmico é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo, com opções terapêuticas limitadas. A neuropatologia do acidente vascular cerebral isquêmico é caracterizada por uma interrupção no suprimento de sangue para o cérebro, levando à morte celular e disfunção cognitiva. Durante e após o acidente vascular cerebral isquêmico, a disfunção da barreira hematoencefálica (BBB) facilita a progressão da lesão e contribui para a má recuperação do paciente. Os modelos atuais de BBB incluem principalmente monoculturas endoteliais e coculturas duplas com astrócitos ou pericitos.

Tais modelos não têm a capacidade de imitar completamente um microambiente cerebral dinâmico, o que é essencial para a comunicação célula-a-célula. Além disso, os modelos BBB comumente usados geralmente contêm células endoteliais humanas imortalizadas ou culturas de células derivadas de animais (roedores, suínos ou bovinos) que apresentam limitações translacionais. Este artigo descreve um novo modelo BBB bem baseado em inserção contendo apenas células humanas primárias (células endoteliais microvasculares cerebrais, astrócitos e pericitos vasculares cerebrais) permitindo a investigação de lesão cerebral isquêmica in vitro.

Os efeitos da privação de oxigênio-glicose (OGD) sobre a integridade da barreira foram avaliados pela permeabilidade passiva, medições de resistência elétrica transendotelial (TEER) e visualização direta de células hipóxicas. O protocolo apresentado oferece uma vantagem distinta que imita o ambiente intercelular do BBB in vivo, servindo como um modelo de BBB in vitro mais realista para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas no cenário de lesão cerebral isquêmica.

Introdução

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade a longo prazo em todo o mundo¹. A incidência de AVC aumenta rapidamente com a idade, dobrando a cada 10 anos após os 55 anos². O acidente vascular cerebral isquêmico ocorre como resultado da ruptura do fluxo sanguíneo cerebral devido a eventos trombóticos e embólicos, que abrange mais de 80% de todos os casos de AVC³. Mesmo agora, existem relativamente poucas opções de tratamento disponíveis para minimizar a morte tecidual após acidente vascular cerebral isquêmico. Os tratamentos que existem são sensíveis ao tempo e, consequentemente, nem sempre levam a bons resultados clínicos. Portanto, a pesquisa sobre mecanismos celulares complexos de acidente vascular cerebral isquêmico que afetam a recuperação pós-AVC é urgentemente necessária.

O BBB é uma interface dinâmica para a troca de moléculas entre o sangue e o parênquima cerebral. Estruturalmente, o BBB é composto por células endoteliais microvasculares cerebrais interconectadas por complexos juncionais circundados por membrana basal, pericitos e extremidades astrocíticas⁴. Pericitos e astrócitos desempenham um papel essencial na manutenção da integridade do BBB através da secreção de vários fatores necessários para a formação de junções fortes e apertadas ^5,6. A quebra do BBB é uma das características do acidente vascular cerebral isquêmico. A resposta inflamatória aguda e o estresse oxidativo associados à isquemia cerebral resultam na ruptura de complexos proteicos de junção apertada e no crosstalk desregulado entre astrócitos, pericitos e células endoteliais, o que leva ao aumento da permeabilidade de solutos paracelulares em todo o BBB⁷. A disfunção do BBB promove ainda a formação de edema cerebral e aumenta o risco de transformação hemorrágica⁸. Considerando todos os itens acima, há grande interesse em compreender as alterações moleculares e celulares que ocorrem no nível BBB durante e após o AVC isquêmico.

Embora muitos modelos de BBB in vitro tenham sido desenvolvidos nas últimas décadas e utilizados em uma variedade de estudos, nenhum deles pode se replicar totalmente em condições in vivo ⁹. Enquanto alguns modelos são baseados em monocamadas de células endoteliais cultivadas em suportes permeáveis de inserção de poço isoladamente ou em combinação com pericitos ou astrócitos, apenas estudos mais recentes introduziram desenhos de modelos de cultura de células triplas. Quase todos os modelos de BBB de cultura tripla existentes incorporam células endoteliais cerebrais primárias, juntamente com astrócitos e pericitos isolados de espécies animais ou células derivadas de células-tronco pluripotentes humanas^10,11,12,13.

