HPLC accoppiato con impronte digitali chimiche per il riconoscimento multi-pattern per identificare l'autenticità di Clematidis armandii caulis

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), accoppiata con il riconoscimento multi-pattern delle impronte digitali chimiche, che fornisce una nuova strategia per identificare efficacemente le varietà autentiche di Clematidis Armandii Caulis e dei suoi adulteranti.

Abstract

Un metodo per identificare i materiali medicinali cinesi e i relativi adulteranti è stato costruito prendendo come esempio Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, una medicina tradizionale cinese universalmente usata). Dieci lotti di varietà Chuanmutong autentiche e cinque lotti di adulteranti correlati sono stati analizzati e confrontati sulla base delle impronte digitali della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) combinate con la chemiometria, tra cui l'analisi dei cluster (CA), l'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA). Inoltre, è stato determinato il contenuto di β-sitosterolo. È stata stabilita l'impronta chimica di controllo di Chuanmutong e sono stati identificati 12 picchi comuni. La somiglianza tra l'impronta digitale di 10 lotti di varietà Chuanmutong autentiche e l'impronta digitale di controllo era 0,910-0,989, mentre la somiglianza di cinque lotti di adulteranti era solo 0,133-0,720. Sulla base dei picchi comuni nel cromatogramma, 15 lotti di campioni sono stati classificati in tre livelli di contenuto dalla PCA e sono stati aggregati in quattro categorie da CA, ottenendo una chiara distinzione tra Chuanmutong autentico e adulteranti di Chuanmutong. Inoltre, sette componenti differenziali che possono identificare efficacemente l'autentico Chuanmutong e gli adulteranti di Chuanmutong sono stati trovati attraverso OPLS-DA. Il contenuto di β-sitosterolo di 10 lotti di varietà Chuanmutong autentiche era 97,53-161,56 μg / g, mentre il contenuto di β-sitosterolo dei cinque lotti di adulteranti variava notevolmente, tra cui il contenuto di β-sitosterolo di Clematis peterae Hand.-Mazz. e Clematis gouriana Roxb. finetii Rehd. et Wils. era significativamente inferiore a quello delle varietà autentiche di Chuanmutong. Il contenuto dei componenti dell'indice HPLC e il metodo di riconoscimento multi-pattern delle impronte digitali chimiche stabilito in questo studio forniscono una nuova strategia per identificare efficacemente i materiali medicinali cinesi autentici e i relativi adulteranti.

Introduzione

Chuanmutong, Caulis secco di Clematis armandii Franch. o Clematis montana Buch.-Ham., è una medicina tradizionale cinese comunemente usata nelle cliniche ^1,2,3. È usato per il trattamento di problemi urinari, edema, piaghe sulla lingua e sulla bocca, diminuzione della secrezione di latte, rigidità articolare e dolori muscolari causati dal calore umido⁴. Chuanmutong è sempre stato ottenuto da varietà selvatiche, distribuite principalmente nel sud-ovest della Cina, in particolare nel Sichuan, dove la migliore qualità può essere trovata ^5,6. È difficile distinguere tra varietà autentiche e adulteranti strettamente correlati a causa delle loro caratteristiche simili 7,8,9,10. Lo standard di qualità di Chuanmutong nell'edizione 2020 della Farmacopea cinese stabilisce solo le proprietà, l'identificazione microscopica e l'identificazione dello strato sottile senza determinazione del contenuto, che non possono identificare efficacemente gli adulteranti e quindi hanno potenziali rischi. Inoltre, ci sono pochi rapporti che confrontano e identificano Chuanmutong e piante correlate. Di conseguenza, un metodo di controllo della qualità per garantire l'autenticità di Chuanmutong merita ulteriori studi.

I costituenti chimici di Chuanmutong sono composti principalmente da triterpenoidi pentaciclici di tipo oleanano e dai loro glicosidi, flavonoidi e acidi organici^11,12,13,14. Tra questi, l'acido oleanolico, il β-sitosterolo, lo stigmasterolo e l'ergosterolo hanno effetti diuretici di diversa intensità, che possono essere potenziali sostanze farmacodinamiche per promuovere la diuresi e alleviare la stranguria^15,16. Le impronte digitali chimiche sono ottenute separando e rilevando molti componenti chimici contenuti nei campioni mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), gascromatografia (GC), ecc. L'adozione di appropriati metodi di analisi statistica per analizzare le caratteristiche di Chuanmutong può determinare il controllo complessivo della qualità e l'identificazione scientifica della medicina tradizionale cinese^17,18,19.

In questo studio sono stati raccolti 10 lotti di varietà autentiche Chuanmutong e cinque lotti di adulteranti. La loro qualità è stata confrontata e analizzata con il metodo delle impronte digitali HPLC combinato con il riconoscimento multi-pattern, tra cui l'analisi dei cluster (CA), l'analisi delle componenti principali (PCA), l'analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-CA) e la determinazione del contenuto della componente farmacodinamica. Questo protocollo stabilisce un metodo per identificare varietà autentiche con elevata specificità, una nuova strategia per l'identificazione scientifica di varietà autentiche e adulteranti di materiali medicinali cinesi.

Protocollo

1. Metodi per il rilevamento chimico delle impronte digitali

1. Condizioni cromatografiche
   1. Preparare la fase mobile acetonitrile (A)/acqua (B). Impostare un programma di gradiente come segue nel software HPLC: 0-20 min, 3% A-10% A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
   2. Mantenere la portata della fase mobile a 1,0 ml/min.
   3. Effettuare la separazione cromatografica su una colonna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenuta a 30 °C.
   4. Impostare il volume di iniezione su 10 μL.
   5. Rilevare i campioni a una lunghezza d'onda di 205 nm.
      NOTA: Per le impostazioni specifiche delle condizioni cromatografiche, fare riferimento alle procedure operative del software funzionante di cromatografia liquida ad alte prestazioni (Tabella dei materiali).
2. Preparazione della soluzione campione
   1. Macinare le materie prime per uniformare la dimensione delle particelle facendole passare attraverso una rete di nylon con un diametro interno di 850 μm ± 29 μm.
   2. Introdurre 2 g di materia prima macinata (accuratamente pesata) in un matraccio conico da 50 mL con tappo e aggiungere 50 mL di metanolo. Posizionare il tappo sul pallone e ultrasonicare (600 W, 40 kHz) per 30 minuti.
   3. Quindi, raffreddare il matraccio a temperatura ambiente (RT). Pesare nuovamente i campioni e compensare il peso iniziale sostituendo l'estrattore perso.
   4. Versare 4 mL della soluzione di metanolo contenente gli estratti medicinali in un matraccio tarato da 10 ml. Aggiungere 6 ml di H₂O, mescolare e lasciare riposare per 10 minuti.
   5. Infine, filtrare il surnatante attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm e metterlo in standby.
3. Convalida dei metodi di rilevamento delle impronte digitali
   1. Preparare il campione come descritto sopra (fase 1.2) e sottoporlo ad analisi HPLC (fase 1.1) sei volte al giorno. Per valutare la precisione, calcolare la deviazione standard relativa (RSD) del tempo di ritenzione relativo e delle aree relative di picco come descritto al punto 1.3.5.
   2. Valutare la stabilità della soluzione campione analizzando la stessa soluzione campione memorizzata in RT per 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 ore e calcolare l'RSD del tempo di ritenzione relativo e delle relative aree di picco come descritto nel passaggio 1.3.5.
   3. Prelevare sei repliche dello stesso campione (CMT-4), preparare la soluzione campione secondo la procedura precedente (fase 1.2) e rilevare la sua impronta digitale in HPLC dopo la fase 1.1. Calcolare l'RSD del tempo di ritenzione relativo e delle aree di picco relative e valutarne la ripetibilità come descritto nel passaggio 1.3.5.
   4. Quindi utilizzare il picco numero 10 nella Figura 1B come picco di riferimento e calcolare l'RSD del tempo di ritenzione relativo e dell'area relativa del picco di ciascun picco comune come descritto nel passaggio 1.3.5.
   5. Utilizzare le formule indicate di seguito per calcolare il tempo di ritenzione relativo e l'area relativa del picco di ciascun picco comune:
      T _re = _{Caratteristica} T/T_{riferimento
      Are = Unacaratteristica/Unriferimento}
      Dove T re = tempo di ritenzione relativo, T caratteristica = tempo di ritenzione del picco caratteristico, T riferimento = _{tempo di ritenzione} del picco di riferimento, A _re = area relativa del picco, A caratteristica = area _{caratteristica} del picco e A riferimento = area del picco di _riferimento.
      NOTA: L'istituzione delle impronte digitali della medicina tradizionale cinese richiede generalmente la selezione di un picco cromatografico facile da ottenere e ad alta risoluzione. Questo viene utilizzato come picco di riferimento per identificare le impronte digitali ed esaminarne la stabilità e la riproducibilità.

