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Resumen

El protocolo aquí proporciona un muestreo dinámico detallado en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo de ratas despiertas utilizando un sistema de microdiálisis.

Resumen

Una variedad de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) se asocian con cambios en la composición del líquido extracelular del hipocampo (HECF). Sin embargo, la dificultad para obtener HECF en tiempo real de ratas conscientes ha restringido durante mucho tiempo la evaluación de la progresión de la enfermedad del SNC y la efectividad de la terapia con etnomedicina. Alentadoramente, una técnica de microdiálisis cerebral se puede utilizar para el muestreo continuo con las ventajas de la observación dinámica, el análisis cuantitativo y un tamaño de muestreo pequeño. Esto permite el monitoreo de los cambios en el contenido de líquido extracelular para compuestos de hierbas tradicionales y sus metabolitos en el cerebro de animales vivos. El objetivo de este estudio fue, por lo tanto, implantar con precisión una sonda de microdiálisis de líquido cefalorraquídeo en la región del hipocampo de ratas Sprague Dawley (SD) con un aparato estereotáxico cerebral tridimensional, cortando pesos moleculares superiores a 20 kDa. El HECF de alta calidad se obtuvo de ratas conscientes utilizando un sistema de control de muestreo de microdiálisis con una frecuencia de muestreo ajustable de 2,87 nL/min - 2,98 ml/min. En conclusión, nuestro protocolo proporciona un método eficiente, rápido y dinámico para obtener HECF en ratas despiertas con la ayuda de la tecnología de microdiálisis, lo que nos brinda posibilidades ilimitadas para explorar más a fondo la patogénesis de las enfermedades relacionadas con el SNC y evaluar la eficacia de los medicamentos.

Introducción

Las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) con altas morbilidades, como las enfermedades neurodegenerativas, la lesión cerebral traumática, la lesión cerebral inducida por hipoxia a gran altitud y el accidente cerebrovascular isquémico, son causas cruciales de la creciente mortalidad en todo el mundo 1,2,3. El monitoreo en tiempo real de citoquinas y cambios de proteínas en regiones específicas del cerebro contribuye a la precisión diagnóstica de las enfermedades del SNC y los estudios farmacocinéticos cerebrales después de la medicación. La investigación científica tradicional utiliza homogeneizado de tejido cerebral o una colección manual de líquido cerebral intersticial animal para la detección de sustancias específicas y para estudios farmacocinéticos. Sin embargo, esto tiene algunas deficiencias, como un tamaño de muestra limitado, la incapacidad de observar dinámicamente los cambios de los indicadores y una calidad de muestreo desigual 4,5,6. El líquido cefalorraquídeo, un líquido intersticial, protege el cerebro y la médula espinal del daño mecánico. Su composición es diferente a la del suero debido a la existencia de la barrera hematoencefálica (BHE)7. El análisis directo de muestras de líquido cefalorraquídeo es más propicio para revelar el mecanismo de las lesiones del SNC y el descubrimiento de fármacos. Inevitablemente, las muestras de líquido cefalorraquídeo, obtenidas manualmente directamente de la cisterna magna y los ventrículos cerebrales a través de una jeringa, tienen desventajas de contaminación sanguínea, probabilidad aleatoria de recolección de muestras, incertidumbre cuantitativa y casi ninguna posibilidad de recuperación múltiple 8,9. Más notablemente, los métodos convencionales de muestreo de líquido cerebral intersticial no pueden obtener muestras de regiones cerebrales dañadas, lo que dificulta la exploración de la patogénesis de las enfermedades del SNC en regiones específicas del cerebro y la evaluación de la eficacia de las terapias dirigidas de etnomedicina 9,10.