Reconhecendo a necessidade de recapitular melhor o BBB humano in vitro, estabelecemos um modelo de BBB in vitro de cultura de células triplas composto por células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMEC), astrócitos humanos primários (HA) e pericitos vasculares cerebrais humanos primários (HBVP). Este modelo BBB de cultura tripla é configurado em inserções de membrana de poliéster de placa de 6 poços com tamanho de poro de 0,4 μm. Essas inserções de poço fornecem um ambiente ideal para a fixação celular e permitem fácil acesso aos compartimentos apicais (sangue) e basolateral (cérebro) para amostragem média ou aplicação de compostos. As características deste modelo BBB de cultura de células triplas proposto são avaliadas medindo-se TEER e fluxo paracelular pós-OGD imitando acidente vascular cerebral isquêmico in vitro, com uma escassez de oxigênio (<1% O₂) e nutrientes (usando meio livre de glicose) alcançada usando uma câmara umidificado e selada. Além disso, as condições isquêmicas induzidas neste modelo são verificadas com precisão pela visualização direta de células hipóxicas.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todas as células, materiais, equipamentos e soluções usados neste protocolo.

1. Configuração do modelo BBB de cultura de células triplas

1. Semeadura de pericitos
   1. Cultivar HBVP em frascos de cultura T75 com uma superfície ativada para adesão celular dentro de uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C até ficar confluente. Uma vez atingida a confluência, aspirar o meio pericitário antigo e lavar as células com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) morna. Aspirar o DPBS e separar as células do balão utilizando uma combinação de 4 ml de solução quente de tripsina-EDTA e 1 ml de DPBS.
      NOTA: Evite usar passagens posteriores a P7.
   2. Incubar o balão durante 5 minutos a 37 °C numa incubadora de CO₂ . Vista ao microscópio para confirmar se as células estão separadas do balão. Adicionar 5 mL de meio de perícito quente (contendo 2% de soro fetal bovino [FBS]) ao balão e transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 50 mL.
   3. Centrifugar a suspensão celular por 3 min a 200 × g, permitindo que as células formem uma pelota no fundo do tubo. Aspirar o meio do tubo, garantindo que o pellet da célula permaneça intacto.
   4. Ressuspender o pellet celular em meio pericito; calcular a quantidade de meio dependendo da confluência das células e do número de inserções de poços necessários. Pegue 10 μL das células ressuspensas, coloque-as em um slide de contagem de células e conte o número de células.
   5. Determinar a densidade celular e semear 300.000 células/inserir em 1 mL de meio pericitário no lado abluminal das inserções do poço (formato de 6 poços).
      NOTA: Ao semear o HBVP na parte inferior das pastilhas, é muito importante primeiro virar as placas de inserção de poço de cabeça para baixo. Enquanto a placa é colocada plana em uma superfície, remova a seção inferior para expor o lado abluminal das inserções do poço. Depois de adicionar a suspensão de células de perícito no lado abluminal, cubra as inserções do poço com a placa invertida para evitar a evaporação. Mantenha todas as placas viradas de cabeça para baixo em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C durante a noite.
2. Astrócitos semeadores
   1. Cultivar AH em frascos de T75 numa incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C até se atingir a confluência. Siga os passos acima 1.1.1-1.1.4 usando meio astrócitos (também contendo 2% FBS) em vez de meio pericito.
      NOTA: Evite usar passagens posteriores a P9.
   2. Determine a densidade celular e semeie 300.000 células/poço no fundo das placas de 6 poços de cultura de tecidos. Cobrir a placa para evitar a evaporação e manter todas as placas numa incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C durante a noite.
3. Semeadura de células endoteliais
   1. Cultivar HBMEC em placas de cultura de tecidos dentro de uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C até ficar confluente. Siga as etapas acima 1.1.1-1.1.4 usando meio clássico completo (contendo 10% de FBS) em vez de meio de pericito.
      NOTA: Evite usar passagens posteriores a P12.
   2. Retirar as placas de cultura de tecidos de 6 poços contendo astrócitos e as inserções de poço (formato de 6 poços) contendo pericitos da incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C. Aspirar o meio astrócitos das placas de cultura de tecidos de 6 poços. Adicione 1 mL de meio pericitário e 1 mL de meio astrócitos a cada poço.
   3. Aspirar o meio pericitário das inserções de poço e colocá-las nas placas de 6 poços de cultura de tecidos contendo os astrócitos semeados. Sementes HBMEC a uma densidade de 300.000 células/poço em 2 mL de meio clássico completo no lado apical das mesmas inserções de poço.
      NOTA: As células endoteliais devem ser semeadas no lado apical das inserções de poços no dia seguinte após a semeadura de pericitos no lado abluminal das inserções de poço e astrócitos em placas de cultura de tecidos de 6 poços. As células devem ser mantidas em cultura tripla por 6 dias para induzir propriedades semelhantes ao BBB. O meio de cultura celular deve ser trocado em ambos os compartimentos de inserção de poços 24 h antes dos experimentos.

