Establecimiento y caracterización de modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de carcinoma anaplásico de tiroides y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello

Resumen

El presente protocolo establece y caracteriza un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), ya que los modelos PDX se están convirtiendo rápidamente en el estándar en el campo de la oncología traslacional.

Resumen

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) preservan fielmente las características histológicas y genéticas del tumor primario y mantienen su heterogeneidad. Los resultados farmacodinámicos basados en modelos PDX están altamente correlacionados con la práctica clínica. El carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) es el subtipo más maligno de cáncer de tiroides, con fuerte invasividad, mal pronóstico y tratamiento limitado. Aunque la tasa de incidencia de ATC representa solo el 2% -5% del cáncer de tiroides, su tasa de mortalidad es tan alta como 15% -50%. El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es una de las neoplasias malignas de cabeza y cuello más comunes, con más de 600,000 casos nuevos en todo el mundo cada año. En este documento, se presentan protocolos detallados para establecer modelos PDX de ATC y HNSCC. En este trabajo, se analizaron los factores clave que influyen en la tasa de éxito de la construcción del modelo y se compararon las características histopatológicas entre el modelo PDX y el tumor primario. Además, la relevancia clínica del modelo se validó mediante la evaluación de la eficacia terapéutica in vivo de fármacos representativos utilizados clínicamente en los modelos PDX construidos con éxito.

Introducción

El modelo PDX es un modelo animal en el que el tejido tumoral humano se trasplanta en ratones inmunodeficientes y crece en el ambiente proporcionado por los ratones¹. Los modelos tradicionales de líneas celulares tumorales sufren de varias desventajas, como la falta de heterogeneidad, la incapacidad de retener el microambiente tumoral, la vulnerabilidad a las variaciones genéticas durante los pasajes in vitro repetidos y la aplicación clínica deficiente ^2,3. Los principales inconvenientes de los modelos animales genéticamente modificados son la pérdida potencial de las características genómicas de los tumores humanos, la introducción de nuevas mutaciones desconocidas y la dificultad para identificar el grado de homología entre los tumores de ratón y los tumores humanos⁴. Además, la preparación de modelos animales genéticamente modificados es costosa, lenta y relativamente ineficiente⁴.

El modelo PDX tiene muchas ventajas sobre otros modelos tumorales en cuanto a reflejar la heterogeneidad tumoral. Desde la perspectiva de la histopatología, aunque la contraparte del ratón reemplaza al estroma humano con el tiempo, el modelo PDX preserva bien la estructura morfológica del tumor primario. Además, el modelo PDX conserva la identidad metabolómica del tumor primario durante al menos cuatro generaciones y refleja mejor las complejas interrelaciones entre las células tumorales y su microambiente, lo que lo hace único en la simulación del crecimiento, la metástasis, la angiogénesis y la inmunosupresión del tejido tumoral humano ^5,6,7. A nivel celular y molecular, el modelo PDX refleja con precisión la heterogeneidad intertumoral e intratumoral de los tumores humanos, así como las características fenotípicas y moleculares del cáncer original, incluidos los patrones de expresión génica, el estado de mutación, el número de copias y la metilación del ADN y la proteómica ^8,9. Los modelos PDX con diferentes pasajes tienen la misma sensibilidad a la terapia farmacológica, lo que indica que la expresión génica de los modelos PDX es altamente estable^10,11. Estudios han demostrado una excelente correlación entre la respuesta del modelo PDX a un fármaco y las respuestas clínicas de los pacientes a ese fármaco^12,13. Por lo tanto, el modelo PDX se ha convertido en un poderoso modelo de investigación preclínica y traslacional, particularmente para la detección de fármacos y la predicción del pronóstico clínico.