La microdiálisis cerebral es una técnica para el muestreo de líquido cerebral intersticial en animales despiertos11. El sistema de microdiálisis imita la permeabilidad vascular con la ayuda de una sonda implantada en el cerebro. La sonda de microdiálisis está armada con una membrana semipermeable y se implanta en regiones específicas del cerebro. Después de la perfusión con líquido cefalorraquídeo artificial isotónico (ACSF), el líquido cerebral intersticial dializado puede ser recolectado favorablemente con los beneficios de tamaños de muestra pequeños, muestreo continuo y observación dinámica12,13. En términos de localización, las sondas de microdiálisis cerebral pueden ser implantadas selectivamente en estructuras cerebrales o cisternas craneales de interés14. Una observación de niveles anormales de una sustancia endógena en el líquido extracelular del hipocampo (HECF) sugiere la aparición de enfermedades del SNC o la patogénesis de la enfermedad. Varios estudios han demostrado que los biomarcadores para enfermedades del SNC, como los D-aminoácidos en la esquizofrenia, las proteínas β-amiloide y tau en la enfermedad de Alzheimer, las cadenas ligeras de neurofilamentos en la lesión cerebral traumática y la ubiquitina carboxi-terminal hidrolasa L1s en la encefalopatía por isquemia hipóxica, pueden analizarse en el líquido cefalorraquídeo15,16,17 . Un método de análisis químico basado en la técnica de muestreo de microdiálisis cerebral puede ser utilizado para monitorear cambios dinámicos de compuestos exógenos como los ingredientes activos de la etnomedicina, que se difunden y distribuyen en regiones específicas del cerebro14.

Este artículo presenta el proceso específico de adquisición dinámica de HECF en ratas despiertas y mide su presión osmótica para garantizar la calidad de la muestra.

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Protocolo

El protocolo experimental se llevó a cabo de acuerdo con los requisitos del Comité de Uso de Animales de Laboratorio y Cuidado y Uso Institucional de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2021-11). Para el presente estudio se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) (280 ± 20 g, 6-8 semanas de edad).

1. Cirugía de implantación de sonda de microdiálisis cerebral

  1. Utilizar isoflurano al 3% y 1,5% para la inducción y mantenimiento de la anestesia en ratas, respectivamente, utilizando un sistema de anestesia animal en una mezcla aire-oxígeno a 0,6 L/min. Asegúrese de que las ratas estén profundamente anestesiadas sin un reflejo de dolor y un reflejo corneal. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
  2. Retire el pelaje del cráneo de la rata anestesiada con una afeitadora eléctrica en el área de preparación. Luego, fije la rata anestesiada en un localizador cerebral estereotáxico. Desinfecte el sitio quirúrgico antes de la operación aplicando povidona yodada y etanol 3x a la región de la cirugía con una bola de algodón estéril. Aplique bupivacaína tópicamente para la analgesia local. NOTA: Todo el proceso de adquisición de muestras HECF basado en microdiálisis se ilustra en la Figura 1.
  3. Haga una incisión craneofacial de 1,5 cm por el medio con tijeras quirúrgicas y retire el periostio con tijeras quirúrgicas y fórceps oftálmicos.
  4. Considere el bregma como la posición basal y perfore el endocráneo para perforar una abertura de 2 mm en la posición anteroposterior (AP) (-2 mm), la posición mediolateral (ML) (-3.5 mm) y la posición dorsoventral (DV) (-3.5 mm) (la región CA1 del hipocampo) usando un taladro craneal.
  5. Fije el estilete del catéter en la pinza de un localizador cerebral estereotáxico y ajuste la posición de la carcasa de microdiálisis en las posiciones AP (-2 mm), ML (-3,5 mm) y DV (0 mm). Ajuste el valor DV del localizador estéreo cerebral e implante la carcasa de microdiálisis en la región CA1 a una profundidad de 3,5 mm.
    NOTA: Mantener la temperatura del animal a 37 °C durante la operación utilizando un mantenedor de temperatura del animal.
  6. Taladrar tres aberturas más con un diámetro de 2 mm de tal manera que las tres aberturas formen un triángulo en el que la abertura de la sonda esté ubicada centralmente. Tornillos de implante en las aberturas a una profundidad de 1 mm.
  7. Fije el catéter de la sonda con cemento dental y use una sutura quirúrgica 4-0 para cerrar la piel. Consulte la figura 2 para la colocación de la sonda.
  8. Coloque a la rata en jaulas durante 7 días para recuperarse. Infiltrar localmente bupivacaína (1,5 mg/kg) una vez al día después de la cirugía.  Proporcionar alimentos y agua ad libitum. Use gotas oftálmicas de hialuronato de sodio 3 veces al día para prevenir la sequedad después de la operación.
    NOTA: Realice todos los procedimientos en una sala quirúrgica estéril. No dejar al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal en una condición de 37 °C. No devuelva el animal que se ha sometido a cirugía a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.