2. Indução da privação de oxigênio-glicose

1. Lave as células 3x com DPBS. Para culturas de células triplas submetidas a OGD, adicionar meio livre de glicose (sem L-glutamina e vermelho de fenol) aos compartimentos apical e basolateral. Substitua o meio de cultura por meio fresco em culturas de células de controle normóxico. Colocar as culturas triplas de controle na incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C.
   NOTA: Mudanças de meio antes da indução de OGD ou imediatamente após OGD podem criar estresse mecânico que afetaria ainda mais as monocamadas de células endoteliais. Assim, as etapas com substituição do meio são incluídas para as culturas de células de controle normóxico.
2. Coloque uma placa de Petri contendo 20 mL de água estéril na câmara incubadora de hipóxia para fornecer umidificação adequada das culturas. Abra a câmara soltando a braçadeira do anel. Organize as culturas de células nas prateleiras. Sele a câmara prendendo a braçadeira do anel.
3. Abra as portas de entrada e saída da câmara. Anexe a tubulação proveniente da parte superior do medidor de vazão à câmara. Fixar a tubulação proveniente do fundo do medidor de vazão ao tanque de gás que contém a mistura de gás de 95% N 2/5% CO₂através de um filtro de ar. 
4. Abra a válvula de controle de fluxo do tanque girando-a no sentido anti-horário para permitir o fluxo mínimo de gás. Abra lentamente a válvula reguladora de pressão girando no sentido horário.
5. Lavar a câmara com a mistura de gases a um caudal de 20 L/min durante 5 minutos. Desconecte a câmara da fonte de gás e feche firmemente ambas as braçadeiras de plástico branco.
6. Desligue a válvula de controle de fluxo do tanque girando no sentido horário. Feche a válvula reguladora de pressão girando no sentido anti-horário.
7. Colocar a câmara de hipóxia numa incubadora convencional a 37 °C durante 4 h.
   NOTA: Para adicionar o período de reoxigenação subsequente, lavar as células 3x com DPBS, adicionar meio fresco em todas as culturas triplas e manter por mais 24 horas na incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C. De acordo com as instruções do fabricante, a concentração de oxigênio restante na câmara é de 0% após pelo menos 4 min de purga com mistura de gases anaeróbicos a 20 L/min.

3. Medições TEER

1. Coloque o instrumento TEER esterilizado no gabinete de biossegurança e conecte os eletrodos ao voltohmímetro epitelial. Esterilizar os eletrodos em 30 mL de solução de álcool isopropílico a 70% por um período mínimo de 30 min.
2. Ligue o instrumento TEER e defina a função como ohms.
3. Remova os eléctrodos da solução de álcool isopropílico a 70% e coloque-os em 20 ml de DPBS durante um mínimo de 30 minutos até que a leitura digital no dispositivo TEER leia 0 ohms.
4. Insira o pino longo do eletrodo através de uma das três aberturas no gancho de inserção do poço do controle de inserção de poço em branco, abaixando-o até que ele toque o fundo do poço. Certifique-se de que o pino curto esteja descansando acima da cultura apical na parte inferior do poço.
   NOTA: O controle de inserção de poço em branco é composto por 2 mL de meio clássico completo no compartimento apical e uma combinação de 1 mL de meio pericitário e 1 mL de meio astrócitos no compartimento basolateral. Verifique se os eletrodos são mantidos a 90° da inserção do poço enquanto faz a medição TEER. Usar a média de duas ou três leituras obtidas no mesmo poço (por abertura) pode ajudar a diminuir a variabilidade.
5. Aguarde até que os valores de leitura digital no instrumento TEER se estabilizem antes de registrar o valor. Coloque os eletrodos de volta no DPBS para lavá-los entre as medições. Continue a coletar todas as medições TEER para mais dois controles de inserção de poço em branco.
6. Coletar as medições TEER das placas de amostra usando as etapas 3.4-3.5 tomadas para as medições de controle. Uma vez que todas as medições tenham sido feitas, coloque o eletrodo de volta na solução de álcool isopropílico a 70% por 30 min. Desconecte os eletrodos do instrumento TEER e deixe-os secar ao ar.
7. Calcule os valores TEER. Use a equação (1) para subtrair o valor médio de ohm do controle de inserção de poço em branco do valor de ohm da amostra e, em seguida, multiplique esse valor de resistência pela área da inserção de membrana (cm 2) para dar o valor TEER relatado em Ω∙cm².
   (1)