El cáncer de tiroides es un tumor maligno común del sistema endocrino y es una neoplasia maligna humana que ha mostrado un rápido aumento de la incidencia en los últimos años¹⁴. El carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) es el cáncer de tiroides más maligno, con una mediana de supervivencia del paciente de sólo 4,8 meses¹⁵. Aunque sólo una minoría de los pacientes con cáncer de tiroides son diagnosticados con ATC cada año en China, la tasa de mortalidad es cercana al 100%^16,17,18. El ATC generalmente crece rápidamente e invade los tejidos adyacentes del cuello, así como los ganglios linfáticos cervicales, y aproximadamente la mitad de los pacientes tienen metástasis a distancia^19,20. El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más común en el mundo y una de las principales causas de muerte por cáncer, con un estimado de 600,000 personas que sufren de HNSCC cada año^21,22,23. El HNSCC incluye una gran cantidad de tumores, incluidos los de la nariz, los senos paranasales, la boca, las amígdalas, la faringe y la laringe²⁴. ATC y HNSCC son dos de las principales neoplasias malignas de cabeza y cuello. Para facilitar el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos y tratamientos personalizados, es necesario desarrollar modelos animales preclínicos robustos y avanzados, como los modelos PDX de ATC y HNSCC.

Este artículo presenta métodos detallados para establecer el modelo PDX subcutáneo de ATC y HNSCC, analiza los factores clave que afectan la tasa de toma del tumor en la construcción del modelo y compara las características histopatológicas entre el modelo PDX y el tumor primario. Mientras tanto, en este trabajo, se realizaron pruebas farmacodinámicas in vivo utilizando los modelos PDX construidos con éxito para validar su relevancia clínica.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y protocolos de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan. Para el presente estudio se utilizaron ratones inmunodeficientes NOD-SCID de 4 a 6 semanas de edad (de ambos sexos) y ratones desnudos Balb/c hembras de 4 a 6 semanas de edad. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). El comité de ética del West China Hospital autorizó el estudio con sujetos humanos (protocolo número 2020353). Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito.

1. Preparación experimental

1. Coloque cuchillas desechables, tijeras y pinzas esterilizadas y otros instrumentos necesarios para el trasplante de tumores, colóquelos en el banco de trabajo ultralimpio e irradie con luz ultravioleta por adelantado.
2. Prepare solución salina estéril y placas de Petri para usar durante la prueba.

2. Adquisición y transporte de tejido tumoral fresco

1. Obtenga muestras frescas de tumores (generalmente de más de 5 mm x 5 mm de tamaño) del quirófano y colóquelas en un tubo centrífugo de 15 ml o 50 ml que contenga solución estéril de HTK (consulte la Tabla de materiales) o solución salina. Etiquete los tubos de la centrífuga.
   NOTA: Se obtuvieron muestras tumorales frescas mediante extirpación quirúrgica o punción de pacientes con ATC o HNSCC.
2. Coloque los tubos de la centrífuga en una nevera preparada de antemano.
   NOTA: Durante este tiempo, el operador del trasplante debe preparar los elementos necesarios para el trasplante (consulte la Tabla de materiales).
3. Asegúrese de que el tiempo entre la recolección de muestras y el transporte al laboratorio para la construcción de PDX no exceda las 2 h. Durante el transporte, rodee los tubos que contienen los tejidos con una mezcla de agua helada o bolsas de hielo para preservar la actividad del tejido.

