HPLC junto con huellas dactilares químicas para el reconocimiento de múltiples patrones para identificar la autenticidad de Clematidis armandii caulis

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para establecer la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), junto con el reconocimiento químico de huellas dactilares multipatrón, que proporciona una nueva estrategia para identificar eficazmente las variedades genuinas de Clematidis Armandii Caulis y sus adulterantes.

Resumen

Un método para identificar los materiales medicinales chinos y sus adulterantes relacionados se construyó tomando como ejemplo Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, una medicina tradicional china universalmente utilizada). Se analizaron y compararon diez lotes de variedades genuinas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes relacionados con la base de las huellas dactilares de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) combinadas con quimiometría, incluido el análisis de conglomerados (CA), el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-DA). Además, se determinó el contenido de β-sitosterol. Se estableció la huella dactilar química de control de Chuanmutong y se identificaron 12 picos comunes. La similitud entre la huella digital de 10 lotes de variedades genuinas de Chuanmutong y la huella digital de control fue de 0.910-0.989, mientras que la similitud de cinco lotes de adulterantes fue de solo 0.133-0.720. Sobre la base de los picos comunes en el cromatograma, 15 lotes de muestras se clasificaron en tres niveles de contenido por PCA, y se agregaron en cuatro categorías por CA, logrando una clara distinción entre Chuanmutong auténtico y adulterantes de Chuanmutong. Además, se encontraron siete componentes diferenciales que pueden identificar efectivamente Chuanmutong auténtico y adulterantes de Chuanmutong a través de OPLS-DA. El contenido de β-sitosterol de 10 lotes de variedades genuinas de Chuanmutong fue de 97.53-161.56 μg / g, mientras que el contenido de β-sitosterol de los cinco lotes de adulterantes varió mucho, entre los cuales el contenido de β-sitosterol de Clematis peterae Hand.-Mazz. y Clematis gouriana Roxb. var. finetii Rehd. et Wils. fue significativamente menor que la de las variedades auténticas de Chuanmutong. El contenido del componente del índice HPLC y el método de reconocimiento de huellas dactilares químicas de múltiples patrones establecido en este estudio proporcionan una nueva estrategia para identificar eficazmente los materiales medicinales chinos auténticos y los adulterantes relacionados.

Introducción

Chuanmutong, Caulis seco de Clematis armandii Franch. o Clematis montana Buch.-Ham., es una medicina tradicional china comúnmente utilizada en clínicas ^1,2,3. Se utiliza para tratar problemas urinarios, edema, llagas en la lengua y la boca, disminución de la secreción de leche, rigidez articular y dolor muscular causado por el calor húmedo⁴. Chuanmutong siempre se ha obtenido a partir de variedades silvestres, distribuidas principalmente en el suroeste de China, especialmente en Sichuan, donde la mejor calidad se puede encontrar ^5,6. Es difícil distinguir entre variedades auténticas y sus adulterantes estrechamente relacionados debido a sus características similares 7,8,9,10. El estándar de calidad de Chuanmutong en la edición 2020 de la Farmacopea China solo estipula las propiedades, la identificación microscópica y la identificación en capa delgada sin determinación de contenido, que no pueden identificar eficazmente los adulterantes y, por lo tanto, tienen riesgos potenciales. Además, hay pocos informes que comparen e identifican Chuanmutong y plantas relacionadas. En consecuencia, un método de control de calidad para garantizar la autenticidad de Chuanmutong es digno de estudio adicional.

Los componentes químicos de Chuanmutong están compuestos principalmente de triterpenoides pentacíclicos de tipo oleanano y sus glucósidos, flavonoides y ácidos orgánicos^11,12,13,14. Entre ellos, el ácido oleanólico, el β-sitosterol, el estigmasterol y el ergosterol tienen efectos diuréticos de diferentes intensidades, que pueden ser sustancias farmacodinámicas potenciales para promover la diuresis y aliviar la estranguria^15,16. Las huellas químicas se obtienen separando y detectando muchos componentes químicos contenidos en las muestras mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de gases (GC), etc. La adopción de métodos de análisis estadístico apropiados para analizar las características de Chuanmutong puede determinar el control de calidad general y la identificación científica de la medicina tradicional china^17,18,19.

