Collecte dynamique en temps réel de liquide extracellulaire hippocampique de rats conscients à l’aide d’un système de microdialyse

Résumé

Le protocole fournit ici un échantillonnage dynamique détaillé en temps réel du liquide extracellulaire de l’hippocampe de rats éveillés à l’aide d’un système de microdialyse.

Résumé

Diverses maladies du système nerveux central (SNC) sont associées à des changements dans la composition du liquide extracellulaire hippocampique (HECF). Cependant, la difficulté d’obtenir des HECF en temps réel à partir de rats conscients a longtemps limité l’évaluation de la progression de la maladie du SNC et l’efficacité de la thérapie ethnomédicale. Il est encourageant de constater qu’une technique de microdialyse cérébrale peut être utilisée pour l’échantillonnage continu avec les avantages de l’observation dynamique, de l’analyse quantitative et d’une petite taille d’échantillonnage. Cela permet de surveiller les changements dans la teneur en liquide extracellulaire pour les composés des herbes traditionnelles et leurs métabolites dans le cerveau des animaux vivants. Le but de cette étude était donc d’implanter avec précision une sonde de microdialyse du liquide céphalorachidien dans la région hippocampique de rats Sprague Dawley (SD) avec un appareil stéréotaxique cérébral tridimensionnel, coupant des poids moléculaires supérieurs à 20 kDa. Le HECF de haute qualité a ensuite été obtenu à partir de rats conscients à l’aide d’un système de contrôle d’échantillonnage par microdialyse avec un taux d’échantillonnage réglable de 2,87 nL/min à 2,98 mL/min. En conclusion, notre protocole fournit une méthode efficace, rapide et dynamique pour obtenir HECF chez des rats éveillés à l’aide de la technologie de microdialyse, ce qui nous offre des possibilités illimitées d’explorer davantage la pathogenèse des maladies liées au SNC et d’évaluer l’efficacité des médicaments.

Introduction

Les maladies du système nerveux central (SNC) à forte morbidité, telles que les maladies neurodégénératives, les lésions cérébrales traumatiques, les lésions cérébrales induites par l’hypoxie à haute altitude et les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, sont des causes cruciales de la mortalité croissante dans le monde ^1,2,3. La surveillance en temps réel des cytokines et des changements protéiques dans des régions spécifiques du cerveau contribue à la précision diagnostique des maladies du SNC et des études pharmacocinétiques du cerveau après la médication. La recherche scientifique traditionnelle utilise l’homogénat de tissu cérébral ou une collection manuelle de liquide cérébral interstitiel animal pour la détection de substances spécifiques et pour les études pharmacocinétiques. Toutefois, cela présente certaines lacunes, telles qu’une taille d’échantillon limitée, l’incapacité d’observer dynamiquement les changements d’indicateurs et une qualité d’échantillonnage inégale ^4,5,6. Le liquide céphalorachidien, un liquide interstitiel, protège le cerveau et la moelle épinière contre les dommages mécaniques. Sa composition est différente de celle du sérum en raison de l’existence de la barrière hémato-encéphalique (BHE)⁷. L’analyse directe d’échantillons de liquide céphalorachidien est plus propice à la divulgation du mécanisme des lésions du SNC et à la découverte de médicaments. Inévitablement, les échantillons de liquide céphalorachidien, obtenus manuellement directement à partir de la citerne magna et des ventricules cérébraux à l’aide d’une seringue, présentent des inconvénients de contamination du sang, une chance aléatoire de prélèvement d’échantillons, une incertitude de quantité et presque aucune possibilité de prélèvement multiple ^8,9. Plus particulièrement, les méthodes conventionnelles d’échantillonnage interstitiel des fluides cérébraux ne permettent pas d’obtenir des échantillons des régions cérébrales endommagées, ce qui entrave l’exploration de la pathogenèse des maladies du SNC dans des régions spécifiques du cerveau et l’évaluation de l’efficacité des thérapies ethnomédicales ciblées ^9,10.

La microdialyse cérébrale est une technique d’échantillonnage du liquide cérébral interstitiel chez les animaux éveillés¹¹. Le système de microdialyse imite la perméabilité vasculaire à l’aide d’une sonde implantée dans le cerveau. La sonde de microdialyse est armée d’une membrane semi-perméable et est implantée dans des régions spécifiques du cerveau. Après perfusion avec du liquide céphalorachidien artificiel isotonique (ACSF), le liquide cérébral interstitiel dialysé peut être recueilli favorablement avec les avantages de la petite taille des échantillons, de l’échantillonnage continu et de l’observation dynamique^12,13. En termes d’emplacement, les sondes de microdialyse cérébrale peuvent être implantées sélectivement dans des structures cérébrales ou des citernes crâniennes d’intérêt¹⁴. L’observation de niveaux anormaux d’une substance endogène dans le liquide extracellulaire de l’hippocampe (HECF) suggère l’apparition de maladies du SNC ou la pathogenèse de la maladie. Plusieurs études ont montré que les biomarqueurs des maladies du SNC, tels que les acides aminés D dans la schizophrénie, les protéines β-amyloïdes et tau dans la maladie d’Alzheimer, les chaînes légères de neurofilaments dans les lésions cérébrales traumatiques et l’ubiquitine carboxy-terminale hydrolase L1s dans l’encéphalopathie hypoxique ischémique, peuvent être analysés dans le liquide céphalorachidien^15,16,17 . Une méthode d’analyse chimique basée sur la technique d’échantillonnage par microdialyse cérébrale peut être utilisée pour surveiller les changements dynamiques de composés exogènes tels que les principes actifs de l’ethnomédecine, qui diffusent et distribuent dans des régions spécifiques du cerveau¹⁴.

Cet article présente le processus spécifique d’acquisition dynamique de HECF chez les rats éveillés et mesure sa pression osmotique pour assurer la qualité de l’échantillon.

Protocole

Le protocole expérimental a été mené conformément aux exigences du Comité sur l’utilisation d’animaux de laboratoire et le soin et l’utilisation des animaux institutionnels de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (numéro d’enregistrement: 2021-11). Des rats Sprague Dawley (SD) mâles (280 ± 20 g, âgés de 6 à 8 semaines) ont été utilisés pour la présente étude.

1. Chirurgie d’implantation de sonde de microdialyse cérébrale

1. Utiliser de l’isoflurane à 3 % et 1,5 % pour l’induction et le maintien de l’anesthésie du rat, respectivement, en utilisant un système d’anesthésie animale dans un mélange air-oxygène à 0,6 L/min. Assurez-vous que les rats sont anesthésiés en profondeur sans réflexe douloureux et réflexe cornéen. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
2. Retirez la fourrure sur le crâne du rat anesthésié à l’aide d’un rasoir électrique dans la zone de préparation. Ensuite, fixez le rat anesthésié sur un localisateur cérébral stéréotaxique. Désinfectez le site chirurgical avant l’opération en appliquant de la povidone iodée et de l’éthanol 3x sur la région de la chirurgie avec une boule de coton stérile. Appliquer la bupivacaïne par voie topique pour l’analgésie locale. REMARQUE : L’ensemble du processus d’acquisition d’échantillons HECF par microdialyse est illustré à la figure 1.
3. Faites une incision craniofaciale de 1,5 cm au milieu avec des ciseaux chirurgicaux et retirez le périoste à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces ophtalmiques.
4. Considérez le bregma comme position basale et percez l’endocrâne pour percer une ouverture de 2 mm en position antéropostérieure (AP) (-2 mm), en position médiolatérale (ML) (-3,5 mm) et en position dorso-ventrale (DV) (-3,5 mm) (région CA1 de l’hippocampe) à l’aide d’une perceuse crânienne.
5. Fixez le stylet du cathéter sur la pince d’un localisateur cérébral stéréotaxique et ajustez la position de l’enveloppe de microdialyse aux positions AP (-2 mm), ML (-3,5 mm) et DV (0 mm). Ajustez la valeur DV du localisateur stéréo cérébral et implantez le boîtier de microdialyse dans la région CA1 à une profondeur de 3,5 mm.
   REMARQUE : Maintenir la température de l’animal à 37 °C pendant l’opération à l’aide d’un mainteneur de la température de l’animal.
6. Percez trois autres ouvertures d’un diamètre de 2 mm de sorte que les trois ouvertures forment un triangle dans lequel l’ouverture de la sonde est située au centre. L’implant se visse dans les ouvertures à une profondeur de 1 mm.
7. Fixez le cathéter de sonde avec du ciment dentaire et utilisez une suture chirurgicale 4-0 pour fermer la peau. Voir la figure 2 pour l’emplacement de la sonde.
8. Placez le rat dans des cages pendant 7 jours pour récupérer. Infiltrer localement la bupivacaïne (1,5 mg/kg) une fois par jour après la chirurgie.  Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum. Utilisez des gouttes ophtalmiques à base d’hyaluronate de sodium 3 fois par jour pour prévenir la sécheresse après l’opération.
   REMARQUE: Effectuez toutes les procédures dans une salle d’opération stérile. Ne laissez pas l’animal sans surveillance tant qu’il n’a pas repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale dans des conditions de 37 °C. Ne retournez pas l’animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli.

2. Connexion du système de microdialyse et vérification de la sonde

1. Connectez la pompe de microdialyse, la microseringue, le dispositif d’activité éveillée et le collecteur d’échantillons cryogéniques conformément aux instructions du fabricant. Installez la microseringue avec ACSF sur la pompe de microdialyse et réglez la pompe de microdialyse à un débit de 1 μL/min pour évacuer l’air dans le pipeline.
2. Connectez le pipeline et la sonde de microdialyse cérébrale (membrane: PAES; longueur de la membrane: 4 mm; membrane OD: 0,5 mm; coupure: 20 kDa; longueur de l’arbre: 14 mm). Faire fonctionner la pompe de microdialyse à un débit de 1 μL/min pour injecter de l’ACSF dans la sonde jusqu’à ce que la surface de la sonde soit légèrement humide. Immerger la sonde dans la solution injectable d’héparine sodique pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE: Si un grand flux de l’ACSF tombe de la membrane semi-perméable de la sonde, comme on le voit à l’œil nu sous gravité, remplacez la sonde par une nouvelle.

3. Collecte de HECF du rat éveillé

1. Insérez la sonde de microdialyse cérébrale dans le cathéter de la sonde et placez le rat dans une chambre (hauteur: 360 mm; diamètre: 400 mm) avec un rembourrage pour vous assurer que les rats sont libres de se déplacer.
2. Connectez le pipeline, la pompe à microseringue et la sonde de microdialyse cérébrale. Attelez le rat par le trou situé au sommet du dispositif de retenue pour rats et les émerillons en acier inoxydable.
3. Allumez le contrôleur pivotant multicanal pour éviter d’entrelacer les pipelines de microdialyse pendant la libre circulation du rat. Allumez la pompe à microseringue et pompez l’ACSF à une vitesse de 1 μL/min. Collecter périodiquement les HECF après un équilibrage de 60 minutes du système de collecte HECF de microdialyse.
4. S’assurer que le débit des échantillons HECF dans le collecteur de fractions réfrigérées est compatible avec la perfusion ACSF. Prélever 20 μL de HECF et passer automatiquement au tube d’échantillonnage suivant. Prenez soin de vérifier si la membrane de la sonde est endommagée lors de l’insertion de la sonde.

4. Mesure de la pression osmotique pour le HECF

1. Allumez l’osmomètre et connectez-vous au système de détection. Cliquez sur le bouton Cal sur l’écran tactile et cliquez sur le bouton Res sur la page pour effacer la mémoire d’étalonnage précédente.
2. Installez un tube de 1,5 mL contenant 100 μL d’eau pure sans bulles sur la tête de mesure. Tirez la tête de mesure vers le fond du récipient d’hydrazine froide.
3. Entrez le numéro d’échantillon 0 sur l’écran tactile et confirmez le test. Trempez rapidement l’aiguille de la diode dans le tube à échantillon, puis retirez-la rapidement pour induire la cristallisation de l’échantillon à une température de -6,2 °C.
4. Attendez que l’écran s’affiche: Appuyez sur la mesure tête haute et cliquez sur Cal et Cal 0 à tour de rôle pour calibrer. Effectuer des mesures avec une solution d’étalonnage à 300 mOsm et mesurer la pression osmotique des échantillons HECF comme décrit ci-dessus.
   REMARQUE: Essuyez la tête de mesure avec une serviette en papier doux après l’étalonnage ou la mesure. Les échantillons HECF sans bulles doivent être bien mélangés.

5. Maintenance du système et des dispositifs de microdialyse après l’échantillonnage

1. Retirez la sonde de microdialyse cérébrale du cathéter de sonde après l’arrêt du prélèvement. Immergez la sonde dans de l’eau désionisée et lavez-la avec de l’eau désionisée pendant 12 h pour éliminer les dépôts de sel échoués de la canalisation et de la sonde.
2. Retirer la sonde pour la placer dans une solution de trypsine à 0,05 % à 4 °C. Sécher les canalisations dans une étuve à séchage à l’air à 25 °C et les conserver à température ambiante.
   REMARQUE: Les sondes de microdialyse sont coûteuses et cette étape peut augmenter la réutilisation des sondes. Les protéines qui adhèrent à la surface de la sonde peuvent être digérées par une solution de trypsine pour empêcher la membrane de la sonde d’être bloquée par des protéines, et la trypsine n’a eu aucun effet sur le matériau de la sonde.

6. Traitement des animaux après échantillonnage

1. Après l’échantillonnage, euthanasier sans douleur les rats en leur faisant inhaler 1,5% d’isoflurane, suivi d’une surdose d’isoflurane à 5% conformément à l’éthique animale.

Résultats

En suivant le protocole expérimental ci-dessus et les paramètres d’échantillonnage définis dans le tableau 1, un HECF de rat semblable à l’eau, incolore et transparent a été obtenu à la fréquence d’échantillonnage définie (figure 1K). La pression osmotique du HECF de rat obtenu était de 290-310 mOsm/L, ce qui peut indirectement assurer la qualité des échantillons^18,19.

Discussion

La pathogenèse des maladies du SNC n’est pas encore entièrement comprise, ce qui entrave le développement de nouvelles thérapies et médicaments. Des études ont montré que la plupart des maladies du SNC sont étroitement liées aux lésions de l’hippocampe^20,21,22. La technique de microdialyse cérébrale proposée peut cibler des régions spécifiques du cerveau, en particulier l’hippocampe, ce qui la distingue de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-drying oven	Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd	GHG-9240A
Animal anesthesia system	Rayward Life Technology Co., Ltd	R500IE
Animal temperature maintainer	Rayward Life Technology Co., Ltd	69020
Artificial cerebrospinal fluid	Beijing leagene biotech. Co., Ltd	CZ0522
Brain microdialysis probe	CMA Microdialysis AB	T56518
Catheter	CMA Microdialysis AB	T56518
Covance infusion harness	Instech Laboratories, Inc.	CIH95
Denture base resins	Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd	190732
Electric cranial drill	Rayward Life Technology Co., Ltd	78001
Electric shaver	Rayward Life Technology Co., Ltd	CP-5200
Free movement tank for animals	CMA Microdialysis AB	CMA120
Heparin sodium injection	Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd	H51021208
Iodophor	Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd	202201
Isofluran	Rayward Life Technology Co., Ltd	R510-22
Microdialysis catheter stylet	CMA Microdialysis AB	8011205
Microdialysis collection tube	CMA Microdialysis AB	7431100
Microdialysis collector	CMA Microdialysis AB	CMA4004
Microdialysis fep tubing	CMA Microdialysis AB	3409501
Microdialysis in vitro stand	CMA Microdialysis AB	CMA130
Microdialysis microinjection pump	CMA Microdialysis AB	788130
Microdialysis syringe (1.0 mL)	CMA Microdialysis AB	8309020
Microdialysis tubing adapter	CMA Microdialysis AB	3409500
Non-absorbable surgical sutures	Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd	S19004
Ophthalmic forceps	Rayward Life Technology Co., Ltd	F12016-15
Osmometer	Löser	OM 807
Sodium hyaluronate eye drops	URSAPHARM Arzneimittel GmbH	H20150150
Stereotaxie apparatus	Rayward Life Technology Co., Ltd	68025
Surgical scissors	Rayward Life Technology Co., Ltd	S14014-15
Surgical scissors	Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd	BY-103
Syringe needle	CMA Microdialysis AB	T56518
Trypsin solution	Boster Biological Technology, Ltd.	PYG0107
Ultrasonic cleaner	Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd	KMH1-240W8101