3. Trasplante de tumores

1. Una vez que los tejidos tumorales lleguen al laboratorio, regístrelos y vuelva a numerarlos.
   NOTA: Para el presente estudio, la información del paciente se mantuvo estrictamente confidencial. Los pasos restantes del procedimiento se realizaron en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Al ingresar al laboratorio, se recomienda usar una bata sobre la ropa de trabajo o ropa protectora, un sombrero y una máscara. El tratamiento del tejido tumoral se lleva a cabo en un gabinete de bioseguridad.
2. Desinfecte los tubos de centrífuga que contienen los tejidos tumorales con alcohol al 75% y colóquelos en la mesa de operaciones. Transfiera los tejidos tumorales a placas de Petri de 6 cm llenas de solución salina utilizando fórceps oftálmicos esterilizados. A continuación, córtalos en trozos pequeños de aproximadamente 2 mm x 2 mm y 3 mm x 3 mm con una cuchilla.
3. Transfiera los pedazos de tejidos tumorales a una placa de Petri de 6 cm que contenga la cantidad adecuada de solución salina, envuelva el plato con la película de sellado, colóquelo en una nevera y llévelo a la sala de animales libre de patógenos específicos (SPF) junto con los instrumentos necesarios (un par de tijeras, fórceps y agujas de inoculación).
4. Prepare al animal siguiendo los pasos a continuación.
   1. Retire el vello en el tórax lateral derecho de ratones inmunodeficientes hembra o macho NOD-SCID hembra o macho de 4-6 semanas de edad, y desinfecte la piel con alcohol al 75%. Anestesiar a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina (ver Tabla de materiales), y untar sus ojos con ungüento veterinario para prevenir la sequedad. Confirme la profundidad de la anestesia mediante la pérdida del reflejo pedal.
   2. Haga una incisión de 2 mm con tijeras a través de la piel en el centro del tórax lateral derecho de los ratones.
5. Tome una pieza tumoral de la placa de Petri y colóquela en la aguja de trócar de 2.4 mm x 2.0 mm (consulte la Tabla de materiales) con fórceps.
6. Sostenga el ratón, apriete la piel en el sitio de punción, use el trócar que contiene las piezas tumorales para insertar el tumor a través de la incisión inicial de piel de 2 mm, muévase hacia la parte posterior del hombro y empuje el núcleo del trócar.
7. Asegúrese de que la pieza tumoral se empuje hacia afuera y se deje en el seno de transición formado por la punción del trócar, y luego saque el trócar.
8. Si el tumor se mueve con la aguja cuando se retira, use el trócar para restablecerlo y suturar la incisión.
   NOTA: En este estudio, cada ratón fue inoculado en las extremidades dorsales anteriores y posteriores. Se inocularon de uno a tres ratones por muestra tumoral de cada paciente según el tamaño del tumor.

4. Preservación del tejido tumoral, fijación y congelación de proteínas

NOTA: Los tejidos tumorales restantes se utilizaron para la preservación de semillas, la fijación y la congelación de ADN / ARN / proteínas, respectivamente.

1. Retire la solución salina de la superficie del tumor con una gasa estéril antes de colocarla en el tubo de criopreservación para asegurarse de que la superficie del tumor no esté excesivamente húmeda.
2. Coloque de cuatro a seis piezas de tejido tumoral de 2 mm x 2 mm en un tubo de criopreservación de células de 2 ml, agregue 1 ml de solución de criopreservación compuesta de suero bovino fetal al 90% (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en el tubo, coloque el tubo en una caja de enfriamiento de gradiente, congélelo a -80 ° C durante la noche y, finalmente, Transfiéralo a nitrógeno líquido.
3. Coloque los bloques de tejido tumoral de 3 mm x 3 mm en formalina tamponada al 10% para la fijación tisular para el examen patológico.
4. Coloque el bloque de tejido de 3 mm x 3 mm en un tubo de criopreservación celular de 2 ml, congélelo rápidamente en nitrógeno líquido y luego transfiéralo a un refrigerador de -80 ° C para la extracción de ADN / ARN y proteínas.
5. Recopilar la información clínica de los pacientes, como los antecedentes de tabaquismo, el tamaño del tumor, la diferenciación, el subtipo patológico, el grado de cáncer, el estadio del cáncer, la metástasis a distancia, el origen, la historia clínica, la inmunohistoquímica, la infección por el virus del papiloma humano (VPH) en pacientes con HNSCC y la medicación del tratamiento.

