JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем общий протокол и дизайн, которые могут быть применены для идентификации следовых количеств и второстепенных компонентов в сложных составах натуральных продуктов (матрицах) в тибетской медицине.

Аннотация

Тибетские лекарства сложны и содержат множество неизвестных соединений, что делает углубленное исследование их молекулярных структур критически важным. Жидкостная хроматография-электрораспылительная ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (LC-ESI-TOF-MS) обычно используется для извлечения тибетской медицины; Тем не менее, многие непредсказуемые неизвестные соединения остаются после использования базы данных спектра. В настоящей статье разработан универсальный метод идентификации компонентов в тибетской медицине с использованием масс-спектрометрии ионных ловушек (ИТ-МС). Метод включает в себя стандартизированные и запрограммированные протоколы для пробоподготовки, настройки МС, предварительного запуска LC, установления метода, сбора МС, многоступенчатой работы МС и ручного анализа данных. Два репрезентативных соединения в тибетской медицине Abelmoschus manihot seeds были идентифицированы с использованием многоступенчатой фрагментации с подробным анализом типичных структур соединений. Кроме того, в статье рассматриваются такие аспекты, как выбор ионной моды, регулировка подвижной фазы, оптимизация диапазона сканирования, управление энергией столкновения, переключение режима столкновения, коэффициенты фрагментации и ограничения метода. Разработанный стандартизированный метод анализа является универсальным и может быть применен к неизвестным соединениям в тибетской медицине.

Введение

Качественный анализ микрокомпонентов в традиционной китайской медицине (ТКМ) стал важной темой в исследованиях. Из-за большого количества соединений в ТКМ их трудно выделить для анализа спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или рентгеновского дифрактометра (XRD), что делает методы на основе масс-спектрометрии (МС), требующие только небольших объемов образцов, все более популярными. Кроме того, жидкостная хроматография (ЖК) в сочетании с МС широко используется в исследованиях ТКМ в последние годы для улучшения разделения сложных образцов и качественного анализа химических соединений1. Одним из распространенных методов является времяпролетная масс-спектрометрия жидкостной хроматографии и ионизации электрораспылением (LC-ESI-TOF-MS), которая широко используется в качественных исследованиях тибетской медицины2. С помощью этого метода сложные компоненты обогащаются и разделяются в колонке LC, а отношение массы к заряду (m/z) ионов аддукта наблюдается с помощью детектора MS. Поиск в тандемных базах данных MS (MS/MS или MS2) в настоящее время является самым быстрым подходом к уверенным аннотациям соединений в низкомолекулярном анализе с использованием квадрупольного времяпролетного (Q-TOF) MS и Orbitrap MS3. Однако низкое качество баз данных и наличие различных изомеров препятствуют идентификации неизвестных соединений. Кроме того, информация, предоставляемая базой данных MS/MS, ограничена 4,5,6,7. Важно исследовать химические соединения в каждой ТКМ с использованием общего протокола, который может быть широко применен к другим ТКМ.

IT-MS улавливает широкий спектр ионов, подавая различные радиочастотные (РЧ) напряжения на кольцевые электроды8. IT-MS может выполнять многоступенчатое сканирование MS временных рядов в различных хронологических порядках, обеспечивая фрагментацию многоступенчатого MS ингредиентов (MS n), гдеn - количество стадий9 ионов продукта. Линейный IT-MS считается лучшим для идентификации структуры, так как его можно использовать для последовательных экспериментовMS n 10. Целевые ионы могут быть выделены и накоплены в линейном IT-MS1. MSn (n ≥ 3) в IT-MS предоставляет больше информации о фрагментах, чем MS/MS в Q-TOF-MS. Поскольку IT-MS не может блокировать ион-мишень и его фрагментированные ионы, он является мощным инструментом для выяснения структуры неизвестных соединений, включая изомеры1. Технология MSn широко применяется для структурного анализа неизвестных белков, пептидов и полисахаридов11,12. Уровень содержания фрагментных ионов в MSn обеспечивает больше информации о молекулярных фрагментах целевых соединений в сложных образцах, чем MS / MS в Q-TOF-MS. Следовательно, применение технологии MSn для структурной идентификации в ТКМ имеет важное значение.

Тибетская медицина является важным компонентом TCM13, и эти лекарства в основном получены из животных, растений и минералов, найденных в районе плато14. Тибетская медицина Abelmoschus manihot seeds (AMS) - это семя Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS — это традиционная фитотерапия, используемая для лечения таких состояний, как атопический дерматит, ревматизм и проказа. Он содержит халкон, который обладает антибактериальным, противогрибковым, противоопухолевым, антиоксидантным и противовоспалительным действием15. В настоящемисследовании были усовершенствованы процедуры MSN, и был разработан подробный метод идентификации сложных структур в AMS тибетской медицины с использованием IT-MS и MSn. Некоторые параметры MS, включая ионный режим, дальность сканирования и режим столкновения, были оптимизированы для преодоления проблем с идентификацией следовых соединений. Это исследование направлено на содействие стандартизированной идентификации структуры следовых соединений в ТКМ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Пробоподготовка

  1. Точно взвесьте 1 г образца AMS и поместите его в коническую колбу с 30 мл 80% метанола. Перенесите смесь в ультразвуковую ванну на 30 минут экстракции при 25 ° C. Центрифугируйте образец при 14 000 x g в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота ультразвукового аппарата ультразвуковой ванны составляет 40 кГц.
  2. Подготовьте инъекционный шприц и микропористый мембранный фильтр (0,22 мкм, только органический). Отфильтруйте надосадочную жидкость в бутылку с образцом объемом 2 мл.

2. Настройка MS

  1. Включите выключатель вакуумного насоса. Откройте главный клапан баллона с аргоном и клапан парциального давления и отрегулируйте давление примерно до 0,3 МПа. Откройте азотный клапан.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите не менее 8 часов, чтобы обеспечить достаточную степень вакуума для условий эксперимента. Перед анализом убедитесь, что давление газа аргона и азота достаточно высокое.
  2. Запустите управляющее программное обеспечение MS. Нажмите « Источник SEI с подогревом » на панели программного обеспечения и введите параметры MS, включая температуру нагревателя (350 °C), расход газа в оболочке (35 arb), расход вспомогательного газа (15 arb), напряжение распыления (3,8 кВ для положительного режима, -2,5 кВ для отрицательного режима) и температуру капилляров (275 °C). Нажмите кнопку «Применить », чтобы активировать источник ионов.

3. Предварительный запуск LC, установление метода и получение MS

  1. Приготовьте подвижную фазу А и подвижную фазу В, используя 0,1% водный раствор муравьиной кислоты и чистый ацетонитрил соответственно. Дегазируйте их в ультразвуковой ванне ультразвукового аппарата в течение не менее 15 минут. Подсоедините растворы к каналам для жидкости A и B соответственно (рис. 1A). Приготовьте раствор метанола и воды (1:9 об./об.), а затем вручную залейте его в бутылки с жидкостью для очистки насоса и инжектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота ультразвукового аппарата ультразвуковой ванны составляет 40 кГц.
  2. Запустите управляющее программное обеспечение LC-MS.
    1. Нажмите кнопку «Прямое управление», чтобы открыть панель управления LC. Откройте продувочный клапан против часовой стрелки на модуле насоса (рис. 1B).
    2. Нажмите кнопку « Дополнительно », чтобы открыть настройку насоса, и установите параметры продувки на уровне 5 млмин-1 в течение 3 минут. Нажмите кнопку «Очистка », чтобы начать удаление пузырьков. Затем закройте продувочный клапан.
  3. Нажмите на кнопки «Основной шприц», «Буферная петля для стирки» и «Внешняя игла для стирки », чтобы ополоснуть шприц в течение трех циклов, петлю в течение одного цикла и иглу в течение одного цикла соответственно. Поместите бутылку с образцом в пробоотборник (рис. 1C).
  4. Нажмите кнопку «Настройка инструмента», чтобы открыть окно редактирования метода. Нажмите кнопку «Создать», чтобы создать новый метод прибора LC-MS.
  5. Установите общее время выполнения метода LC. Затем введите значения для установки предельного давления, общего расхода, градиента потока, температуры образца, температуры колонны и дельты готовой температуры в окне редактирования метода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий расход подвижной фазы по умолчанию постоянен на уровне 0,3 мл/мин с 50% A и 50% B и без температуры колонки при отсутствии хроматографической колонки. Значения температуры образца и дельты температуры готовности по умолчанию составляют 15 °C и 0,1 °C соответственно. Другие настройки зависят от типа используемой колонки жидкостной хроматографии.
  6. Выберите общий тип эксперимента MS или MS n для метода MS. Введите значения, чтобы настроить время сбора данных, полярность, диапазон масс, номер значения отклонения и продолжительность значения отклонения. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы настроить параметры как метод инструмента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки по умолчанию без хроматографической колонки следующие: время сбора данных, 2 мин; полярность, положительная или отрицательная; диапазон масс от 100 до 1 200; число значений отклонения, 2; и продолжительность отклонения значения, 1,99 мин.

4. Операционная многоступенчатая масс-спектрометрия

  1. Нажмите кнопку «Настройка последовательности», чтобы открыть таблицу последовательностей.
    1. В таблице введите следующую информацию: тип образца, имя файла, путь, идентификатор образца, метод прибора, положение и объем впрыска.
    2. Нажмите кнопку « Сохранить », чтобы записать таблицу последовательностей, а затем нажмите кнопку « Начать анализ », чтобы выполнить настройки и начать сбор MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тип выборки по умолчанию выбран как неизвестный. Инструментальный метод — это метод, сохраненный на шаге 3.6. Флакон с образцом помещается в свое уникальное место в комнате для образцов. Например, RA1 — это первое место в первом ряду красной области в комнате для образцов. Объем впрыска по умолчанию обычно составляет 2 мкл, что зависит от концентрации образца.
  2. Дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить данные MS в программное обеспечение для обработки данных. На базовой пиковой хроматограмме (BPI) выберите область с максимальной площадью под кривой (AUC), щелкнув и перетащив мышь. Соответствующие спектры МС будут отображаться в том же окне.
  3. Выберите ион-мишень для следующего анализа МС/МС.
    1. Снова откройте окно редактирования метода. В таблице MSn Setting установите m/z целевого иона на один десятичный знак в столбце «Родительская масса ».
    2. Выберите режим столкновения и введите значение энергии столкновения (CE). Установите диапазон сканирования MS/MS. Нажмите кнопку « Сохранить », чтобы записать метод MS, и введите новое имя файла в таблицу последовательностей. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать приобретение MS/MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон сканирования MS / MS составлял 40% -130% от целевого родительского иона. Значение CE по умолчанию в режиме диссоциации, вызванной столкновением (CID), составляет 35%.
  4. Дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить необработанный файл MS / MS в программное обеспечение для обработки данных.
    1. Определите самый сильный фрагментный ион в спектре MS/MS и введите его значение m/z в список методов MSn. В таблице настроек MSn установите параметры MS3, включая режим столкновения, значение CE и диапазон сканирования.
    2. Нажмите кнопку « Сохранить », чтобы записать метод MS, и введите новое имя файла в таблицу последовательностей. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать сбор MS3 .
  5. Дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить необработанный файл MS3 в программное обеспечение для обработки данных. Повторите шаг 4.4, чтобы получить спектр MS4 .
  6. Завершите эксперимент MSn , когда в спектре не наблюдается стабильных фрагментных ионов.

5. Ручной анализ данных MSn

  1. Дважды щелкните необработанные файлы, чтобы открыть все масс-спектры от MS до MSn. Вручную рассчитайте значения разницы m/z между ионом и соответствующими ионами фрагмента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, значение разницы m/z между ионом (m/z 617,25) и соответствующими ионами-фрагментами (m/z 571,28) составило 45,97 в MS/MS, значение разницы m/z между ионом (m/z 571,28) и соответствующими ионами фрагментов (m/z 525,38) составило 45,90 в MS3, а значения разницы m/z между ионом (m/z 525,38) и соответствующими ионами фрагмента (m/z 344,93 и 273,16) составили 180,45 и 252,22 в МС4 соответственно.
  2. Вручную нарисуйте «основную» структуру по результатам MS4 (последний уровень MSn). Вручную выведите исходную структуру, используя функциональные группы или молекулярные сегменты на основе значения разности m/z. Вручную нарисуйте пути молекулярного расщепления в соответствии с каждой молекулярной структурой в MSn. Примеры ручного молекулярного деривации подробно описаны в разделе репрезентативных результатов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Целлобиоза была использована в качестве модели для проверки осуществимости MSn в режиме положительных ионов. Как показано на рисунке 2A, ESI-MS (режим положительных ионов) целлобиозы [C 12 H22O11]+ продуцировал протонированную молекулу [M + H]+ при m / z 365....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

IT-MS и его технология MSn предлагают новый подход к идентификации структуры следовых соединений ТКМ. В отличие от Q-TOF-MS, который не мог глубоко идентифицировать фрагменты ионов, IT-MS с технологией MSn выделяется своей способностью изолировать и накапливать ионы. В этой статье опи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Программой талантов Синлинь Чэндуского университета ТКМ (No 030058191), Фондом естественных наук провинции Сычуань (2022NSFSC1470) и Национальным фондом естественных наук Китая (82204765).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo ScientificCAS 75-05-8LC-MS grade
Formic AcidKnowlesCAS 64-18-6HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometerThermo ScientificLTQ XL
liquid chromatographThermo ScientificU3000
LTQ TuneThermo Scientificversion 2.8.0MS control software
MethanolThermo ScientificCAS 67-56-1LC-MS grade
Pure waterThermo ScientificCAS 7732-18-5LC-MS grade
XcaliburThermo Scientificversion 2.0LC-IT-MS operational software

Ссылки

  1. Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028(2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
  4. Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322(2022).
  5. Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050(2022).
  6. Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358(2022).
  7. Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089(2022).
  8. Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
  9. Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270(2016).
  10. Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
  11. Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
  12. Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
  13. Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
  14. Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).
  15. Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198(2022).
  16. Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , In Press (2022).
  17. Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
  18. Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
  19. Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
  20. Wu, S. -L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
  21. Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE193MSn

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены