Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

Resumen

El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.

Resumen

La inmunofluorescencia es una de las técnicas más utilizadas para visualizar antígenos diana con alta sensibilidad y especificidad, lo que permite la identificación y localización precisa de proteínas, glicanos y moléculas pequeñas. Si bien esta técnica está bien establecida en el cultivo celular bidimensional (2D), se sabe menos sobre su uso en modelos celulares tridimensionales (3D). Los organoides del cáncer de ovario son modelos tumorales 3D que recapitulan la heterogeneidad clonal de las células tumorales, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Por lo tanto, son superiores a las líneas celulares para la evaluación de la sensibilidad a los medicamentos y los biomarcadores funcionales. Por lo tanto, la capacidad de utilizar la inmunofluorescencia en organoides primarios de cáncer de ovario es extremadamente beneficiosa para comprender la biología de este cáncer. El estudio actual describe la técnica de inmunofluorescencia para detectar proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario (DOP) serosos de alto grado derivados de pacientes. Después de exponer los PDO a la radiación ionizante, la inmunofluorescencia se realiza en organoides intactos para evaluar las proteínas nucleares como focos. Las imágenes se recopilan utilizando imágenes z-stack en microscopía confocal y se analizan utilizando un software automatizado de conteo de focos. Los métodos descritos permiten el análisis del reclutamiento temporal y especial de proteínas de reparación del daño del ADN y la colocalización de estas proteínas con marcadores del ciclo celular.

Introducción

El cáncer de ovario es la principal causa de muerte por neoplasia maligna ginecológica. La mayoría de los pacientes son tratados con fármacos que dañan el ADN, como el carboplatino, y aquellos con tumores deficientes en reparación por recombinación homóloga (HRR) pueden recibir inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) ^1,2. Sin embargo, la mayoría de los pacientes desarrollan resistencia a estas terapias y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico. La desregulación de la respuesta al daño del ADN (DDR) se ha asociado con el desarrollo de cáncer de ovario y resistencia tanto a la quimio....

Protocolo

El tejido tumoral y la ascitis se obtuvieron después de obtener el consentimiento del paciente como parte de un biorepositorio de oncología ginecológica que fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Washington en St. Louis. Las pacientes se incluyeron si tenían cáncer de ovario seroso de grado alto (HGSOC) en estadio avanzado. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente en el banco a menos que se especifique lo contrario. Todos los reactivos se prepararon a temperatura ambiente (a menos que se indique lo contrario) y se almacenaron a 4 °C.

1. Generación de organoides

....

Resultados

El protocolo presentado puede teñir, visualizar y cuantificar con éxito las proteínas de reparación del daño del ADN nuclear en organoides. Esta técnica se utilizó para teñir y evaluar las DOP antes y después de la irradiación. Los PDO se expusieron a 10 Gy de radiación y se evaluaron los siguientes biomarcadores: ɣ-H2AX (Figura 1), un marcador de daño en el ADN; RAD51 (Figura 2), un marcador para HRR; 53BP1, un marcador de NHEJ; RPA, un marcador de.......

Discusión

La respuesta al daño del ADN juega un papel integral tanto en el desarrollo del cáncer de ovario como en la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, es imperativo una comprensión profunda de los mecanismos de reparación del ADN. Aquí, se presenta una metodología para estudiar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides 3D intactos. Se desarrolla un protocolo reproducible y confiable que utiliza anticuerpos distintivos para evaluar el daño del ADN, la recombinación homóloga, la unión final.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)	Sigma	14-040-133
1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)	Fisher Scientific	ICN1860454
Ant-53BP1 Antibody	BD Biosciences	612522	diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-Geminin Antibody	Abcam	ab104306	diluted to 1:200 in staining buffer
Anti-Geminin Antibody	ProteinTech	10802-1-AP	diluted to 1:400 in staining buffer
Anti-RAD51 Antibody	Abcam	ab133534	diluted to 1:1000 in staining buffer
Anti-yH2AX Antibody	Millipore-Sigma	05-636	diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody	Bethyl Laboratories	A300-245A-M	diluted to 1:200 in staining buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605 100
Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000	Leica	389584
Conical Tubes, 15 mL	Corning	14-959-53A
Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)	Thermo Scientific	AMQAF2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228
Cover Slip	LA Colors		Any clear nail polish will suffice
Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2	R&D Systems	3533-010-02	Could probably use Matrigel or other BME Matrix
DAPI	Thermo Scientific	R37606	NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS
Glycine	Fisher Scientific	NC0756056
JCountPro	JCountPro		For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	07-000-243
Nail Polish	StatLab	SL102450
Parafomraldehyde (PFA), 2%	Electron Microscopy Sciences	157-4	Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA
Permeabilization Buffer	Made in Lab		0.2% X-100 Triton in PBS++
Pipette	Rainin	17014382
Pipette Tips	Rainin	17014967
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36930
Staining Buffer	Made in Lab		0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System	Thermo Scientific	12-565-8
Triton X-100	Sigma-Alderich	11332481001
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Scientific	15250061
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	animal origin-free, recombinant enzyme
X-RAD 320 Biological Irradiator	Precision X-Ray Irradiation	X-RAD320