2. Istituzione dell'impronta digitale di Chuanmutong e analisi della somiglianza

1. Utilizzare 10 lotti di campioni autentici e cinque lotti di adulteranti come Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. finetii Rehd. et Wils (XS), e Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) come campioni per l'analisi delle impronte digitali.
2. Preparare le soluzioni di esempio come descritto al punto 1.2. Eseguire l'analisi delle impronte digitali di tutte le soluzioni campione mediante HPLC in base alle condizioni descritte al punto 1.1.
3. Importare i dati rilevanti nel sistema di valutazione della somiglianza delle impronte digitali cromatografiche della medicina tradizionale cinese (SESCF-TCM, versione 2012). Il sistema designerà i picchi con altezza ragionevole e buona risoluzione nei cromatogrammi di tutti i campioni come picchi comuni.
   NOTA: Il software SESCF-TCM può essere scaricato dopo la registrazione sul sito web della Commissione della farmacopea cinese (http://114.247.108.158:8888/login).
   1. Nel software, fare clic sul pulsante Imposta spettro di riferimento nel menu.
   2. Quindi, nella finestra Impostazioni parametri , impostare la larghezza della finestra temporale su 0,5 e selezionare Metodo di generazione dello spettro di controllo come metodo mediano.
   3. Fare clic su Calibrazione multipunto nel menu principale, quindi selezionare Peak Matching come Full Spectrum Peak Matching.
   4. Infine, fare clic su Genera controllo per generare l'impronta cromatografica di riferimento della specie autentica di Chuanmutong.
4. Importare il tempo di conservazione e l'area di picco di 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e cinque lotti di adulteranti in SESCF-TCM per l'analisi. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
   1. Nel software, fare clic sul pulsante Imposta spettro di riferimento nel menu principale.
   2. Nella finestra Impostazioni parametri , impostare l'impronta digitale cromatografica di riferimento delle specie autentiche di Chuanmutong come riferimento, selezionare il metodo di generazione dello spettro di controllo come metodo mediano e impostare la larghezza della finestra temporale su 0,5.
   3. Fare clic su Calibrazione multipunto nel menu principale, quindi selezionare Peak Matching come Full Spectrum Peak Matching.
   4. Infine, fai clic su Calcola somiglianza per calcolare la somiglianza in base alle impronte digitali del cromatogramma di riferimento di Chuanmutong. Infine, calcola la somiglianza delle impronte digitali utilizzando il sistema di valutazione delle impronte digitali cromatografiche della medicina cinese (versione 2012).
      NOTA: Per le operazioni specifiche, fare riferimento alle specifiche operative del Sistema di Valutazione delle Impronte Digitali Cromatografiche di Medicina Cinese (versione 2012).

