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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.

Resumen

La inmunofluorescencia es una de las técnicas más utilizadas para visualizar antígenos diana con alta sensibilidad y especificidad, lo que permite la identificación y localización precisa de proteínas, glicanos y moléculas pequeñas. Si bien esta técnica está bien establecida en el cultivo celular bidimensional (2D), se sabe menos sobre su uso en modelos celulares tridimensionales (3D). Los organoides del cáncer de ovario son modelos tumorales 3D que recapitulan la heterogeneidad clonal de las células tumorales, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Por lo tanto, son superiores a las líneas celulares para la evaluación de la sensibilidad a los medicamentos y los biomarcadores funcionales. Por lo tanto, la capacidad de utilizar la inmunofluorescencia en organoides primarios de cáncer de ovario es extremadamente beneficiosa para comprender la biología de este cáncer. El estudio actual describe la técnica de inmunofluorescencia para detectar proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario (DOP) serosos de alto grado derivados de pacientes. Después de exponer los PDO a la radiación ionizante, la inmunofluorescencia se realiza en organoides intactos para evaluar las proteínas nucleares como focos. Las imágenes se recopilan utilizando imágenes z-stack en microscopía confocal y se analizan utilizando un software automatizado de conteo de focos. Los métodos descritos permiten el análisis del reclutamiento temporal y especial de proteínas de reparación del daño del ADN y la colocalización de estas proteínas con marcadores del ciclo celular.

Introducción

El cáncer de ovario es la principal causa de muerte por neoplasia maligna ginecológica. La mayoría de los pacientes son tratados con fármacos que dañan el ADN, como el carboplatino, y aquellos con tumores deficientes en reparación por recombinación homóloga (HRR) pueden recibir inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) 1,2. Sin embargo, la mayoría de los pacientes desarrollan resistencia a estas terapias y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico. La desregulación de la respuesta al daño del ADN (DDR) se ha asociado con el desarrollo de cáncer de ovario y resistencia tanto a la quimioterapia como a los inhibidores de PARP3. Por lo tanto, el estudio de la DDR es imprescindible para comprender la fisiopatología del cáncer de ovario, los posibles biomarcadores y las nuevas terapias dirigidas.

Los métodos actuales para evaluar la DDR utilizan inmunofluorescencia (IF), ya que esto permite la identificación y localización precisas de proteínas de daño al ADN y análogos de nucleótidos. Una vez que hay una ruptura de doble cadena (DSB) en el ADN, la proteína histona H2AX se fosforila rápidamente, formando un foco donde las proteínas de reparación del daño del ADN se congregan4. Esta fosforilación se puede identificar fácilmente utilizando IF; de hecho, el ensayo ɣ-H2AX se ha empleado comúnmente para confirmar la inducción de un DSB 5,6,7,8,9. El aumento del daño en el ADN se ha asociado con la sensibilidad al platino y la eficacia de los agentes dañinos del ADN 10,11,12, y ɣ-H2AX se ha propuesto como un biomarcador asociado con la respuesta a la quimioterapia en otros tratamientos contra el cáncer 13. Tras un DSB, una célula competente en HRR realiza una serie de eventos que conducen a BRCA1 y BRCA2 a reclutar RAD51 para reemplazar la proteína de replicación A (RPA) y unirse al ADN. HRR repair utiliza una plantilla de ADN para reparar fielmente el DSB. Sin embargo, cuando los tumores son deficientes en HRR, dependen de vías de reparación alternativas, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Se sabe que NHEJ es propenso a errores y crea una alta carga mutacional en la célula, que utiliza 53BP1 como regulador positivo14. Todas estas proteínas de daño en el ADN se pueden identificar con precisión como focos utilizando IF. Además de la tinción de proteínas, el AI se puede usar para estudiar la protección de la horquilla y la formación de brechas de ADN monocatenario. La capacidad de tener horquillas estables se ha correlacionado con la respuesta al platino, y recientemente, los ensayos de brecha han demostrado el potencial para predecir la respuesta a los inhibidores de PARP 6,15,16,17. Por lo tanto, la tinción de los análogos de nucleótidos después de la introducción en el genoma es otra forma de estudiar la DDR.

Hasta la fecha, la evaluación de la DDR en el cáncer de ovario se ha limitado en gran medida a líneas celulares 2D homogéneas que no recapitulan la heterogeneidad clonal, el microambiente o la arquitectura de los tumores in vivo 18,19. Investigaciones recientes sugieren que los organoides son superiores a las líneas celulares 2D en el estudio de procesos biológicos complejos como los mecanismos DDR6. La presente metodología evalúa RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA y geminina en DOP. Estos métodos evalúan el organoide intacto y permiten el estudio de los mecanismos DDR en un entorno más similar al microambiente tumoral in vivo. Junto con la microscopía confocal y el conteo automatizado de focos, esta metodología puede ayudar a comprender la vía DDR en el cáncer de ovario y personalizar los planes de tratamiento para las pacientes.

Protocolo

El tejido tumoral y la ascitis se obtuvieron después de obtener el consentimiento del paciente como parte de un biorepositorio de oncología ginecológica que fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Washington en St. Louis. Las pacientes se incluyeron si tenían cáncer de ovario seroso de grado alto (HGSOC) en estadio avanzado. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente en el banco a menos que se especifique lo contrario. Todos los reactivos se prepararon a temperatura ambiente (a menos que se indique lo contrario) y se almacenaron a 4 °C.

1. Generación de organoides

  1. Generar los organoides siguiendo el informe publicado anteriormente20.

2. Recubrimiento e irradiación de organoides

  1. Usando organoides en cultivo, desaloje las pestañas de los organoides del plato de cultivo mediante la manipulación manual de la punta de una pipeta. Recoger los organoides en un tubo cónico de 15 ml.
  2. Centrifugar el tubo cónico a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Con una pipeta, aspire el sobrenadante con cuidado.
  3. Agregue 1,000 μL de una enzima recombinante libre de origen animal al pellet (ver Tabla de materiales). Mezclar la solución e incubar durante 15 min a 37 °C.
  4. Centrifugar la solución a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Con una pipeta, aspire cuidadosamente el sobrenadante.
  5. Después de la centrifugación y aspiración, resuspender el pellet en 1.000 μL de solución salina tamponada con fosfato.
  6. Transfiera 10 μL de la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y mezcle con 10 μL de azul de tripano.
  7. Tome 10 μL de la solución de células azules de tripano en un portaobjetos de la cámara de conteo de células e insértelo en la máquina de conteo de células (consulte la Tabla de materiales).
  8. Coloque 40,000 células por 20 μL de extracto de membrana basal (BME) en un portaobjetos de cámara de vidrio de 8 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Esto mantiene los organoides durante 3-5 días para permitir que las células formen organoides y crezcan a un tamaño adecuado.
  9. Para inducir roturas de ADN de doble cadena, irradie los organoides plateados con 10 Gray (Gy) de ɣ-irradiación (ver Tabla de materiales para detalles del irradiador).
    NOTA: Esto podría tardar hasta 5-10 minutos.
  10. Incubar los organoides en sus medios de cultivo en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2 durante 4 h.

3. Tinción por inmunofluorescencia

NOTA: Los volúmenes se refieren a la cantidad por pocillo del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos (~300 μL).

  1. Después de la irradiación e incubación de los organoides, aspire el medio con una pipeta, con cuidado para no interrumpir la matriz 3D. Lavar con 300 μL de PBS.
  2. Fijar los organoides en 300 μL de paraformaldehído al 2% (PFA) durante 10 min.
    NOTAS: No dejar por mucho tiempo, ya que el BME se despolimerizará y podría aspirarse.
  3. Lave los organoides con 300 μL de tampón de tinción (ver Tabla de materiales). Colocar en una coctelera durante 5 min.
  4. Para la permeabilización, agregue suavemente 300 μL de tampón de permeabilización (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 20 min. Lavar con 300 μL de tampón de tinción. Colocar en una coctelera durante 5 min.
  5. Agregue 300 μL de tampón de tinción para bloquear la etapa de permeabilización. Colocar en una coctelera durante 30 min. Aspirar el tampón de tinción con una pipeta.
  6. Añadir 300 μL de anticuerpos primarios (conejo anti-RAD51, ratón anti-Geminina, conejo anti-RPA, ratón anti-ɣH2AX, conejo anti-Geminin, ratón anti-53BP1; ver Tabla de materiales) diluido en tampón de tinción. Incubar a 4 °C durante 16 h.
    NOTA: Evite la tinción conjunta con el mismo animal huésped. Deje la tapa cerrada para evitar que los anticuerpos se mezclen en los pocillos vecinos.
  7. Retire la solución primaria de anticuerpos. Realice tres lavados con 300 μL de tampón de tinción durante 5 min cada uno en el agitador.
  8. Añadir 300 μL de solución de anticuerpo secundario (cabra anti-ratón Alexa fluor 488 y cabra anti-conejo Alexa fluor 647; ver Tabla de materiales) diluida en tampón de tinción e incubar durante 1 h en la oscuridad.
    NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en la oscuridad.
  9. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios. Añadir 300 μL de DAPI diluido. Colocar en una coctelera durante 5 min.
  10. Realice tres lavados con 300 μL de tampón de tinción durante 5 min cada uno en el agitador. Retire el tampón de tinción y separe las cámaras utilizando el kit de extracción incluido con los portaobjetos de la cámara (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Asegúrese de no empujar demasiado hacia adelante para interrumpir la matriz 3D.
  11. Usando una punta de pipeta p200 con la punta cortada, agregue un medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) para cubrir cada pocillo con una lengüeta organoide (por ejemplo, 20-30 μL para cada pestaña organoide).
  12. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra, evitando burbujas.
  13. Tome esmalte de uñas transparente y píntelo en los lados del vidrio de la cubierta para sellar el portaobjetos. Dejar endurecer durante 1 h y colocar a -20 °C.
    NOTA: Después de la toma de imágenes, el portaobjetos se puede almacenar durante al menos 6 meses con una pérdida mínima de fluorescencia.

