Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos

Resumen

La secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa a través del análisis metabolómico no dirigido.

Resumen

Los exudados de raíces son el principal medio de comunicación de información y transferencia de energía entre las raíces de las plantas y el entorno circundante. El cambio en la secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo tiene como objetivo introducir directrices generales para la recolección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) en la producción de metabolitos. Primero, las plántulas de alfalfa se cultivan bajo estrés DEHP en un experimento de cultivo hidropónico. En segundo lugar, las plantas se transfieren a tubos de centrífuga que contienen 50 ml de agua ultrapura esterilizada durante 6 h para recoger los exudados de la raíz. Las soluciones se liofilizan en un liofilizador al vacío. Las muestras congeladas se extraen y se derivatizan con el reactivo bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, los extractos derivatizados se miden utilizando un sistema de cromatógrafo de gases acoplado con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (GC-TOF-MS). Los datos de metabolitos adquiridos se analizan en base a métodos bioinformáticos. Los metabolitos diferenciales y las vías metabólicas significativamente modificadas deben explorarse profundamente para revelar el impacto del DEHP en la alfalfa en vista de los exudados de la raíz.

Introducción

El ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) es un compuesto químico sintético que se usa ampliamente en varios plásticos y polímeros como plastificante para mejorar su plasticidad y resistencia. En los últimos años, un número creciente de estudios han sugerido que el DEHP es un disruptor endocrino y tiene efectos adversos sobre los sistemas respiratorio, nervioso y reproductivo de los seres humanos y otros animales ^1,2,3. Teniendo en cuenta su riesgo para la salud, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, la Unión Europea y el Centro de Monitoreo Ambiental de China han clasificado el DEHP en la lista de contaminantes prioritarios. El suelo ha sido considerado como un importante sumidero de DEHP en el medio ambiente, debido a la aplicación de mantillo plástico y fertilizantes orgánicos, riego con aguas residuales y aplicación de lodos agrícolas⁴. Como era de esperar, el DEHP se ha detectado ubicuamente en suelos de tierras de cultivo, cuyo contenido incluso alcanza hasta miligramos por kilogramo de suelo seco en algunas regiones de China ^5,6. El DEHP puede ingresar a las plantas principalmente a través de las raíces y sufrir biomagnificación a diferentes niveles tróficos en los ecosistemas del suelo⁷. Por lo tanto, se ha planteado una preocupación significativa sobre el estrés inducido por el DEHP en las plantas en las últimas décadas.

Las plantas suelen ser vulnerables a la exposición al DEHP. Se ha observado que el estrés del DEHP ejerce un efecto adverso sobre la germinación de las semillas y el metabolismo normal, inhibiendo así el crecimiento y desarrollo de las plantas ^8,9. Por ejemplo, el DEHP puede inducir daño oxidativo a las células del mesófilo, disminuir el contenido de clorofila y osmolitos, y elevar las actividades de las enzimas antioxidantes, lo que eventualmente resulta en una disminución en el rendimiento y la calidad de las plantas comestibles^10,11. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos sobre la respuesta de las plantas al estrés del DEHP se han centrado en el estrés oxidativo y las características fisiológicas y bioquímicas. Los mecanismos correspondientes asociados con el metabolismo de las plantas están menos estudiados. Exudados de raíz es un término genérico que describe compuestos que las raíces de las plantas secretan y liberan en el medio ambiente. Han sido considerados como el medio de interacción entre las plantas y el suelo de la rizosfera, desempeñando un papel importante en el apoyo al crecimiento y desarrollo de las plantas¹². Es bien sabido que los exudados de la raíz representan aproximadamente el 30%-40% de todo el carbono fotosintético¹³. En ambientes contaminados, los exudados radiculares están involucrados en la mejora de la tolerancia de las plantas al estrés de los contaminantes a través del metabolismo o la exclusión externa¹⁴. Como consecuencia, una comprensión profunda de la respuesta de los exudados de las raíces de las plantas al estrés por contaminación puede ayudar a revelar los mecanismos subyacentes asociados con la bioquímica celular y los fenómenos biológicos¹⁵.

La tecnología metabolómica proporciona una estrategia eficiente para medir un gran número de metabolitos de moléculas pequeñas simultáneamente dentro de las células 16,17, tejidos¹⁸ e incluso exudados de organismos ¹⁹, incluidos azúcares, ácidos orgánicos^, aminoácidos y lípidos. En comparación con los métodos de análisis químico tradicionales o clásicos, el enfoque metabolómico aumenta en gran medida el número de metabolitos que se pueden detectar²⁰, lo que puede ayudar a identificar metabolitos de una manera de mayor rendimiento e identificar vías metabólicas clave. La metabolómica ha sido ampliamente utilizada en el campo de investigación de la respuesta biológica en ambientes de estrés, como metales pesados²¹, contaminantes emergentes²² y nanopartículas¹⁹. La mayoría de estos estudios en plantas se han centrado en los cambios metabólicos en los tejidos interiores de las plantas, mientras que pocos se han reportado sobre la respuesta de los exudados de las raíces al estrés ambiental. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es introducir pautas generales para la recolección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del DEHP en la producción de metabolitos. Los resultados proporcionarán una guía metodológica para el estudio de seguimiento de la metabolómica vegetal por DEHP.