3. Analisi di riconoscimento multi-pattern dell'impronta digitale Chuanmutong

1. Analisi dei cluster (CA)
   1. Utilizzare le aree di picco di 12 picchi comuni nelle impronte digitali di 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e dei loro cinque lotti di adulteranti come variabili e inserirli nel software di analisi statistica per l'analisi sistematica dei cluster (CA).
   2. Scegliere il metodo Between-Groups e utilizzare il coefficiente di correlazione di Pearson come base di classificazione per disegnare un diagramma di analisi dei cluster di Chuanmutong e dei suoi adulteranti. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
      1. Nel software di analisi statistica, fare clic su File per importare i dati.
      2. Fare clic su Analisi nel menu e quindi fare clic su Clustering di sistema in Classificazione.
      3. Selezionare l'area di picco comune come variabile e impostare il numero di cluster su quattro.
      4. Fare clic su Metodo (Method), selezionare il metodo di clustering come Inter-Group Connection (Connessione tra gruppi), selezionare l'intervallo di misurazione come Correlazione di Pearson e fare clic su OK per disegnare la mappa CA.
2. Analisi delle componenti principali (PCA)
   1. Importare l'area di picco comune relativa delle varietà autentiche e dei loro adulteranti nel software di analisi per l'analisi PCA e utilizzare la mappa del punteggio PCA per valutare la mappa della matrice di punteggio delle differenze campionarie. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
      1. Apri il software di analisi dei dati, fai clic su File nel menu e crea un nuovo progetto regolare. Importare l'area di picco di 12 picchi comuni in un foglio di calcolo (ad esempio, formato excel) dal sistema HPLC. Quindi fare clic su Fine per completare l'importazione dei dati.
      2. Fare clic su Nuovo per creare un nuovo modello per impostare il tipo di modello con PCA. Fare clic su Autofit e Aggiungi per adattare i dati, quindi fare clic su Punteggi per ottenere la mappa del punteggio PCA.
3. Analisi di discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA)
   1. Utilizzare il metodo di analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali con modalità di supervisione per analizzare ulteriormente i picchi relativi dell'area di picco comune delle autentiche varietà Chuanmutong e adulteranti e disegnare una mappa del punteggio di classificazione OPLS-DA di tutti i campioni. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
      1. Nel software di analisi dei dati, fare clic su File nel menu per importare un file e creare un nuovo progetto regolare. Importare l'area di picco di 12 picchi comuni in un foglio di calcolo dal sistema HPLC, quindi fare clic su Fine per completare l'importazione dei dati.
      2. Fare clic su Nuovo per creare un nuovo modello per impostare il tipo di modello con PCA. Fare clic su Autofit e Aggiungi per adattare i dati. Quindi fare clic su Punteggi per ottenere la mappa del punteggio PCA.
      3. Fare clic su Nuovo e scegliere Nuovo come modello Uno per impostare il tipo di modello con OPLS-DA.
      4. Fare clic su Scala e impostare il tipo con Par for All. Fare clic prima su Autofit e quindi su Punteggi per ottenere la mappa dei punteggi OPLS-DA.
   2. Al fine di determinare l'influenza di ciascun picco comune in Chuanmutong sui risultati della classificazione e la differenza tra materiali Chuanmutong autentici e relativi adulteranti, utilizzare l'importanza variabile nella proiezione (VIP) per l'analisi.
   3. Disegna la mappa VIP dei diversi componenti di Chuanmutong. Utilizza la mappa VIP risultante per valutare l'impatto di ciascuna variabile sulla classificazione e per escludere i componenti che contribuiscono in modo significativo alle differenze tra i gruppi. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
      1. Nel software di analisi dei dati, fare clic su Analizza nel menu e fare clic su Permutazioni, impostare il numero di permutazioni su 200 e ottenere R 2 e Q² della mappa del punteggio OPLS-DA.
      2. Clicca su VIP e scegli VIP Predictive per ottenere la mappa VIP.

4. Determinazione del β-sitosterolo in Chuanmutong mediante HPLC

1. Condizioni cromatografiche (fare riferimento al punto 1.1)
   1. Preparare la fase mobile: metanolo-acqua (97:3).
   2. Impostare la portata della fase mobile su 1,0 ml/min.
   3. Effettuare la separazione cromatografica su una colonna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenuta a 30 °C.
   4. Impostare il volume di iniezione su 10 μL.
   5. Rilevare il componente a una lunghezza d'onda di 204 nm.
2. Preparazione della soluzione campione
   1. Preparare la soluzione madre standard di β-sitosterolo (0,1 mg/ml) sciogliendo una quantità accuratamente pesata del corrispondente standard di riferimento in metanolo.
   2. Macinare il campione di analisi della materia prima per uniformare la dimensione delle particelle facendo passare il campione attraverso la rete di nylon con un diametro interno di 180 μm ± 7,6 μm.
   3. Introdurre 2 g di materia prima macinata (accuratamente pesata) in un matraccio a fondo rotondo e aggiungervi 50 ml di cloroformio.
   4. Collegare il pallone a un condensatore a riflusso e riscaldarlo a bagnomaria bollente (ebollizione moderata) per 60 minuti. Filtrare la soluzione di estrazione con carta da filtro da 15-20 μm.
   5. Evaporare il filtrato fino quasi all'asciutto a bagnomaria bollente (ebollizione moderata) per circa 10 minuti.
   6. Sciogliere il residuo e portare il volume a 5 ml usando metanolo. Infine, far passare il surnatante attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm e metterlo in standby.
3. Convalida del metodo
   1. Prendere la soluzione madre di β-sitosterolo preparata nella sottofase 4.2.1, diluirla con metanolo al 100% e preparare le soluzioni con concentrazioni di 100 μg/mL, 80 μg/mL, 60 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30 μg/mL e 20 μg/mL.
   2. Iniettare i campioni nelle condizioni cromatografiche descritte al punto 4.1 per determinare l'area del picco, eseguire l'analisi di regressione con l'area del picco al volume di iniezione e ottenere l'equazione di regressione e il coefficiente di correlazione per valutarne la linearità.
   3. Preparare i campioni come descritto sopra (fase 4.2) e sottoporli all'analisi HPLC (fase 4.1) sei volte nello stesso giorno. Quindi calcolare l'RSD delle aree di picco per valutare la precisione.
   4. Valutare la stabilità della soluzione campione analizzando le stesse soluzioni campione memorizzate in RT per 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 ore, come descritto al punto 4.1. Quindi calcolare l'RSD delle aree di picco come descritto nel passaggio 1.3.5.
   5. Esaminare la ripetibilità sciogliendo lo stesso campione (CMT-4) in sessuplicato, preparato come descritto al punto 4.2, e sottoponendolo all'analisi HPLC come descritto nella fase 4.1. Quindi calcolare l'RSD del contenuto di β-sitosterolo in sei campioni.
   6. Valutare l'accuratezza del metodo utilizzando il metodo di aggiunta standard. Per questo, aggiungere soluzioni di riferimento di β-sitosterolo ai campioni all'80%, 100% e 120% del contenuto di β-sitosterolo e ripetere ogni condizione tre volte come descritto al punto 4.1. Valutare l'accuratezza del metodo calcolando il recupero medio e l'RSD.
      NOTA: la formula di calcolo del tasso di recupero (RR) è la seguente:
      RR % = [(M _t - M ₀) / M_s] × 100
      Dove M _t = la qualità del β-sitosterolo dopo aver aggiunto lo standard, M ₀ = la qualità della soluzione del campione e M_s = la qualità del β-sitosterolo aggiunto.
4. Determinazione del contenuto di β-sitosterolo dei campioni
   1. Prendere 10 lotti di autentici materiali medicinali cinesi e cinque lotti di adulteranti correlati per preparare soluzioni campione secondo il passaggio 4.2.
   2. Quindi iniettare ciascuna soluzione campione e soluzione di riferimento di β-sitosterolo per determinare l'area del picco nelle condizioni descritte al punto 4.1 e calcolare il contenuto di β-sitosterolo di ciascun campione utilizzando il metodo standard esterno a un punto.