4. Imágenes

  1. Adquiera imágenes usando un microscopio confocal (ver Tabla de materiales) a un objetivo de 63x con aceite de inmersión.
    NOTA: Si se obtienen imágenes de proteínas nucleares, 63x es ventajoso, pero 40x también es aceptable.
  2. Use DAPI para localizar los organoides a través del ocular. Seleccione los filtros apropiados para microscopía en función de los fluoróforos utilizados. Establezca los parámetros para capturar las imágenes z-stack.
    NOTA: Los fluoróforos utilizados en el estudio fueron DAPI, 488 y 647. Los láseres 405, 488 y 638 se encendieron para visualizar la tinción.
    NOTA: La pila z recomendada depende del poder de resolución del objetivo.
  3. Ajuste la imagen en vivo: ajuste el enfoque, la intensidad del láser, etc.
    NOTA: Cuanto mayor sea la intensidad del láser, más probable es que la muestra se fotoblanquee. Por lo tanto, seleccione una intensidad láser óptima.
  4. Adquiera el z-stack.
    NOTA: Esto podría tardar hasta 5-10 minutos.
  5. De las imágenes recopiladas en la pila z, captura al menos tres imágenes por pila.
    NOTA: Asegúrese de obtener capturas de pantalla en toda la pila para no duplicar los núcleos al cuantificar.
  6. Guarde cada archivo como TIFF y proceda al análisis (paso 5).

5. Análisis

NOTA: Utilice JCountPro para todos los análisis de imágenes después del informe publicado anteriormente21. Para obtener este software, consulte la publicación asociada.

  1. En el panel de análisis de objetos (parte superior del programa) en la pestaña de selección de archivos (parte inferior del programa), seleccione los archivos TIFF .
  2. Haga clic en Agregar para mover los archivos seleccionados al grupo de archivos seleccionados. Seleccione Pantalla.
  3. En la pestaña de segmentación, seleccione azul como color de los núcleos. Seleccione Segmentación automática para optimizar el umbral de los núcleos.
    NOTA: Si la segmentación automática no identifica con precisión los objetos, el usuario puede ajustar el ajuste fino y el ajuste sin procesar a la imagen o ver el manual del usuario para optimizar aún más la segmentación.
  4. En el panel de objetos, seleccione Dividir automáticamente objetos grandes y optimizar el tamaño de los núcleos.
    NOTA: Los núcleos suelen tener un tamaño incondicional de 5.000 píxeles, mientras que el tamaño condicional es de 1.500 píxeles. Consulte el manual del usuario para optimizar aún más el tamaño de los objetos.
  5. Seleccione Identificar objetos para probar los parámetros.
    NOTA: Si estos parámetros no son precisos, el tamaño y la afinación se pueden ajustar junto con otros ajustes. Consulte el manual del usuario para obtener instrucciones sobre una mayor optimización.
  6. Después de ajustar los parámetros a la imagen, seleccione Identificar objetos en todas las imágenes para identificar los núcleos en todas las imágenes seleccionadas.
  7. Seleccione el panel Análisis de focos (parte superior del programa).
  8. En la pestaña seleccionar archivos (parte inferior del programa), seleccione los archivos TIFF que se utilizaron para el análisis de objetos y seleccione los botones de flecha (>>) para mover las imágenes al grupo de archivos de imagen.
  9. En el grupo de directorios situado debajo de los archivos de imagen que se movieron, haga doble clic en la carpeta Edición manual y seleccione mover los archivos ioc al grupo de archivos de colección de objetos.
    NOTA: Todos los TIFF seleccionados deben tener archivos ioc coincidentes.
  10. Pulse Seleccionar para mover los archivos al grupo de archivos seleccionados. Seleccione la pestaña Conteo de focos en la parte inferior del programa.
  11. Optimice los parámetros siguiendo los pasos a continuación.
    1. Índice de configuración del sombrero de copa: 12.
    2. Canal de enfoque: Seleccione el color de los focos (verde: ɣ-H2AX; rojo: RAD51).
    3. Ajustes de cúpula H: altura de la cúpula %: 30; % umbral: 28 y 28.
    4. Ajuste de forma/tamaño: Tamaño mínimo de enfoque, píxeles: 5. Seleccione Aplicar forma/tamaño. Tamaño máximo de enfoque (condicional): 32. Redondez mínima, x100: 96. Enfoque máximo, píxeles: 60.
    5. Filtro de ruido: tamaño 1.
      NOTA: Si se determina si un núcleo es positivo para la tinción de geminina, en el segundo canal seleccione verde y bajo análisis seleccione intensidad.
  12. Para probar los parámetros establecidos, seleccione los siguientes botones en orden: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    NOTA: Si estos parámetros no funcionan, el tamaño y la afinación se pueden ajustar junto con otros ajustes. Consulte el manual del usuario para obtener más información sobre cómo se puede optimizar aún más la imagen.
  13. Una vez optimizados los parámetros para las imágenes seleccionadas, seleccione Recuento automático para contar los focos en cada imagen por núcleo. Si se desea el segundo canal, el programa determinará la intensidad que se puede utilizar.