4. Avaliação da permeabilidade paracelular BBB

NOTA: Execute todas as etapas que envolvem FITC-dextran em um gabinete de biossegurança de cultura de células com as luzes apagadas. Cubra as soluções FITC-dextran com folha de alumínio para minimizar o fotobranqueamento.

1. Preparar soluções contendo FITC-dextrans de 20 e 70 kDa (0,1 mg/mL) utilizando meio de crescimento de células endoteliais isento de vermelho de fenol e deixar mexer em um agitador de plataforma de balanço por 1 h. Filtrar as soluções utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm.
2. Aspirar o meio do compartimento basolateral e substituí-lo por 2 mL de meio de crescimento endotelial livre de vermelho de fenol no modelo BBB de cultura de células triplas. Lave as células no compartimento apical duas vezes com a solução salina balanceada de Hanks (HBSS).
3. Adicionar 1 ml da solução de FITC-dextran no compartimento apical e cobrir a placa com papel alumínio. Colocar a placa numa incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C durante 1 h.
4. Pegue 100 μL de meio dos compartimentos basolaterais e transfira-o para uma placa preta de 96 poços. Meça a fluorescência usando um leitor de microplacas com os comprimentos de onda de excitação e emissão ajustados para 480 nm e 530 nm, respectivamente.

5. Detecção de hipóxia em células vivas

1. Semear 200 μL de HBMEC, HA e HBVP no centro de placas de fundo de vidro de 35 mm revestidas com poli-d-lisina, a uma densidade de 150.000 células/prato. Antes de semear HBMEC, cubra o fundo dos pratos com o fator de fixação. Deixe que as células se fixem à superfície do vidro, deixando-as durante a noite a 37 °C numa incubadora de CO₂.
   NOTA: É importante colocar pratos com células primárias humanas ao mesmo tempo com um modelo BBB de inserção de poço triplo em uma câmara de hipóxia para OGD.
2. Uma vez atingida a confluência, descarte o meio de cultura e adicione 2 mL de meio pré-aquecido livre de glicose (para OGD) ou meio normal (para controles) contendo 2 μL de 1 mM Hoechst 33342 (concentração final de 0,2 μM) e 0,5 μL de solução de estoque de 5 mM do reagente de hipóxia verde Image-iT referenciado (concentração final de 1 μM). Após o tratamento com OGD, substitua o meio por um meio otimizado por imagem em todos os pratos.
3. Realizar imagens de células vivas por fluorescência com filtro GFP e incubadora de microscópio confocal de estágio superior, conforme descrito anteriormente^14,15.

Resultados

Para examinar os efeitos de astrócitos e pericitos sobre a função de barreira do HBMEC, construímos o modelo BBB de cultura de células triplas em inserções de cultura celular (Figura 1A), juntamente com a monocultura do HBMEC e dois modelos de cocultura dupla como controles (Figura 1B). Os controles de dupla cocultura incluíram uma cocultura sem contato do HBMEC com o AH e a cocultura de contato do HBMEC com o HBVP. Após 6 dias em co-cultura, todas as c...

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um método para estabelecer um modelo confiável de cultura BBB de células endoteliais triplas de pericitos-astrócitos para estudar a disfunção de BBB no contexto de acidente vascular cerebral isquêmico in vitro. Considerando que os pericitos são os vizinhos mais próximos das células endoteliais in vivo, as HBVP são revestidas na parte inferior das inserções de poços neste modelo¹⁶. Embora essa configuração não tenha a comunicação dir...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL