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Resumen

Aquí, describimos un protocolo general y un diseño que podría aplicarse para identificar trazas y componentes menores en las complejas formulaciones de productos naturales (matrices) en la medicina tibetana.

Resumen

Los medicamentos tibetanos son complejos y contienen numerosos compuestos desconocidos, lo que hace que la investigación en profundidad sobre sus estructuras moleculares sea crucial. La cromatografía líquida-espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por electrospray (LC-ESI-TOF-MS) se usa comúnmente para extraer medicina tibetana; Sin embargo, muchos compuestos desconocidos impredecibles permanecen después de usar la base de datos Spectrum. El presente artículo desarrolló un método universal para identificar componentes en la medicina tibetana utilizando espectrometría de masas de trampa iónica (IT-MS). El método incluye protocolos estandarizados y programados para la preparación de muestras, configuración de MS, preejecución de LC, establecimiento de métodos, adquisición de MS, operación de MS de múltiples etapas y análisis manual de datos. Se identificaron dos compuestos representativos en la medicina tibetana Abelmoschus manihot utilizando fragmentación en múltiples etapas, con un análisis detallado de las estructuras compuestas típicas. Además, el artículo discute aspectos como la selección del modo iónico, el ajuste de fase móvil, la optimización del rango de escaneo, el control de energía de colisión, el cambio de modo de colisión, los factores de fragmentación y las limitaciones del método. El método de análisis estandarizado desarrollado es universal y se puede aplicar a compuestos desconocidos en la medicina tibetana.

Introducción

El análisis cualitativo de los componentes traza en la medicina tradicional china (MTC) se ha convertido en un tema crucial en la investigación. Debido al alto número de compuestos en TCM, es difícil aislarlos para el análisis del espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN) o del difractómetro de rayos X (XRD), lo que hace que los métodos basados en espectrometría de masas (MS) que solo requieren volúmenes de muestra bajos sean cada vez más populares. Además, la cromatografía líquida (LC) junto con MS ha sido ampliamente utilizada en la investigación de MTC en los últimos años para mejorar la separación de muestras complejas y el análisis cualitativo de compuestos químicos1. Un método común es la cromatografía líquida-espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por electrospray (LC-ESI-TOF-MS), que es ampliamente utilizada en la investigación cualitativa sobre la medicina tibetana2. Con este método, los componentes complejos se enriquecen y separan en una columna LC, y la relación masa-carga (m / z) de los iones de aducción se observa utilizando un detector MS. La búsqueda en bases de datos MS EN TÁNDEM (MS/MS o MS2) es actualmente el enfoque más rápido para anotaciones compuestas confiables en el análisis de moléculas pequeñas utilizando tiempo de vuelo cuadrupolo (Q-TOF) MS y Orbitrap MS3. Sin embargo, la mala calidad de las bases de datos y la presencia de varios isómeros dificultan la identificación de compuestos desconocidos. Además, la información proporcionada por la base de datos MS/MS es limitada 4,5,6,7. Es importante investigar los compuestos químicos en cada MTC utilizando un protocolo general que pueda aplicarse ampliamente a otra MTC.

IT-MS captura una amplia gama de iones aplicando diferentes voltajes de radiofrecuencia (RF) a los electrodos de anillo8. IT-MS puede realizar exploraciones de MS de múltiples etapas de series temporales en diversos órdenes cronológicos, proporcionando fragmentación de MS de múltiples etapas (MS n) de ingredientes, donden es el número de etapas de iones del producto9. La IT-MS lineal se considera la mejor para la identificación de estructuras, ya que se puede utilizar para experimentos secuenciales deMS n 10. Los iones objetivo pueden aislarse y acumularse en el lineal IT-MS1. El MS n (n ≥ 3) en IT-MS proporciona más información de fragmentos que MS/MS en Q-TOF-MS. Dado que IT-MS no puede bloquear el ion objetivo y sus iones de fragmento, es una herramienta poderosa para la elucidación de la estructura de compuestos desconocidos, incluidos los isómeros1. La tecnología MSn ha sido ampliamente aplicada al análisis estructural de proteínas, péptidos y polisacáridos desconocidos11,12. El nivel de abundancia de iones fragmentados en MSn proporciona más información de fragmentos moleculares sobre compuestos específicos en muestras complejas que MS / MS en Q-TOF-MS. Por lo tanto, la aplicación de la tecnología MSn a la identificación estructural en TCM es esencial.