Resultados

El protocolo presentado puede teñir, visualizar y cuantificar con éxito las proteínas de reparación del daño del ADN nuclear en organoides. Esta técnica se utilizó para teñir y evaluar las DOP antes y después de la irradiación. Los PDO se expusieron a 10 Gy de radiación y se evaluaron los siguientes biomarcadores: ɣ-H2AX (Figura 1), un marcador de daño en el ADN; RAD51 (Figura 2), un marcador para HRR; 53BP1, un marcador de NHEJ; RPA, un marcador de...

Discusión

La respuesta al daño del ADN juega un papel integral tanto en el desarrollo del cáncer de ovario como en la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, es imperativo una comprensión profunda de los mecanismos de reparación del ADN. Aquí, se presenta una metodología para estudiar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides 3D intactos. Se desarrolla un protocolo reproducible y confiable que utiliza anticuerpos distintivos para evaluar el daño del ADN, la recombinación homóloga, la unión final...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estamos agradecidos por la orientación de Pavel Lobachevsky, PhD en el establecimiento de este protocolo. También nos gustaría reconocer a la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en el Departamento de Obstetricia y Ginecología de St. Louis y la División de Oncología Ginecológica, el Programa de Becarios del Decano de la Universidad de Washington, la Fundación del Grupo de Oncología Ginecológica y el Programa de Desarrollo de Científicos Reproductivos por su apoyo a este proyecto.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)Sigma14-040-133
1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)Fisher Scientific ICN1860454
Ant-53BP1 Antibody BD Biosciences612522diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-Geminin Antibody Abcamab104306diluted to 1:200 in staining buffer
Anti-Geminin Antibody ProteinTech10802-1-APdiluted to 1:400 in staining buffer
Anti-RAD51 Antibody Abcamab133534diluted to 1:1000 in staining buffer
Anti-yH2AX Antibody Millipore-Sigma05-636diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) AntibodyBethyl Laboratories A300-245A-Mdiluted to 1:200 in staining buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher Scientific BP1605 100
Centrifuge; Sorvall St 16R CentrifugeThermo Scientific 75004240
Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000Leica 389584
Conical Tubes, 15 mLCorning 14-959-53A
Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) Thermo Scientific AMQAF2000
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Scientific C10228
Cover SlipLA ColorsAny clear nail polish will suffice
Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 R&D Systems 3533-010-02Could probably use Matrigel or other BME Matrix 
DAPI Thermo Scientific  R37606NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS 
Glycine Fisher Scientific NC0756056
JCountProJCountProFor access to the software, Email: jcountpro@gmail.com 
Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 07-000-243
Nail Polish StatLabSL102450
Parafomraldehyde (PFA), 2% Electron Microscopy Sciences 157-4Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA
Permeabilization BufferMade in Lab0.2% X-100 Triton in PBS++ 
PipetteRainin17014382
Pipette Tips Rainin 17014967
ProLong Gold Antifade MountantThermo Scientific  P36930
Staining Buffer Made in Lab0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ 
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Thermo Scientific 12-565-8
Triton X-100Sigma-Alderich 11332481001
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Scientific 15250061
TrypLE ExpressInvitrogen12604013animal origin-free, recombinant enzyme
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-Ray Irradiation X-RAD320

Referencias

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