Protocolo

El objetivo de este protocolo es proporcionar una tubería general, desde un experimento de cultivo hidropónico hasta el análisis metabolómico, cuantificando el efecto del DEHP en los exudados de la raíz de alfalfa.

1. Experimento de cultivo hidropónico

NOTA: Este protocolo presenta un ejemplo de un experimento de cultivo hidropónico de alfalfa diseñado para obtener plántulas de alfalfa (Medicago sativa) bajo el estrés de diferentes concentraciones de DEHP. Se establecieron tres tratamientos: el control sin adiciones y la solución nutritiva enriquecida con 1 mg kg-1 y 10 mg ^kg-1 de di(DEHP. Las concentraciones de DEHP se establecieron de acuerdo con el contenido real de DEHP en el suelo²³. Cada tratamiento tuvo seis réplicas.

1. Esterilice las semillas de alfalfa con hipoclorito de sodio al 0,1% durante 10 min y alcohol etílico al 75% durante 30 min.
   1. Enjuague las semillas esterilizadas varias veces con agua destilada y luego germine en papel de filtro húmedo en una placa de Petri estéril a 30 ° C en la oscuridad.
2. Transfiera 20 semillas uniformes, germinadas y grandes a una cesta de injerto en una botella de cultivo llena de solución nutritiva, compuesta de (en μM): Ca(NO 3)₂, 3,500; NH₄H₂PO₄, 1.000; KNO₃, 6.000; MgSO₄, 2.000; Ácido Na₂Fe-etilendiaminotetraacético (EDTA), 75; H 3BO₃, 46; MnSO₄, 9,1; ZnSO₄, 0,8; CuSO₄, 0,3; y (NH₄ )₆Mo₇O₂₄, 0.02. Ajuste el pH de la solución a 7,0 utilizando 0,1 M KOH. Renueve todas las soluciones semanalmente.
3. Colocar todos los frascos de cultivo en una cámara de crecimiento controlado con una intensidad lumínica de 150-180 μmol ^{m-2 s-1} con un fotoperiodo de 16 h cada día, a 27 °C y 20 °C representando el día (16 h) y la noche (8 h), respectivamente.
4. Transfiera 15 plántulas uniformes de alfalfa a una nueva botella de vidrio para experimentos de cultivo por debajo de 1 mg kg-1 y 10 mg ^kg-1 de estrés DEHP después de 2 semanas. Envuelva las botellas de vidrio con papel de aluminio y parafilm para evitar la fotólisis y la volatilización del DEHP. Para aplicar las mismas condiciones, también envuelva las botellas de control con papel de aluminio y parafilm. Complemente la solución nutritiva diariamente para mantener el nivel de líquido.
5. Coloque y gire las botellas al azar cada 2 días para garantizar condiciones de crecimiento consistentes para las plántulas de alfalfa.
6. Después de 7 días de cultivo, retire las plántulas de alfalfa de las botellas y lávelas con agua ultrapura varias veces, preparándose para la recolección de exudados de raíces.

2. Recolección, extracción y análisis metabolómico de exudados radiculares

NOTA: Este protocolo se divide en tres partes: un experimento de recolección, un experimento de extracción y un análisis metabolómico de los exudados de la raíz. El objetivo del experimento de recolección es transferir los metabolitos secretados en las muestras de plantas al sistema de solución para su posterior extracción.

1. Experimento de recopilación
   1. Transfiera 10 plántulas uniformes de alfalfa a tubos de centrífuga llenos de 50 ml de agua desionizada esterilizada. Sumerge las raíces en agua para recoger los exudados de la raíz durante 6 h; Mantenga los tubos en posición vertical. Realizar al menos seis réplicas para cada tratamiento.
   2. Envuelva los tubos de la centrífuga con papel de aluminio para proteger las raíces de la luz.
   3. Retire las plantas y liofilique el líquido recolectado para el perfil de metabolitos.
2. Experimento de extracción
   1. Añadir 1,8 ml de solución de extracción (metanol:_H2O= 3:1, V/V) a los tubos y vórtice durante 30 s.
   2. Aplique ondas de ultrasonido a los tubos durante 10 minutos en un baño de agua helada.
   3. Centrifugar las muestras a 4 °C y 11.000 × g durante 15 min.
   4. Transfiera cuidadosamente 200 μL de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tomar 45 μL de sobrenadante de cada muestra y mezclarlo en muestras de control de calidad (QC) a un volumen final de 270 μL, que se utiliza para la calibración de los datos del metaboloma de las muestras.
   5. Liofilizar los extractos en un concentrador de vacío. Continuar secando con 5 μL del patrón interno (ribonucleol).
   6. Después de la evaporación en un concentrador de vacío, añadir 30 μL de clorhidrato de metoxiaminación (disuelto en piridina a una concentración de 20 mg ^mL-1) a los tubos e incubar los tubos a 80 °C durante 30 min. A continuación, añadir 40 μL de reactivo bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) (con trimetilclorosilano [TMC] AL 1% de v/v) a las muestras y colocar los tubos a 70 °C durante 1,5 h para la derivatización.
   7. Enfriar las muestras a temperatura ambiente y añadir 5 μL de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) (en cloroformo) a las muestras de control de calidad.
3. Análisis metabolómico
   1. Inyectar 1,0 μL de los extractos derivatizados en un sistema de cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (GC-TOF-MS) para el análisis de perfiles metabolómicos utilizando un modo sin división.
      1. Utilice una columna capilar (30 m x 250 μm x 0,25 μm) para la separación de los exudados de la raíz, con helio como gas portador a un caudal de 1,0 ml ^min-1. Ajuste la temperatura de inyección a 280 °C y mantenga la temperatura de la línea de transferencia y la temperatura de la fuente de iones a 280 °C y 250 °C, respectivamente.
      2. Para la separación, utilice el siguiente programa de horno: calentamiento isotérmico de 1 min a 50 °C, una rampa de horno de 10 °C/^min-1 a 310 °C y calentamiento isotérmico final a 310 °C durante 8 min.
      3. Realice el modo de colisión de electrones con -70 eV de energía. Obtenga espectros de masas utilizando el modo de monitoreo de barrido completo con un rango de escaneo de masas de 50-500 m/z a una velocidad de 12,5 espectros/s.
   2. Filtre los picos individuales para eliminar el ruido. El valor de desviación se filtra en función del rango intercuartílico.
   3. Rellene los valores que faltan con la mitad de los valores mínimos, estandarice y normalice los datos.
   4. Importe los datos finales en formato .csv en software de análisis estadístico para análisis multivariante.
   5. Busque los metabolitos en la base de datos de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) (un recurso de base de datos para comprender las funciones y utilidades de alto nivel del sistema biológico) y clasifique los metabolitos en diferentes categorías, como carbohidratos, ácidos, lípidos, alcoholes y aminas. Utilice software de análisis estadístico para construir un gráfico circular para indicar el porcentaje de cada categoría en todos los exudados de la raíz.
   6. Aplicar proyecciones ortogonales supervisadas al análisis discriminatorio de estructuras latentes (OPLS-DA) para demostrar las diferencias entre los grupos.
   7. El cribado cambió significativamente los metabolitos como metabolitos diferenciales en función de una importancia variable en la proyección (VIP) > 1 y p < 0,05 (prueba t de Student).
   8. Utilice los datos del metaboloma para construir mapas de calor con el software de análisis estadístico y utilice los cambios de pliegue bajo diferentes tratamientos para construir histogramas.
   9. Busque los metabolitos diferenciales en la base de datos KEGG y Pubchem y compile las vías metabólicas que contienen los metabolitos diferenciales. Realizar análisis de enriquecimiento de vías o análisis de topología.

Resultados

En este experimento, los exudados de raíz de alfalfa fueron recolectados, extraídos y analizados de acuerdo con los métodos anteriores (Figura 1). Se establecieron tres grupos de tratamiento: control, baja concentración de DEHP (1 mg L-1) y alta concentración de DEHP (10 mg ^L-1).

Se detectaron un total de 778 picos en el cromatógrafo del control, de los cuales se pudieron identificar 314 metabolitos según los espectros de masas. Como s...

Discusión

Este protocolo proporciona orientación general sobre cómo recolectar y medir los exudados de la raíz de la alfalfa bajo estrés DEHP, así como sobre cómo analizar los datos del metaboloma. Se debe prestar mucha atención a algunos pasos críticos en este protocolo. En experimentos de cultivo hidropónico, las plántulas de alfalfa se cultivaron hidropónicamente en botellas de vidrio llenas de soluciones nutritivas con diferentes concentraciones de DEHP. Las botellas de vidrio deben protegerse de la luz cubriéndola...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adonitol	SIGMA		≥99%
Alfalfa seeds	Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance	Sartorius	BSA124S-CW
BSTFA	REGIS Technologies		with 1% TMCS, v/v
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Fresco17
Chromatographic column	Agilent	DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate	Dr. Ehrenstorfer
FAMEs	Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC)	Agilent	7890A
Grinding instrument	Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd	JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS)	LECO	PEGASUS HT
Methanol	CNW Technologies		HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride	TCI		AR
Microcentrifuge tube	Eppendorf	Eppendorf Quality	1.5 mL
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd	DHG-9023A
Pyridine	Adamas		HPLC
R software			statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2			statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific	Forma 900 series
Ultrasound	Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd	YM-080S
Vacuum dryer	Taicang Huamei biochemical instrument factory	LNG-T98