La medicina tibetana es un componente importante de la MTC13, y estos medicamentos se derivan principalmente de animales, plantas y minerales que se encuentran en el área de la meseta14. La medicina tibetana Abelmoschus manihot seeds (AMS) es la semilla de Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS es una medicina herbal tradicional utilizada para tratar afecciones como la dermatitis atópica, el reumatismo y la lepra. Contiene chalcona, que posee efectos antibacterianos, antifúngicos, anticancerígenos, antioxidantes y antiinflamatorios15. En el presente estudio, se mejoraron los procedimientos deMS n y se desarrolló un método detallado para identificar estructuras compuestas en la medicina tibetana AMS utilizando IT-MS y MSn. Ciertos parámetros de MS, incluido el modo de iones, el rango de escaneo y el modo de colisión, se optimizaron para superar los problemas en la identificación de compuestos traza. Este estudio tiene como objetivo promover la identificación estandarizada de la estructura de compuestos traza en la MTC.

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Protocolo

1. Preparación de la muestra

  1. Pesar con precisión 1 g de la muestra de AMS y colocarla en un matraz cónico con 30 ml de metanol al 80%. Transfiera la mezcla a un sonicador de baño de ultrasonido durante 30 minutos de extracción a 25 °C. Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 5 min.
    NOTA: La frecuencia del sonicador de baño de ultrasonido es de 40 KHz.
  2. Prepare una jeringa para inyección y un filtro de membrana microporosa (0,22 μm, solo orgánico). Filtrar el sobrenadante en un frasco de muestra de 2 ml.

2. Configuración de MS

  1. Encienda el interruptor de la bomba de vacío. Abra la válvula principal del cilindro de argón y la válvula de presión parcial, y ajuste la presión a aproximadamente 0,3 MPa. Abra la válvula de nitrógeno.
    NOTA: Espere al menos 8 h para garantizar un grado de vacío suficiente para las condiciones experimentales. Compruebe que la presión del gas de argón y nitrógeno es lo suficientemente alta antes del análisis.
  2. Inicie el software de control MS. Haga clic en Fuente SEI calentada en el panel de software e introduzca los parámetros MS, incluida la temperatura del calentador (350 °C), el caudal de gas de la vaina (35 arb), el caudal de gas auxiliar (15 arb), el voltaje de pulverización (3,8 KV para el modo positivo, -2,5 KV para el modo negativo) y la temperatura capilar (275 °C). Haga clic en el botón Aplicar para activar la fuente de iones.

3. Preejecución de LC, establecimiento de métodos y adquisición de MS

  1. Preparar la fase móvil A y la fase móvil B utilizando solución acuosa de ácido fórmico al 0,1% y acetonitrilo puro, respectivamente. Desgasificarlos en un sonicador de baño de ultrasonido durante al menos 15 minutos. Conecte las soluciones a los pasajes de fluido A y B, respectivamente (Figura 1A). Prepare una solución de metanol y agua (1:9 v/v) y luego llénela a mano en las botellas de líquido de limpieza de la bomba y el inyector.
    NOTA: La frecuencia del sonicador de baño de ultrasonido es de 40 KHz.
  2. Inicie el software de control LC-MS.
    1. Haga clic en el botón Control directo para abrir el panel de control LC. Abra la válvula de purga en sentido contrario a las agujas del reloj en el módulo de la bomba (Figura 1B).
    2. Haga clic en el botón Más opciones para abrir la configuración de la bomba y establezca los parámetros de purga en 5 mLmin−1 durante 3 min. Haga clic en el botón Purgar para iniciar la eliminación de burbujas. Posteriormente, cierre la válvula de purga.
  3. Haga clic en los botones Prime Syringe, Wash Buffer Loop y Wash Needle Externally para enjuagar la jeringa durante tres ciclos, el bucle durante un ciclo y la aguja durante un ciclo, respectivamente. Coloque el frasco de muestra en el muestreador (Figura 1C).
  4. Haga clic en el botón Configuración del instrumento para abrir la ventana de edición de métodos. Haga clic en el botón Nuevo para crear un nuevo método de instrumento LC-MS.
  5. Establezca un tiempo de ejecución total para el método LC. A continuación, introduzca valores para establecer el límite de presión, el caudal total, el gradiente de flujo, la temperatura de la muestra, la temperatura de la columna y el delta de temperatura listo en la ventana de edición del método.
    NOTA: El caudal total por defecto de la fase móvil es constante a 0,3 mL/min con 50% A y 50% B y sin temperatura de columna en ausencia de una columna cromatográfica. Los valores predeterminados de temperatura de muestra y delta de temperatura lista son 15 °C y 0,1 °C, respectivamente. Otros ajustes dependen del tipo de columna de cromatografía líquida utilizada.
  6. Seleccione el tipo de experimento General MS o MS n para el método MS. Introduzca valores para configurar el tiempo de adquisición, la polaridad, el rango de masas, el número de valor de desvío y la duración del valor de desvío. Haga clic en el botón Guardar para configurar los ajustes como un método de instrumento.
    NOTA: La configuración predeterminada sin una columna de cromatografía es la siguiente: tiempo de adquisición, 2 min; polaridad, positiva o negativa; rango de masa, 100 a 1.200; número de valor de desvío, 2; y duración del valor de desvío, 1,99 min.

4. Funcionamiento de la espectrometría de masas de múltiples etapas

  1. Haga clic en el botón Configuración de secuencia para abrir la tabla de secuencias.
    1. En la tabla, introduzca la siguiente información: tipo de muestra, nombre de archivo, trayectoria, ID de muestra, método del instrumento, posición y volumen de inyección.
    2. Haga clic en el botón Guardar para grabar la tabla de secuencias, y luego haga clic en el botón Iniciar análisis para implementar la configuración e iniciar la adquisición de MS.
      NOTA: El tipo de ejemplo predeterminado se selecciona como desconocido. El método del instrumento es el método guardado en el paso 3.6. La botella de muestra se coloca en su ubicación única en la sala de muestras. Por ejemplo, RA1 es la primera ubicación en la primera fila del área roja en la sala de muestras. El volumen de inyección predeterminado suele ser de 2 μL, que depende de la concentración de la muestra.
  2. Haga doble clic en el archivo sin procesar en el explorador para cargar los datos de MS en el software de procesamiento de datos. En el cromatograma de pico base (BPI), seleccione el área con el área máxima bajo la curva (AUC) haciendo clic y arrastrando el ratón. Los espectros MS correspondientes se mostrarán en la misma ventana.
  3. Seleccione un ion objetivo para el siguiente análisis MS/MS.
    1. Vuelva a abrir la ventana de edición de métodos. En la tabla MSn Setting , establezca el m/z del ion objetivo en un decimal en la columna Masa principal .
    2. Seleccione Modo de colisión e introduzca el valor de energía de colisión (CE). Establezca el rango de escaneo MS/MS. Haga clic en el botón Guardar para grabar el método MS e ingrese un nuevo nombre de archivo en la tabla de secuencia. Haga clic en el botón Inicio para iniciar la adquisición de MS / MS.
      NOTA: El rango de exploración MS/MS fue del 40% -130% del ion padre objetivo. El valor CE predeterminado en el modo de disociación inducida por colisión (CID) es del 35%.
  4. Haga doble clic en el archivo sin procesar en el explorador para cargar el archivo sin procesar MS / MS en el software de procesamiento de datos.
    1. Identifique el ion fragmento más fuerte en el espectro MS/MS e introduzca su valor m/z en la lista de métodosMS n. En la tabla Configuración de MS n, defina los parámetros de MS3, incluido el modo de colisión, el valor CE y el rango de escaneo.
    2. Haga clic en el botón Guardar para grabar el método MS e ingrese un nuevo nombre de archivo en la tabla de secuencia. Haga clic en el botón Inicio para iniciar la adquisición de MS3 .
  5. Haga doble clic en el archivo RAW en el explorador para cargar el archivo RAW MS3 en el software de procesamiento de datos. Repita el paso 4.4 para obtener el espectro MS4 .
  6. Completar el experimento MSn cuando no se observen iones de fragmentos estables en el espectro.