2. Conexión del sistema de microdiálisis y comprobación de la sonda

  1. Conecte la bomba de microdiálisis, la microjeringa, el dispositivo de actividad despierta y el colector de muestras criogénicas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Instale la microjeringa con ACSF en la bomba de microdiálisis y ajuste la bomba de microdiálisis a una velocidad de 1 μL/min para descargar el aire en la tubería.
  2. Conecte la tubería y la sonda de microdiálisis cerebral (membrana: PAES; longitud de membrana: 4 mm; diámetro exterior de membrana: 0,5 mm; corte: 20 kDa; longitud del eje: 14 mm). Opere la bomba de microdiálisis a una velocidad de 1 μL/min para inyectar ACSF en la sonda hasta que la superficie de la sonda esté ligeramente húmeda. Sumerja la sonda en una solución inyectable de heparina sódica para su uso posterior.
    NOTA: Si una gran corriente del ACSF cae de la membrana semipermeable de la sonda, como se ve a simple vista bajo gravedad, reemplace la sonda por una nueva.

3. Recolección de HECF de la rata despierta

  1. Inserte la sonda de microdiálisis cerebral en el catéter de la sonda y coloque la rata en una cámara (altura: 360 mm; diámetro: 400 mm) con acolchado para asegurarse de que las ratas estén libres para moverse.
  2. Conecte la tubería, la bomba de microjeringa y la sonda de microdiálisis cerebral. Aproveche a la rata a través del orificio en la parte superior del dispositivo de sujeción para ratas y los giros de acero inoxidable.
  3. Encienda el controlador giratorio multicanal para evitar entrelazar las tuberías de microdiálisis durante el movimiento libre de la rata. Encienda la bomba de microjeringa y bombee la ACSF a una velocidad de 1 μL/min. Recolectar HECF periódicamente después de un equilibrio de 60 minutos del sistema de recolección de HECF de microdiálisis.
  4. Asegúrese de que el caudal de las muestras HECF en el colector de fracción refrigerada sea consistente con la infusión de ACSF. Recoger 20 μL de HECF y cambiar automáticamente al siguiente tubo de muestreo. Tenga cuidado de comprobar si la membrana de la sonda está dañada al insertar la sonda.

4. Medición de la presión osmótica para el HECF

  1. Encienda el osmómetro e inicie sesión en el sistema de detección. Haga clic en el botón Cal en la pantalla táctil y haga clic en el botón Res en la página para borrar la memoria de calibración anterior.
  2. Instale un tubo de 1,5 ml que contenga 100 μL de agua pura sin burbujas en el cabezal de medición. Tire del cabezal de medición hasta el fondo del recipiente de hidracina fría.
  3. Ingrese el número de muestra 0 en la pantalla táctil y confirme para probar. Sumerja rápidamente la aguja de diodo en el tubo de muestra y luego extraiga rápidamente para inducir la cristalización de la muestra a una temperatura de -6,2 °C.
  4. Espere a que aparezca la pantalla: Empuje la medida hacia arriba y haga clic en Cal y Cal 0 a su vez para calibrar. Realice mediciones con una solución de calibración de 300 mOsm y mida la presión osmótica de las muestras HECF como se describió anteriormente.
    NOTA: Limpie el cabezal de medición con una toalla de papel suave después de la calibración o medición. Las muestras de HECF sin burbujas deben mezclarse bien.