Risultati

Impronta digitale cromatografica di Chuanmutong e analisi di similarità (SA)
I valori RSD del tempo di ritenzione relativo di precisione, ripetibilità e stabilità erano inferiori rispettivamente allo 0,46%, 1,65% e 0,53%; i valori RSD dell'area di picco relativa erano inferiori rispettivamente al 4,23%, 3,56% e 3,96%. Come mostrato nelle figure 1A,B, c'erano 12 distinti picchi comuni (dal picco 1 al picco 12) nelle impronte digitali HPLC nei 10 campioni autentici di Ch...

Discussione

La raccolta di campioni per la ricerca è il primo passo chiave per costruire il riconoscimento multi-pattern nell'identificazione dell'autenticità dei materiali medicinali cinesi. Attraverso ricerche di mercato, abbiamo scoperto che Sichuan Ya'an, Liangshan e Leshan sono le principali aree di produzione delle risorse selvatiche di Chuanmutong. Anche le varietà affini dello stesso genere hanno la stessa distribuzione geografica ^6,20; CC, DC, DE, XS e SMT sono s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2017381038
Acetonitrile	Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China	WXBD5243V
β-Sitosterol	Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China	20210201
C18 column	Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Welch Ultimate LP
Chuanmutong	Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China	19020103	CMT-1
Chuanmutong	Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200701	CMT-2
Chuanmutong	Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200701	CMT-3
Chuanmutong	Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200901	CMT-4
Chuanmutong	Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	210701	CMT-5
Chuanmutong	Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	210401	CMT-6
Chuanmutong	Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	200901	CMT-7
Chuanmutong	Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China	201201	CMT-8
Chuanmutong	Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China	201001	CMT-9
Chuanmutong	Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China	210501	CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang	Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China	-	CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.	Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China	-	DC
Clematis peterae Hand.-Mazz.	Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China	-	DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils	Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China	-	XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot.	Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China	-	SMT
Electronic balance	Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China	FA1204
Ergosterol	Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China	20210201
Ethanol	Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China	2021112602
Ethyl acetate	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2017042043
Formic acid	Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China	2016062901
High performance liquid chromatography	Agilent, USA.	1260
IBM SPSS Statistics version 26.0	International Business Machines Corporation, USA	-
Methanol	Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China	WXBD6409V
Methanol	Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China	202010302
n-butyl alcohol	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2020071047
Petroleum ether	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	2020090125
Phosphoric acid	Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China	20200110
SESCF-TCM version 2012	National Pharmacopoeia Commission, China	-	http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol	Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China	20210201
Trichloromethane	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047	Umetrics, Sweden	-	https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine	Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China	UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner	Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China	KH3200E