En este estudio, se recolectaron 10 lotes de variedades auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes. Su calidad se comparó y analizó mediante el método de huellas dactilares HPLC combinado con el reconocimiento de patrones múltiples, incluido el análisis de conglomerados (AC), el análisis de componentes principales (PCA), el análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-CA) y la determinación del contenido del componente farmacodinámico. Este protocolo establece un método para identificar variedades auténticas con alta especificidad, una nueva estrategia para la identificación científica de variedades auténticas y adulterantes de materiales medicinales chinos.

Protocolo

1. Métodos de detección química de huellas dactilares

1. Condiciones cromatográficas
   1. Preparar la fase móvil acetonitrilo (A)/agua (B). Establezca un programa de degradado de la siguiente manera en el software HPLC: 0-20 min, 3%A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
   2. Mantener el caudal de la fase móvil a 1,0 mL/min.
   3. Realizar la separación cromatográfica en una columna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenida a 30 °C.
   4. Ajuste el volumen de inyección a 10 μL.
   5. Detectar las muestras a una longitud de onda de 205 nm.
      NOTA: Para los ajustes específicos de las condiciones cromatográficas, consulte los procedimientos operativos del software de trabajo de cromatografía líquida de alta resolución (Tabla de materiales).
2. Preparación de la solución de muestra
   1. Moler las materias primas a un tamaño de partícula uniforme pasándolas a través de una malla de nylon con un diámetro interior de 850 μm ± 29 μm.
   2. Introducir 2 g de materia prima molida (pesada con precisión) en un matraz cónico de 50 ml con un tapón y añadir 50 ml de metanol. Colocar el tapón en el matraz y ultrasonicar (600 W, 40 kHz) durante 30 min.
   3. A continuación, enfriar el matraz a temperatura ambiente (RT). Pese las muestras de nuevo y compense el peso inicial reemplazando el extractante perdido.
   4. Verter 4 ml de la solución de metanol que contiene los extractos medicinales en un matraz aforado de 10 ml. Agregue 6 ml de_H2O, mezcle y deje que se asiente durante 10 minutos.
   5. Finalmente, filtre el sobrenadante a través de una membrana filtrante de 0,45 μm y colóquelo en modo de espera.
3. Validación de los métodos de detección de huellas dactilares
   1. Preparar la muestra como se describe anteriormente (paso 1.2) y someterla al análisis de HPLC (paso 1.1) seis veces al día. Para evaluar la precisión, calcule la desviación típica relativa (RSD) del tiempo de retención relativo y las áreas de pico relativo, tal como se describe en el paso 1.3.5.
   2. Evaluar la estabilidad de la solución de muestra analizando la misma solución de muestra almacenada en RT durante 0, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 h, y calcular la DSR del tiempo de retención relativo y las áreas de pico relativo como se describe en el paso 1.3.5.
   3. Tome seis réplicas de la misma muestra (CMT-4), prepare la solución de muestra de acuerdo con el procedimiento anterior (paso 1.2) y detecte su huella digital en HPLC siguiendo el paso 1.1. Calcule la DSR del tiempo de retención relativo y las áreas pico relativas, y evalúe su repetibilidad como se describe en el paso 1.3.5.
   4. A continuación, utilice el pico número 10 de la figura 1B como pico de referencia y calcule la DSR del tiempo de retención relativo y el área de pico relativo de cada pico común como se describe en el paso 1.3.5.
   5. Utilice las fórmulas mencionadas a continuación para calcular el tiempo de retención relativo y el área de pico relativo de cada pico común:
      T _re = característica_T/T_{referencia
      A re = Unacaracterística/Areferencia}
      Donde T re = tiempo de retención relativo, característica T = tiempo de retención de pico característico, referencia T = tiempo de retención de pico de referencia, A _re = área de pico _relativa, A característica = área de pico característica y A_{referencia = área} de pico de _referencia.
      NOTA: El establecimiento de huellas dactilares de la medicina tradicional china generalmente requiere seleccionar un pico cromatográfico que sea fácil de obtener y tenga alta resolución. Esto se utiliza como un pico de referencia para identificar las huellas dactilares y examinar su estabilidad y reproducibilidad.

2. Establecimiento de la huella dactilar Chuanmutong y análisis de similitud

1. Use 10 lotes de muestras auténticas y cinco lotes de adulterantes como Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. var. finetii Rehd. et Wils (XS), y Clematis finetiana Levl. y Vaniot. (SMT) como muestras para el análisis de huellas dactilares.
2. Prepare las soluciones de ejemplo como se describe en el paso 1.2. Realice el análisis de huellas dactilares de todas las soluciones de muestra por HPLC de acuerdo con las condiciones descritas en el paso 1.1.
3. Importar los datos relevantes en el sistema de evaluación de similitud de huellas cromatográficas de la medicina tradicional china (SESCF-TCM, versión 2012). El sistema designará los picos con altura razonable y buena resolución en los cromatogramas de todas las muestras como picos comunes.
   NOTA: El software SESCF-TCM se puede descargar después de registrarse en el sitio web de la Comisión de la Farmacopea China (http://114.247.108.158:8888/login).
   1. En el software, haga clic en el botón Establecer espectro de referencia en el menú.
   2. A continuación, en la ventana Configuración de parámetros , establezca el Ancho de ventana de tiempo en 0,5 y seleccione Método de generación de espectro de control como método mediano.
   3. Haga clic en Calibración multipunto en el menú principal, luego seleccione Coincidencia de picos como Coincidencia de pico de espectro completo.
   4. Finalmente, haga clic en Generar control para generar la huella cromatográfica de referencia de la especie auténtica de Chuanmutong.
4. Importe el tiempo de retención y el área pico de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes en SESCF-TCM para su análisis. Las operaciones específicas son las siguientes:
   1. En el software, haga clic en el botón Establecer espectro de referencia en el menú principal.
   2. En la ventana Configuración de parámetros , establezca la huella digital cromatográfica de referencia de la especie auténtica de Chuanmutong como referencia, seleccione el Método de generación del espectro de control como Método mediano y establezca el Ancho de ventana de tiempo en 0,5.
   3. Haga clic en Calibración multipunto en el menú principal, luego seleccione Coincidencia de picos como Coincidencia de pico de espectro completo.
   4. Finalmente, haga clic en Calcular similitud para calcular la similitud basada en las huellas dactilares del cromatograma de referencia de Chuanmutong. Finalmente, calcule la similitud de las huellas dactilares utilizando el Sistema de evaluación cromatográfica de huellas dactilares de medicina china (versión 2012).
      NOTA: Para las operaciones específicas, consulte las especificaciones operativas del Sistema de evaluación cromatográfica de huellas dactilares de medicina china (versión 2012).

3. Análisis de reconocimiento de patrones múltiples de la huella dactilar de Chuanmutong

1. Análisis de conglomerados (CA)
   1. Utilice las áreas pico de 12 picos comunes en las huellas dactilares de 10 lotes de muestras auténticas de Chuanmutong y sus cinco lotes de adulterantes como variables, e introdúzcalos en el software de análisis estadístico para el análisis sistemático de conglomerados (CA).
   2. Elija el método entre grupos y utilice el coeficiente de correlación de Pearson como base de clasificación para dibujar un diagrama de análisis de conglomerados de Chuanmutong y sus adulterantes. Las operaciones específicas son las siguientes:
      1. En el software de análisis estadístico, haga clic en Archivo para importar datos.
      2. Haga clic en Análisis en el menú y luego haga clic en Agrupación de sistemas en Clasificación.
      3. Seleccione el área de pico común como variable y establezca el número de clústeres en cuatro.
      4. Haga clic en Método, seleccione el método de agrupación en clústeres como Conexión entre grupos, seleccione el intervalo de medición como Correlación de Pearson y haga clic en Aceptar para dibujar el mapa de CA.
2. Análisis de componentes principales (PCA)
   1. Importe el área pico común relativa de las variedades auténticas y sus adulterantes en el software de análisis para el análisis PCA, y use el mapa de puntaje PCA para evaluar el mapa de matriz de puntaje de las diferencias de muestra. Las operaciones específicas son las siguientes:
      1. Abra el software de análisis de datos, haga clic en Archivo en el menú y cree un nuevo proyecto regular. Importe el área de pico de 12 picos comunes en una hoja de cálculo (por ejemplo, formato Excel) desde el sistema HPLC. Luego haga clic en Finalizar para completar la importación de datos.
      2. Haga clic en Nuevo para crear un nuevo modelo para establecer el tipo de modelo con PCA. Haga clic en Autoajustar y Agregar para ajustar los datos, luego haga clic en Puntajes para obtener el mapa de puntaje PCA.
3. Análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-DA)
   1. Utilice el método de análisis de discriminación de mínimos cuadrados parciales ortogonales con modo de supervisión para analizar más a fondo los picos de área de pico comunes relativos de las variedades y adulterantes auténticos de Chuanmutong y dibujar un mapa de puntuación de clasificación OPLS-DA de todas las muestras. Las operaciones específicas son las siguientes:
      1. En el software de análisis de datos, haga clic en Archivo en el menú para importar un archivo y crear un nuevo proyecto regular. Importe el área máxima de 12 picos comunes en una hoja de cálculo desde el sistema HPLC y, a continuación, haga clic en Finalizar para completar la importación de datos.
      2. Haga clic en Nuevo para crear un nuevo modelo para establecer el tipo de modelo con PCA. Haga clic en Ajustar automáticamente y Agregar para ajustar los datos. Luego haga clic en Puntajes para obtener el mapa de puntaje de PCA.
      3. Haga clic en Nuevo y elija Nuevo como modelo uno para establecer el tipo de modelo con OPLS-DA.
      4. Haga clic en Escala y establezca el tipo con Par for All. Haga clic en Autoajustar primero y luego haga clic en Puntuaciones para obtener el mapa de puntuación OPLS-DA.
   2. Para determinar la influencia de cada pico común en Chuanmutong en sus resultados de clasificación y la diferencia entre los materiales auténticos de Chuanmutong y los adulterantes relacionados, use la variable importancia en la proyección (VIP) para el análisis.
   3. Dibuja el mapa VIP de los diferentes componentes de Chuanmutong. Utilice el mapa VIP resultante para evaluar el impacto de cada variable en la clasificación y para descartar los componentes que contribuyen significativamente a las diferencias entre los grupos. Las operaciones específicas son las siguientes:
      1. En el software de análisis de datos, haga clic en Analizar en el menú y haga clic en Permutaciones, establezca el número de permutaciones en 200 y obtenga la R 2 y la Q² del mapa de puntuación OPLS-DA.
      2. Haga clic en VIP y elija VIP Predictive para obtener el mapa VIP.

4. Determinación del β-sitosterol en Chuanmutong por HPLC

1. Condiciones cromatográficas (consulte el paso 1.1)
   1. Preparar la fase móvil: metanol-agua (97:3).
   2. Ajuste el caudal de la fase móvil a 1,0 ml/min.
   3. Realizar la separación cromatográfica en una columna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenida a 30 °C.
   4. Ajuste el volumen de inyección a 10 μL.
   5. Detecte el componente a una longitud de onda de 204 nm.
2. Preparación de la solución de muestra
   1. Preparar la solución patrón madre de β-sitosterol (0,1 mg/ml) disolviendo una cantidad pesada con precisión del patrón de referencia correspondiente en metanol.
   2. Moler la muestra de análisis de la materia prima hasta un tamaño de partícula uniforme pasando la muestra a través de la malla de nylon con un diámetro interior de 180 μm ± 7,6 μm.
   3. Introducir 2 g de materia prima molida (pesada con precisión) en un matraz de fondo redondo y añadirle 50 ml de cloroformo.
   4. Conecte el matraz a un condensador de reflujo y caliéntelo en un baño de agua hirviendo (ebullición moderada) durante 60 min. Filtrar la solución de extracción con un papel de filtro de 15-20 μm.
   5. Evaporar el filtrado hasta casi sequedad en un baño de agua hirviendo (ebullición moderada) durante unos 10 minutos.
   6. Disuelva el residuo y enrasar el volumen a 5 ml con metanol. Finalmente, pase el sobrenadante a través de una membrana de filtro de 0,45 μm y colóquelo en modo de espera.
3. Validación de métodos
   1. Tomar la solución madre de β-sitosterol preparada en la subetapa 4.2.1, diluirla con metanol al 100% y preparar soluciones con concentraciones de 100 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml, 50 μg/ml, 40 μg/ml, 30 μg/ml y 20 μg/ml.
   2. Inyectar las muestras bajo las condiciones cromatográficas descritas en el paso 4.1 para determinar el área de pico, realizar análisis de regresión con el área de pico al volumen de inyección y obtener la ecuación de regresión y el coeficiente de correlación para evaluar su linealidad.
   3. Preparar las muestras como se describe anteriormente (paso 4.2) y someterlas al análisis de HPLC (paso 4.1) seis veces el mismo día. Luego calcule el RSD de las áreas de pico para evaluar la precisión.
   4. Evalúe la estabilidad de la solución de muestra analizando las mismas soluciones de muestra almacenadas en RT durante 0, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 h, como se describe en el paso 4.1. A continuación, calcule la DSR de las zonas de pico como se describe en el paso 1.3.5.
   5. Examinar la repetibilidad disolviendo la misma muestra (CMT-4) en sextuplicato, preparada como se describe en el paso 4.2, y sometiéndola al análisis de HPLC como se describe en el paso 4.1. Luego calcule la RSD del contenido de β-sitosterol en seis muestras.
   6. Evalúe la precisión del método empleando el método de adición estándar. Para esto, agregue soluciones de referencia de β-sitosterol a las muestras al 80%, 100% y 120% del contenido de β-sitosterol y repita cada condición tres veces como se describe en el paso 4.1. Evalúe la precisión del método calculando la recuperación promedio y la DSR.
      NOTA: La fórmula de cálculo de la tasa de recuperación (RR) es la siguiente:
      RR % = [(M _t - M ₀) / M_s] × 100
      Donde M _t = la calidad del β-sitosterol después de agregar el patrón, M ₀ = la calidad de la solución de muestra y M_s = la calidad del β-sitosterol añadido.
4. Determinación del contenido de β-sitosterol de las muestras
   1. Tome 10 lotes de materiales medicinales chinos auténticos y cinco lotes de adulterantes relacionados para preparar soluciones de muestra de acuerdo con el paso 4.2.
   2. A continuación, inyecte cada solución de muestra y cada solución de referencia de β-sitosterol para determinar el área de pico en las condiciones descritas en el paso 4.1, y calcule el contenido de β-sitosterol de cada muestra utilizando el método estándar externo de un punto.

Resultados

Huella cromatográfica de Chuanmutong y análisis de similitud (SA)
Los valores de RSD del tiempo de retención relativo de precisión, repetibilidad y estabilidad fueron inferiores a 0,46%, 1,65% y 0,53%, respectivamente; los valores de RSD del área pico relativa fueron inferiores a 4,23%, 3,56% y 3,96%, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 1A, B, hubo 12 picos comunes distintos (desde el pico 1 hasta el pico 12) en las huellas dactilares de ...

Discusión

La recolección de muestras para la investigación es el primer paso clave para construir el reconocimiento de múltiples patrones en la identificación de la autenticidad de los materiales medicinales chinos. A través de la investigación de mercado, descubrimos que Sichuan Ya'an, Liangshan y Leshan son las principales áreas de producción de recursos silvestres de Chuanmutong. Las variedades relacionadas del mismo género también tienen la misma distribución geográfica ^6,20

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2017381038
Acetonitrile	Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China	WXBD5243V
β-Sitosterol	Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China	20210201
C18 column	Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Welch Ultimate LP
Chuanmutong	Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China	19020103	CMT-1
Chuanmutong	Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200701	CMT-2
Chuanmutong	Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200701	CMT-3
Chuanmutong	Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200901	CMT-4
Chuanmutong	Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	210701	CMT-5
Chuanmutong	Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	210401	CMT-6
Chuanmutong	Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200901	CMT-7
Chuanmutong	Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China	201201	CMT-8
Chuanmutong	Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China	201001	CMT-9
Chuanmutong	Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	210501	CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang	Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China	-	CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.	Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China	-	DC
Clematis peterae Hand.-Mazz.	Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China	-	DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils	Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China	-	XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot.	Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China	-	SMT
Electronic balance	Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China	FA1204
Ergosterol	Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China	20210201
Ethanol	Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China	2021112602
Ethyl acetate	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2017042043
Formic acid	Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China	2016062901
High performance liquid chromatography	Agilent, USA.	1260
IBM SPSS Statistics version 26.0	International Business Machines Corporation, USA	-
Methanol	Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China	WXBD6409V
Methanol	Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China	202010302
n-butyl alcohol	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2020071047
Petroleum ether	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2020090125
Phosphoric acid	Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	20200110
SESCF-TCM version 2012	National Pharmacopoeia Commission, China	-	http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol	Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China	20210201
Trichloromethane	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047	Umetrics, Sweden	-	https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine	Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China	UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner	Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China	KH3200E