5. Análisis manual de datos de MSn

  1. Haga doble clic en los archivos sin procesar para abrir todos los espectros de masas de MS a MSn. Calcule manualmente los valores de diferencia m/z entre el ion y los iones de fragmento correspondientes.
    NOTA: Por ejemplo, el valor de diferencia m/z entre el ion (m/z 617.25) y los iones de fragmento correspondientes (m/z 571.28) fue 45.97 en MS/MS, el valor de diferencia m/z entre el ion (m/z 571.28) y los iones de fragmento correspondientes (m/z 525.38) fue 45.90 en MS3, y los valores de diferencia m/z entre el ion (m/z 525.38) y los iones de fragmento correspondientes (m/z 344.93 y 273.16) fueron 180.45 y 252,22 en MS4, respectivamente.
  2. Dibuje manualmente la estructura "central" de acuerdo con los resultados de MS4 (el último nivel de MSn). Deriva manualmente la estructura original utilizando grupos funcionales o segmentos moleculares basados en el valor de diferencia m/z. Dibujar manualmente las trayectorias de escisión molecular de acuerdo con cada estructura molecular en MSn. Los ejemplos de derivación molecular manual se detallan en la sección de resultados representativos.

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Resultados

La celobiosa se utilizó como modelo para verificar la viabilidad de MSn en modo de iones positivos. Como se muestra en la Figura 2A, el ESI-MS (modo de iones positivos) de la celobiosa [C 12 H22O11]+ produjo la molécula protonada [M+H]+ a m/z 365. El escaneo iónico producto (CID-MS/MS) de [M+H]+ a m/z 365 dio como resultado el segundo fragmento de ion a m/z 305 (Figura 2B), que se analizó más a fondo utilizando...

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Discusión

IT-MS y su tecnología MSn ofrecen un nuevo enfoque para identificar la estructura de los compuestos TCM traza. A diferencia de Q-TOF-MS, que no pudo identificar profundamente los iones del fragmento, IT-MS con tecnología MSn sobresale debido a su capacidad para aislar y acumular iones. Este artículo describe un método para identificar compuestos traza en la medicina tibetana utilizando la técnica IT-MS y MSn . El método utiliza el valor n en MSn para determinar la cantida...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Programa de Talento Xinglin de la Universidad de Chengdu de TCM (No. 030058191), la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de Sichuan (2022NSFSC1470) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82204765).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo ScientificCAS 75-05-8LC-MS grade
Formic AcidKnowlesCAS 64-18-6HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometerThermo ScientificLTQ XL
liquid chromatographThermo ScientificU3000
LTQ TuneThermo Scientificversion 2.8.0MS control software
MethanolThermo ScientificCAS 67-56-1LC-MS grade
Pure waterThermo ScientificCAS 7732-18-5LC-MS grade
XcaliburThermo Scientificversion 2.0LC-IT-MS operational software

Referencias

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  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028(2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
  4. Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322(2022).
  5. Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050(2022).
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  7. Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089(2022).
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  12. Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
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