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Resumen

El presente protocolo describe una estrategia integrada para explorar los objetivos y mecanismos clave de Fructus Phyllanthi contra la hiperlipidemia basada en la predicción de la farmacología de la red y la verificación metabolómica.

Resumen

La hiperlipidemia se ha convertido en un factor de riesgo principal para enfermedades cardiovasculares y lesiones hepáticas en todo el mundo. Fructus Phyllanthi (FP) es un fármaco eficaz contra la hiperlipidemia en la medicina tradicional china (MTC) y las teorías de la medicina india, sin embargo, el mecanismo potencial requiere una mayor exploración. La presente investigación tiene como objetivo revelar el mecanismo de PF contra la hiperlipidemia basado en una estrategia integrada que combina la predicción de farmacología en red con la validación metabolómica. Se estableció un modelo de ratones inducido por una dieta alta en grasas (HFD) mediante la evaluación de los niveles de lípidos plasmáticos, incluido el colesterol total (CT), los triglicéridos (TG), el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) y el colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C). Se aplicó farmacología en red para conocer los principios activos de la PF y las posibles dianas contra la hiperlipidemia. Se realizó metabolómica del plasma y el hígado para identificar metabolitos diferenciales y sus vías correspondientes entre el grupo normal, el grupo modelo y el grupo de intervención. La relación entre la farmacología de redes y la metabolómica se construyó aún más para obtener una visión integral del proceso de PF contra la hiperlipidemia. Las proteínas diana clave obtenidas se verificaron mediante acoplamiento molecular. Estos resultados reflejaron que la PF mejoró los niveles plasmáticos de lípidos y la lesión hepática de la hiperlipidemia inducida por una HFD. El ácido gálico, la quercetina y el beta-sitosterol en la PF se demostraron como los compuestos activos clave. Se encontró que un total de 16 y seis metabolitos diferenciales potenciales en plasma e hígado, respectivamente, estaban involucrados en los efectos terapéuticos de la PF contra la hiperlipidemia por metabolómica. Además, el análisis de integración indicó que los efectos de la intervención se asociaron con CYP1A1, AChE y MGAM, así como con el ajuste de L-quinurenina, corticosterona, acetilcolina y rafinosa, involucrando principalmente la vía del metabolismo del triptófano. El acoplamiento molecular aseguró que los ingredientes anteriores que actúan sobre los objetivos proteicos relacionados con la hiperlipidemia desempeñaron un papel clave en la reducción de los lípidos. En resumen, esta investigación proporcionó una nueva posibilidad para prevenir y tratar la hiperlipidemia.

Introducción

La hiperlipidemia es una enfermedad metabólica común con graves impactos en la salud humana, y también es el principal factor de riesgo para enfermedades cardiovasculares1. Recientemente, ha habido una tendencia a la baja relacionada con la edad para esta enfermedad, y las personas más jóvenes se han vuelto más susceptibles debido a estilos de vida irregulares a largo plazo y hábitos alimenticios poco saludables2. En la clínica, se han utilizado varios medicamentos para tratar la hiperlipidemia. Por ejemplo, uno de los medicamentos más utilizados para pacientes con hiperlipidemia y trastornos ateroscleróticos relacionados son las estatinas. Sin embargo, el uso a largo plazo de estatinas tiene efectos secundarios que no pueden ser descuidados, que conducen a un mal pronóstico, como intolerancia, resistencia al tratamiento y eventos adversos 3,4. Estas deficiencias se han convertido en dolores adicionales para los pacientes con hiperlipidemia. Por lo tanto, se deben proponer nuevos tratamientos para una eficacia hipolipemiante estable y menos efectos secundarios.

La Medicina Tradicional China (MTC) ha sido ampliamente utilizada para tratar enfermedades debido a su buena eficacia y pocos efectos secundarios5. Fructus Phyllanthi (FP), el fruto seco de Phyllanthus emblica Linn. (popularmente conocida como amla berry o grosella espinosa india), es una famosa medicina y alimento homólogo material de las medicinas tradicionales chinas e indias 6,7. Este medicamento se ha utilizado para eliminar el calor, enfriar la sangre y promover la digestión, según las teoríasde la MTC 8. Los estudios farmacológicos modernos han demostrado que la PF es rica en compuestos bioactivos como ácidos gálicos, ácidos elágicos y quercetina9, que son responsables de una gama de propiedades biológicas multifacéticas, al actuar como antioxidante, antiinflamatorio, protección hepática, antihipolipídico, etc.10. Investigaciones recientes también han demostrado que la PF podría regular eficazmente los lípidos sanguíneos de pacientes con hiperlipidemia. Por ejemplo, Variya et al.11 han demostrado que el jugo de fruta PF y su principal ingrediente químico del ácido gálico pueden disminuir el colesterol plasmático y reducir la infiltración de aceite en el hígado y la aorta. La eficacia terapéutica se relacionó con la regulación de PF en el aumento de la expresión del receptor alfa activado por proliferadores de peroxisomas y la disminución de la actividad lipogénica hepática. Sin embargo, el mecanismo subyacente de la PF en la mejora de la hiperlipidemia debe investigarse más a fondo, porque sus ingredientes bioactivos son bastante extensos. Se buscó explorar el mecanismo potencial de la eficacia terapéutica de la PF, que puede ser beneficioso para el desarrollo y la utilización posteriores de este medicamento.

Actualmente, la farmacología en red se considera una técnica holística y eficiente para estudiar el mecanismo terapéutico de la MTC. En lugar de buscar genes y fármacos causantes de enfermedades individuales que traten únicamente un objetivo individual, se construye una red completa de medicamentos-ingredientes-genes-enfermedades para encontrar el mecanismo multi-objetivo del fármaco multi-ingrediente con respecto a su tratamiento integral12. Esta técnica es especialmente adecuada para la MTC, ya que sus composiciones químicas son masivas. Desafortunadamente, la farmacología de red solo se puede usar para pronosticar objetivos afectados por ingredientes químicos en teoría. Se deben observar los metabolitos endógenos en el modelo de enfermedad para validar la efectividad de la farmacología de red. El método metabolómico, que surge con el desarrollo de la biología de sistemas, es una herramienta importante para monitorear los cambios en los metabolitos endógenos13. Los cambios en los metabolitos reflejan los cambios en el estado estacionario del huésped, que también es un indicador importante para estudiar el mecanismo interno. Algunos investigadores han integrado con éxito la farmacología y la metabolómica de la red para explorar el mecanismo de interacción entre fármacos y enfermedades14,15.

Este artículo explora las bases mecanicistas de la PF contra la hiperlipidemia mediante la integración de técnicas de farmacología de redes y metabolómica. Se aplicó farmacología en red para analizar la relación entre los principales principios activos de PF y dianas moleculares para la hiperlipidemia. Posteriormente, se realizó metabolómica para observar el cambio de metabolitos endógenos en el modelo animal, lo que puede explicar las acciones del medicamento a nivel metabólico. En comparación con la aplicación de la farmacología de redes o la metabonómica sola, este análisis integrado proporcionó un mecanismo de investigación más específico y completo. Además, se utilizó la estrategia de acoplamiento molecular para analizar la interacción entre los ingredientes activos y las proteínas clave. En general, este enfoque integrado podría compensar la falta de evidencia experimental para la farmacología de redes y la falta de un mecanismo endógeno para el método metabolómico, y puede usarse para el análisis del mecanismo terapéutico de la medicina natural. El diagrama de flujo esquemático principal del protocolo se muestra en la Figura 1.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética Institucional de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Protocolo número 2020-36). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 (20 ± 2 g). Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).

1. Predicción basada en farmacología de redes

NOTA: La farmacología en red se utiliza para predecir los principios activos y sus dianas clave de PF contra la hiperlipidemia.

