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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung von DNA-Schadensreparaturproteinen in von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Dazu gehören umfassende Plattierungs- und Färbemethoden sowie detaillierte, objektive Quantifizierungsverfahren.

Zusammenfassung

Die Immunfluoreszenz ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur Visualisierung von Zielantigenen mit hoher Sensitivität und Spezifität, die die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Proteinen, Glykanen und kleinen Molekülen ermöglicht. Während diese Technik in der zweidimensionalen (2D) Zellkultur gut etabliert ist, ist weniger über ihre Verwendung in dreidimensionalen (3D) Zellmodellen bekannt. Ovarialkarzinom-Organoide sind 3D-Tumormodelle, die die klonale Heterogenität von Tumorzellen, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen rekapitulieren. Damit sind sie Zelllinien bei der Bewertung von Wirkstoffsensitivität und funktionellen Biomarkern überlegen. Daher ist die Fähigkeit, Immunfluoreszenz an primären Ovarialkarzinom-Organoiden zu verwenden, äußerst vorteilhaft für das Verständnis der Biologie dieses Krebses. Die aktuelle Studie beschreibt die Technik der Immunfluoreszenz zum Nachweis von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in hochgradigen serösen, von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden (PDOs). Nachdem die PDOs ionisierender Strahlung ausgesetzt wurden, wird eine Immunfluoreszenz an intakten Organoiden durchgeführt, um Kernproteine als Herde zu bewerten. Die Bilder werden mit Hilfe der Z-Stack-Bildgebung auf konfokaler Mikroskopie gesammelt und mit einer automatisierten Herdzählsoftware analysiert. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Analyse der zeitlichen und speziellen Rekrutierung von DNA-Schadensreparaturproteinen und die Kolokalisation dieser Proteine mit Zellzyklusmarkern.

Einleitung

Eierstockkrebs ist die häufigste Todesursache aufgrund gynäkologischer Malignität. Die Mehrzahl der Patienten wird mit DNA-schädigenden Medikamenten wie Carboplatin behandelt, und Patienten mit Tumoren mit homologer Rekombinationsreparatur (HRR) können Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) -Inhibitoren 1,2 verabreicht werden. Die meisten Patienten entwickeln jedoch eine Resistenz gegen diese Therapien und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose. Eine Dysregulation der DNA-Schadensantwort (DDR) wurde mit der Entwicklung von Eierstockkrebs und sowohl Chemotherapie als auch PARP-Inhibitor-Resistenz in Verbindung gebracht3. Daher ist die Untersuchung der DDR unerlässlich, um die Pathophysiologie von Eierstockkrebs, potenzielle Biomarker und neuartige zielgerichtete Therapien zu verstehen.

Aktuelle Methoden zur Bewertung der DDR verwenden Immunfluoreszenz (IF), da dies die genaue Identifizierung und Lokalisierung von DNA-schädigenden Proteinen und Nukleotidanaloga ermöglicht. Sobald es einen Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA gibt, wird das Histonprotein H2AX schnell phosphoryliert und bildet einen Fokus, in dem sich DNA-Schadensreparaturproteine versammeln4. Diese Phosphorylierung kann leicht mit Hilfe von IF identifiziert werden; Tatsächlich wurde der ɣ-H2AX-Assay üblicherweise verwendet, um die Induktion eines DSB 5,6,7,8,9 zu bestätigen. Erhöhte DNA-Schäden wurden mit der Platinsensitivität und Wirksamkeit von DNA-schädigenden Stoffen in Verbindung gebracht 10,11,12, und ɣ-H2AX wurde als Biomarker vorgeschlagen, der mit dem Ansprechen auf eine Chemotherapie bei anderen Krebsbehandlungen assoziiert ist 13. Bei einem DSB führt eine Zelle, die HRR beherrscht, eine Reihe von Ereignissen durch, die dazu führen, dass BRCA1 und BRCA2 RAD51 rekrutieren, um das Replikationsprotein A (RPA) zu ersetzen und an die DNA zu binden. Bei der HRR-Reparatur wird eine DNA-Vorlage verwendet, um das DSB originalgetreu zu reparieren. Wenn Tumoren jedoch einen Mangel an HRR aufweisen, sind sie auf alternative Reparaturwege wie die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) angewiesen. Es ist bekannt, dass NHEJ fehleranfällig ist und eine hohe Mutationslast für die Zelle erzeugt, die 53BP1 als positiven Regulator verwendet14. Diese DNA-schädigenden Proteine können alle mit Hilfe von IF genau als Herde identifiziert werden. Zusätzlich zur Färbung von Proteinen kann IF verwendet werden, um den Gabelschutz und die Bildung einzelsträngiger DNA-Lücken zu untersuchen. Die Fähigkeit, stabile Gabeln zu haben, wurde mit dem Ansprechen von Platin korreliert, und in jüngster Zeit haben Gap-Assays das Potenzial gezeigt, das Ansprechen auf PARP-Inhibitoren 6,15,16,17 vorherzusagen. Daher ist die Färbung der Nukleotidanaloga nach der Einführung in das Genom eine weitere Möglichkeit, die DDR zu untersuchen.

Bisher war die Bewertung der DDR bei Ovarialkarzinomen weitgehend auf homogene 2D-Zelllinien beschränkt, die die klonale Heterogenität, Mikroumgebung oder Architektur von In-vivo-Tumoren nicht rekapitulieren18,19. Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Organoide 2D-Zelllinien bei der Untersuchung komplexer biologischer Prozesse wie DDR-Mechanismen überlegen sind6. Die vorliegende Methodik bewertet RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA und Geminin in PDOs. Diese Methoden beurteilen das intakte Organoid und ermöglichen die Untersuchung von DDR-Mechanismen in einer Umgebung, die der Mikroumgebung des In-vivo-Tumors ähnlicher ist. Zusammen mit der konfokalen Mikroskopie und der automatisierten Herdzählung kann diese Methodik dazu beitragen, den DDR-Signalweg bei Eierstockkrebs zu verstehen und Behandlungspläne für Patienten zu personalisieren.

Protokoll

Tumorgewebe und Aszites wurden nach Einholung der Zustimmung der Patientin im Rahmen eines gynäkologischen Onkologie-Biorepositorys gewonnen, das vom Institutional Review Board (IRB) der Washington University in St. Louis zugelassen wurde. Es wurden Patienten eingeschlossen, die einen hochgradigen serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) im fortgeschrittenen Stadium hatten. Alle Eingriffe wurden bei Raumtemperatur auf der Werkbank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Reagenzien wurden bei Raumtemperatur (sofern nicht anders angegeben) hergestellt und bei 4 °C gelagert.

1. Organoid-Erzeugung

  1. Generieren Sie die Organoide gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht20.

2. Beschichtung und Bestrahlung von Organoiden

  1. Verwenden Sie Organoide in Kultur, entfernen Sie die Laschen der Organoide aus der Kulturschale durch manuelle Manipulation einer Pipettenspitze. Sammeln Sie die Organoide in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
  2. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig ab.
  3. Fügen Sie dem Pellet 1.000 μl eines rekombinanten Enzyms tierischen Ursprungs hinzu (siehe Materialtabelle). Die Lösung wird gemischt und 15 min bei 37 °C inkubiert.
  4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig ab.
  5. Nach Zentrifugation und Aspiration resuspendieren Sie das Pellet in 1.000 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
  6. 10 μl der Lösung werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und mit 10 μl Trypanblau gemischt.
  7. 10 μl der Trypanblau-Zelllösung werden in einen Objektträger der Zellzählkammer gegeben und in die Zellzählmaschine eingeführt (siehe Materialtabelle).
  8. 40.000 Zellen pro 20 μl Basalmembranextrakt (BME) in einen 8-Well-Glaskammerobjektträger geben (siehe Materialtabelle). Dadurch bleiben die Organoide 3-5 Tage lang erhalten, damit die Zellen Organoide bilden und auf eine geeignete Größe wachsen können.
  9. Um Doppelstrang-DNA-Brüche zu induzieren, bestrahlen Sie die plattierten Organoide mit 10 Gray (Gy) ɣ-Bestrahlung (siehe Materialtabelle für Details zur Bestrahlung).
    HINWEIS: Dies kann bis zu 5-10 Minuten dauern.
  10. Inkubation der Organoide in ihren Nährmedien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 4 h.

3. Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS: Die Volumina beziehen sich auf die Menge pro Well des 8-Well-Kammerobjektträgers (~300 μl).

  1. Nach Bestrahlung und Inkubation der Organoide saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette ab, um die 3D-Matrix nicht zu stören. Mit 300 μl PBS waschen.
  2. Fixieren Sie die Organoide in 300 μl 2% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min.
    HINWEISE: Nicht zu lange stehen lassen, da der BME depolymerisiert und abgesaugt werden könnte.
  3. Waschen Sie die Organoide mit 300 μl Färbepuffer (siehe Materialtabelle). 5 Minuten auf einen Shaker geben.
  4. Für die Permeabilisierung vorsichtig 300 μl Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle) zugeben und 20 min inkubieren. Mit 300 μl Färbepuffer waschen. 5 Minuten auf einen Shaker geben.
  5. Fügen Sie 300 μl Färbepuffer hinzu, um den Permeabilisierungsschritt zu blockieren. 30 Minuten auf einen Shaker geben. Saugen Sie den Färbepuffer mit einer Pipette ab.
  6. 300 μl Primärantikörper (Kaninchen-Anti-RAD51, Maus-Anti-Geminin, Kaninchen-Anti-RPA, Maus-Anti-ƔH2AX, Kaninchen-Anti-Geminin, Maus-Anti-53BP1; siehe Materialtabelle) werden in Färbepuffer verdünnt. Bei 4 °C 16 h inkubieren.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Co-Färbung mit demselben Wirtstier. Lassen Sie den Deckel geschlossen, um zu vermeiden, dass sich die Antikörper in benachbarte Vertiefungen mischen.
  7. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung. Führen Sie drei Wäschen mit 300 μl Färbepuffer für jeweils 5 Minuten auf dem Shaker durch.
  8. 300 μl Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Maus-Alexa-Fluor 488 und Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 647; siehe Materialtabelle) in Färbepuffer verdünnte Lösung zugeben und 1 h im Dunkeln inkubieren.
    HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen im Dunkeln ausgeführt werden.
  9. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung. Fügen Sie 300 μl verdünntes DAPI hinzu. 5 Minuten auf einen Shaker geben.
  10. Führen Sie drei Wäschen mit 300 μl Färbepuffer für jeweils 5 Minuten auf dem Shaker durch. Entfernen Sie den Färbepuffer und lösen Sie die Kammern mit dem Entnahmeset, das den Objektträgern beiliegt (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie nicht zu weit nach vorne drücken, um die 3D-Matrix zu stören.
  11. Fügen Sie mit einer p200-Pipettenspitze mit abgeschnittener Spitze Einlagemedium hinzu (siehe Materialtabelle), um jede Vertiefung mit einer Organoidlasche abzudecken (z. B. 20-30 μl für jede Organoidlasche).
  12. Legen Sie ein Deckglas über die Probe, um Blasen zu vermeiden.
  13. Nehmen Sie durchsichtigen Nagellack und malen Sie ihn auf die Seiten des Deckglases, um den Objektträger zu versiegeln. 1 h aushärten lassen und bei -20 °C platzieren.
    HINWEIS: Nach der Bildgebung kann der Objektträger mindestens 6 Monate mit minimalem Fluoreszenzverlust gelagert werden.

4. Bildgebung

  1. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) bei 63-fachem Objektiv mit Immersionsöl auf.
    HINWEIS: Bei der Abbildung von Kernproteinen ist 63x vorteilhaft, aber 40x ist auch akzeptabel.
  2. Verwenden Sie DAPI, um die Organoide durch das Okular zu lokalisieren. Wählen Sie die geeigneten Filter für die Mikroskopie basierend auf den verwendeten Fluorophoren aus. Legen Sie die Parameter für die Erfassung der Z-Stack-Images fest.
    HINWEIS: Die in der Studie verwendeten Fluorophore waren DAPI, 488 und 647. Die Laser 405, 488 und 638 wurden eingeschaltet, um die Färbung zu visualisieren.
    HINWEIS: Der empfohlene Z-Stack hängt vom Auflösungsvermögen des Objektivs ab.
  3. Passen Sie das Livebild an: Stellen Sie Fokus, Laserintensität usw. ein.
    HINWEIS: Je höher die Laserintensität, desto wahrscheinlicher ist es, dass die Probe photobleichen wird. Wählen Sie daher eine optimale Laserintensität.
  4. Erwerben Sie den Z-Stack.
    HINWEIS: Dies kann bis zu 5-10 Minuten dauern.
  5. Machen Sie aus den im Z-Stapel gesammelten Bildern mindestens drei Bilder pro Stapel.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Screenshots im gesamten Stapel erhalten, um die Kerne bei der Quantifizierung nicht zu duplizieren.
  6. Speichern Sie jede Datei als TIFF und fahren Sie mit der Analyse fort (Schritt 5).

5. Würdigung

HINWEIS: Verwenden Sie JCountPro für alle Bildanalysen nach dem zuvor veröffentlichten Bericht21. Um diese Software zu erhalten, verweisen Sie auf die zugehörige Publikation.

  1. Wählen Sie im Bereich "Objektanalyse" (oben im Programm) auf der Registerkarte "Dateiauswahl" (unten im Programm) die TIFF-Dateien aus.
  2. Klicken Sie auf Hinzufügen , um die ausgewählten Dateien in die Gruppe der ausgewählten Dateien zu verschieben. Wählen Sie Anzeige aus.
  3. Wählen Sie auf der Registerkarte Segmentierung Blau als Farbe der Kerne aus. Wählen Sie Automatische Segmentierung , um den Schwellenwert der Kerne zu optimieren.
    HINWEIS: Wenn die automatische Segmentierung die Objekte nicht genau identifiziert, kann der Benutzer die Feinabstimmung und die Rohabstimmung an das Bild anpassen oder das Benutzerhandbuch einsehen, um die Segmentierung weiter zu optimieren.
  4. Wählen Sie im Objektbereich die Option Große Objekte automatisch aufteilen und die Größe der Kerne optimieren.
    Hinweis: Die Kerne haben in der Regel eine unbedingte Größe von 5.000 Pixeln, während die bedingte Größe 1.500 Pixel beträgt. Lesen Sie das Benutzerhandbuch, um die Größe der Objekte weiter zu optimieren.
  5. Wählen Sie Objekte identifizieren aus, um die Parameter zu testen.
    HINWEIS: Wenn diese Parameter nicht genau sind, können Größe und Abstimmung zusammen mit anderen Einstellungen angepasst werden. Im Benutzerhandbuch finden Sie Anweisungen zur weiteren Optimierung.
  6. Nachdem Sie die Parameter an das Bild angepasst haben, wählen Sie Objekte in allen Bildern identifizieren, um die Kerne in allen ausgewählten Bildern zu identifizieren .
  7. Wählen Sie das Bedienfeld "Fokusanalyse" (oben im Programm) aus.
  8. Wählen Sie auf der Registerkarte Dateien auswählen (unten im Programm) die TIFF-Dateien aus, die für die Objektanalyse verwendet wurden, und klicken Sie auf die Pfeilschaltflächen (>>), um die Bilder in die Gruppe Bilddateien zu verschieben.
  9. Doppelklicken Sie in der Verzeichnisgruppe unter den verschobenen Bilddateien auf den Ordner Manuelle Bearbeitung , und wählen Sie aus, ob die IOC-Dateien in die Gruppe Objektsammlungsdateien verschoben werden sollen.
    HINWEIS: Alle ausgewählten TIFFs müssen mit den IOC-Dateien übereinstimmen.
  10. Klicken Sie auf Auswählen , um die Dateien in die ausgewählte Dateigruppe zu verschieben. Wählen Sie die Registerkarte Foci-Zählung am unteren Rand des Programms.
  11. Optimieren Sie die Parameter, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Index der Zylindereinstellungen: 12.
    2. Fokuskanal: Wählen Sie die Farbe der Brennpunkte (grün: ɣ-H2AX; rot: RAD51).
    3. H-Kuppeleinstellungen: Kuppelhöhe %: 30; Schwellenwert %: 28 und 28.
    4. Form-/Größeneinstellung: Minimale Fokusgröße, Pixel: 5. Wählen Sie Form/Größe anwenden. Maximale Fokusgröße (bedingt): 32. Minimale Rundheit, x100: 96. Max. Fokus, Pixel: 60.
    5. Rauschfilter: Größe 1.
      HINWEIS: Wenn Sie feststellen, ob ein Kern positiv für die Gemininfärbung ist, wählen Sie unter dem zweiten Kanal Grün und unter Analyse die Intensität aus.
  12. Um die eingestellten Parameter zu testen, wählen Sie die folgenden Schaltflächen in der angegebenen Reihenfolge aus: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    HINWEIS: Wenn diese Parameter nicht funktionieren, können Größe und Abstimmung zusammen mit anderen Einstellungen angepasst werden. Lesen Sie das Benutzerhandbuch, um mehr darüber zu erfahren, wie das Bild weiter optimiert werden kann.
  13. Sobald die Parameter für die ausgewählten Bilder optimiert sind, wählen Sie Automatische Zählung , um die Brennpunkte in jedem Bild pro Kern zu zählen. Wenn der zweite Kanal gewünscht wird, bestimmt das Programm die Intensität, die verwendet werden kann.

Ergebnisse

Das vorgestellte Protokoll kann erfolgreich Proteine zur Reparatur von DNA-Schäden in Organoiden färben, visualisieren und quantifizieren. Diese Technik wurde verwendet, um PDOs sowohl vor als auch nach der Bestrahlung zu färben und zu bewerten. PDOs wurden 10 Gy Strahlung ausgesetzt und auf die folgenden Biomarker untersucht: ɣ-H2AX (Abbildung 1), ein Marker für DNA-Schäden; RAD51 (Abbildung 2), ein Marker für HRR; 53BP1, ein Marker für NHEJ; RPA, ein M...

Diskussion

Die DNA-Schadensantwort spielt eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung von Eierstockkrebs als auch bei der Chemotherapieresistenz. Daher ist ein gründliches Verständnis der DNA-Reparaturmechanismen unerlässlich. Hier wird eine Methodik vorgestellt, um DNA-Schadensreparaturproteine in intakten 3D-Organoiden zu untersuchen. Es wird ein reproduzierbares, zuverlässiges Protokoll entwickelt, das charakteristische Antikörper verwendet, um DNA-Schäden, homologe Rekombination, nicht-homologe Endverbindungen und R...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die Anleitung von Pavel Lobachevsky, PhD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in St. Louis, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean's Scholar Program der Washington University, der Gynäkologischen Onkologie Group Foundation und dem Reproductive Scientist Development Program für ihre Unterstützung dieses Projekts bedanken.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)Sigma14-040-133
1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)Fisher Scientific ICN1860454
Ant-53BP1 Antibody BD Biosciences612522diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-Geminin Antibody Abcamab104306diluted to 1:200 in staining buffer
Anti-Geminin Antibody ProteinTech10802-1-APdiluted to 1:400 in staining buffer
Anti-RAD51 Antibody Abcamab133534diluted to 1:1000 in staining buffer
Anti-yH2AX Antibody Millipore-Sigma05-636diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) AntibodyBethyl Laboratories A300-245A-Mdiluted to 1:200 in staining buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher Scientific BP1605 100
Centrifuge; Sorvall St 16R CentrifugeThermo Scientific 75004240
Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000Leica 389584
Conical Tubes, 15 mLCorning 14-959-53A
Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) Thermo Scientific AMQAF2000
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Scientific C10228
Cover SlipLA ColorsAny clear nail polish will suffice
Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 R&D Systems 3533-010-02Could probably use Matrigel or other BME Matrix 
DAPI Thermo Scientific  R37606NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS 
Glycine Fisher Scientific NC0756056
JCountProJCountProFor access to the software, Email: jcountpro@gmail.com 
Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 07-000-243
Nail Polish StatLabSL102450
Parafomraldehyde (PFA), 2% Electron Microscopy Sciences 157-4Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA
Permeabilization BufferMade in Lab0.2% X-100 Triton in PBS++ 
PipetteRainin17014382
Pipette Tips Rainin 17014967
ProLong Gold Antifade MountantThermo Scientific  P36930
Staining Buffer Made in Lab0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ 
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Thermo Scientific 12-565-8
Triton X-100Sigma-Alderich 11332481001
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Scientific 15250061
TrypLE ExpressInvitrogen12604013animal origin-free, recombinant enzyme
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-Ray Irradiation X-RAD320

Referenzen

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