5. Pasaging, criopreservación y reanimación de tumores modelo PDX

1. Mida la longitud y el ancho de los tumores subcutáneos en ratones utilizando calibradores vernier una vez a la semana, y calcule el volumen del tumor de acuerdo con la fórmula: volumen tumoral = 0.5 × largo × ancho². Dibujar la curva de crecimiento del tumor.
2. Cuando el tumor PDX alcanza los 2.000 mm³, pasarlo a la siguiente generación de ratones y realizar un nuevo trasplante del tumor. Realice la preparación de los instrumentos siguiendo el paso 4.
3. Eutanasia a los ratones por luxación cervical después de anestesiar con 80 mg/kg de ketamina.
4. Desinfectar la piel con alcohol al 75%. Luego, corte la piel que rodea el tumor con tijeras, luego retire el tumor con fórceps y colóquelo en una placa de Petri.
5. Realice el procedimiento de trasplante de tumor siguiendo el paso 3.
6. Realizar la preservación y criopreservación de los tumores modelo PDX siguiendo el paso 4.
7. Para la reanimación del tejido tumoral, siga el principio de congelación lenta y disolución rápida. Después de extraer los crioviales del nitrógeno líquido, colóquelos rápidamente en un baño de agua a 37 ° C para una rápida disolución.
8. Agite suavemente los crioviales en el baño de agua para acelerar el proceso de descongelación.
9. Descongelar, transferir las piezas tumorales a la solución salina normal preparada para el lavado y luego inocular a la próxima generación de ratones. Para la operación específica, consulte el procedimiento de trasplante de tejido en el paso 3.

6. Determinación de la eficacia terapéutica de lenvatinib y cisplatino en el modelo ATC PDX

NOTA: Se utilizó el modelo ATC PDX para probar el efecto terapéutico del inhibidor de la tirosina cinasa lenvatinib y del fármaco quimioterapéutico cisplatino^25,26,27.

1. Seleccione el tejido tumoral de generación P5 de un modelo ATC PDX (THY-017), corte en trozos de tejido de^2-4 mm 3 e inocule por vía subcutánea (paso 3) a la espalda derecha de diez ratones desnudos Balb/c hembra de 4-6 semanas.
2. Seleccione 15 ratones con volúmenes tumorales entre 50-150 mm³ y divídalos en tres grupos.
3. Administrar lenvatinib (10 mg/kg) por vía intragástrica a un grupo una vez al día durante 15 días, administrar cisplatino (3 mg/kg) por vía intraperitoneal a un grupo cada 3 días para un total de seis dosis, y administrar el grupo control con el mismo volumen de solución salina normal.
4. Mida el peso corporal y el volumen tumoral de los ratones dos veces por semana.
5. Al final de la prueba, sacrificar a los ratones (paso 5.3) y pesar los tumores.

Resultados

Se trasplantaron un total de 18 muestras de cáncer de tiroides y se construyeron con éxito cinco modelos PDX de cáncer de tiroides (tasa de toma de tumores del 27,8 %), incluidos cuatro casos de cáncer de tiroides indiferenciado y un caso de cáncer anaplásico de tiroides. Se analizó la correlación entre la tasa de éxito de la construcción del modelo y la edad, el sexo, el diámetro del tumor, el grado tumoral y la diferenciación. Aunque la tasa de éxito del modelo de muestras tumorales de grado 4 fue mayor qu...

Discusión

Este estudio ha establecido con éxito los modelos PDX subcutáneos de ATC y HNSCC. Hay muchos aspectos a los que prestar atención durante el proceso de construcción del modelo PDX. Cuando el tejido tumoral se separa del paciente, debe colocarse en la caja de hielo y enviarse al laboratorio para su inoculación lo antes posible. Después de que el tumor llega al laboratorio, el operador debe prestar atención al mantenimiento de un campo estéril y practicar procedimientos asépticos. Para las muestras de biopsia con a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm x 2.0 mm trocar	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-9065
Balb/c nude mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	401
Biosafety cabinet	Suzhou Antai	BSC-1300IIA2
Blade	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0823
Centrifuge tube	Corning	430791/430829
Cryopreservation tube	Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd	/
Custodiol HTK-Solution	Custodiol	2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	SIGMA-ALORICH	D5879-500mL
Electronic balance	METTLER	ME104
Electronic digital caliper	Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd	0-220
fetal bovine serum(FBS)	VivaCell	C04001-500
IBM SPSS Statistics 26	IBM
Ketamine	Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd	100761663
Lenvatinib	ApexBio	A2174
NOD SCID immunodeficient mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	406
Pen-Strep Solution	Biological Industries	03-03101BCS
Petri dish	WHB	WHB-60/WHB-100
Saline	Sichuan Kelun	W220051705
Scissor	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0110
Tweezer	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-1241
Vet ointment	Pfizer Inc.	P10015353
Xylazine	Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd	070031777