5. Mantenimiento del sistema y dispositivos de microdiálisis después del muestreo

  1. Saque la sonda de microdiálisis cerebral del catéter de la sonda después de la terminación del muestreo. Sumerja la sonda en agua desionizada y lave con agua desionizada durante 12 h para eliminar las deposiciones de sal varadas de la tubería y la sonda.
  2. Retirar la sonda para colocarla en una solución de tripsina al 0,05% a 4 °C. Secar las tuberías en un horno secado al aire a 25 °C y almacenarlas a temperatura ambiente.
    NOTA: Las sondas de microdiálisis son caras y este paso puede aumentar la reutilización de las sondas. Las proteínas que se adhieren a la superficie de la sonda pueden ser digeridas por la solución de tripsina para evitar que la membrana de la sonda sea bloqueada por las proteínas, y la tripsina no tuvo ningún efecto sobre el material de la sonda.

6. Tratamiento de los animales después de la toma de muestras

  1. Después del muestreo, eutanasia sin dolor a las ratas haciéndolas inhalar 1,5% de isoflurano, seguido de una sobredosis de isoflurano al 5% de acuerdo con la ética animal.

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Resultados

Siguiendo el protocolo experimental anterior y los parámetros de muestreo establecidos en la Tabla 1, se obtuvo HECF de rata similar al agua, incolora y transparente a la velocidad de muestreo establecida (Figura 1K). La presión osmótica del HECF de rata obtenido fue de 290-310 mOsm/L, lo que puede asegurar indirectamente la calidad de las muestras18,19.

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Discusión

La patogénesis de las enfermedades del SNC aún no se comprende completamente, lo que dificulta el desarrollo de nuevas terapias y medicamentos. Estudios han demostrado que la mayoría de las enfermedades del SNC están estrechamente relacionadas con las lesiones del hipocampo20,21,22. La técnica de microdiálisis cerebral propuesta puede dirigirse a regiones específicas del cerebro, especialmente el hipocampo, lo que lo hace...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82104533), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan (2021YJ0175) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2020M683273). Los autores desean agradecer al Sr. Yuncheng Hong, ingeniero senior de equipos de Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapur) por la prestación de servicios técnicos para la técnica de microdiálisis.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
 Air-drying ovenSuzhou Great Electronic Equipment Co., LtdGHG-9240A
Animal anesthesia systemRayward Life Technology Co., LtdR500IE
Animal temperature maintainerRayward Life Technology Co., Ltd69020
Artificial cerebrospinal fluidBeijing leagene biotech. Co., LtdCZ0522
Brain microdialysis probe CMA Microdialysis ABT56518
Catheter CMA Microdialysis ABT56518
Covance infusion harnessInstech Laboratories, Inc.CIH95
Denture base resinsShanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd190732
Electric cranial drillRayward Life Technology Co., Ltd78001
Electric shaverRayward Life Technology Co., LtdCP-5200
Free movement tank for animals CMA Microdialysis ABCMA120
Heparin sodium injectionChengdu Haitong Pharmaceutical Co., LtdH51021208
IodophorSichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd202201
IsofluranRayward Life Technology Co., LtdR510-22
Microdialysis catheter stylet CMA Microdialysis AB8011205
Microdialysis collection tube CMA Microdialysis AB7431100
Microdialysis collector CMA Microdialysis ABCMA4004
Microdialysis fep tubing CMA Microdialysis AB3409501
Microdialysis in vitro stand CMA Microdialysis ABCMA130
Microdialysis microinjection pump CMA Microdialysis AB788130
Microdialysis syringe (1.0 mL) CMA Microdialysis AB8309020
Microdialysis tubing adapter CMA Microdialysis AB3409500
Non-absorbable surgical suturesShanghai Tianqing Biological Materials Co., LtdS19004
Ophthalmic forcepsRayward Life Technology Co., LtdF12016-15
OsmometerLöserOM 807
Sodium hyaluronate eye dropsURSAPHARM Arzneimittel GmbHH20150150
Stereotaxie apparatusRayward Life Technology Co., Ltd68025
Surgical scissorsRayward Life Technology Co., LtdS14014-15
Surgical scissorsShanghai Bingyu Fluid technology Co., LtdBY-103
Syringe needle CMA Microdialysis ABT56518
Trypsin solutionBoster
Biological Technology, Ltd.		PYG0107
Ultrasonic cleanerGuangdong Goote Ultrasonic Co., LtdKMH1-240W8101

Referencias

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