  1. Selección de principios activos y objetivos clave
    1. Busque la palabra clave "Phyllanthi Fructus" en la base de datos de farmacología del sistema de medicina tradicional china (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) para obtener la lista de los ingredientes activos candidatos y objetivos de PF.
      NOTA: Normalmente, solo se incluyen como ingredientes activos los ingredientes con biodisponibilidad oral (OB) ≥30% y valores similares a medicamentos (DL) ≥0.18 en la base de datos.
    2. Busque la palabra clave "hiperlipidemia" en la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/), la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; https://omim.org/) y la base de datos de dianas terapéuticas (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) para obtener los respectivos objetivos candidatos de hiperlipidemia. Descargue las hojas de cálculo de los objetivos de la enfermedad. Elimine los objetivos repetidos para obtener la lista de objetivos de hiperlipidemia.
    3. Copie estas listas de los pasos 1.1.1 y 1.1.2 en una nueva hoja de cálculo. Utilice la función "Datos - Identificar duplicados" en la barra de herramientas para obtener objetivos de intersección. Importe la lista de objetivos de intersección en UniProtKB (http://www.uniprot.org/) para estandarizar los nombres de genes y proteínas.
      NOTA: Estos objetivos están relacionados tanto con PF como con hiperlipidemia. Por lo tanto, predecir estos objetivos de intersección como los objetivos de PF contra la hiperlipidemia.
  2. Construcción de una red de interacción proteína-proteína
    1. Abra la base de datos STRING (https://string-db.org/) 11.5. Pegue la lista de objetivos de intersección de PF contra la hiperlipidemia en el cuadro de diálogo "Lista de nombres". Seleccione Homo sapiens en "Organismos " y haga clic en el > BUSCAR CONTINUAR.
      NOTA: Los seres humanos y los ratones tienen genes muy similares. Por lo tanto, se lleva a cabo una verificación experimental adicional con ratones.
    2. Cuando los resultados estén disponibles, marque ocultar nodos desconectados en la red en "Configuración avanzada". Establezca la confianza más alta (0.900) en "puntuación de interacción mínima requerida", luego haga clic en el botón ACTUALIZAR .
    3. Haga clic en Exportaciones en la barra de título y descargue el breve texto tabular de la red de interacción proteína-proteína (PPI) en formato PNG y TSV.
  3. Construcción de una red de medicamentos-componentes-enfermedad-diana
    1. Abra Cytoscape 3.9.1 (ver Tabla de materiales). Importe el archivo de formato TSV del paso 1.2.3. Optimice el color, la fuente y el lado de los nodos de red a través de la barra de estilo en el panel de control.
    2. Utilice la función "Analizar red" para el análisis de topología de red. Obtener genes hub por CytoHubba en Cytoscape. Establecer la red fármaco-ingrediente-diana-enfermedad.
  4. Análisis de enriquecimiento GO y KEGG
    1. Open DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Haga clic en Iniciar análisis y pegue la lista de objetivos en el cuadro de diálogo izquierdo. Seleccione OFFICIAL GENE SYMBOL en "Select Identifier" (Seleccionar identificador). Seleccione Homo sapiens en "Seleccionar especie". Lista de genes de garrapatas en "Tipo de lista". Haga clic en Lista de envíos.
    2. Cuando los resultados estén disponibles, haga clic en Analizar la lista de genes anterior con una de las herramientas de DAVID. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT en "Gene Ontology" para el análisis de enriquecimiento de funciones GO. Marque KEGG_Pathway en "Vías" para el análisis de enriquecimiento de vías KEGG.
    3. Haga clic en Gráfico de anotación funcional para mostrar los resultados.
      NOTA: Establezca el umbral de significación estadística del análisis de enriquecimiento en p < 0,05.

2. Diseño experimental

  1. La preparación del extracto acuoso FP
    NOTA: La PF se procesa en el laboratorio de la profesora Lina Xia en la Universidad de Chengdu de TCM8.
    1. Remojar el polvo seco de FP (90 g) en 1 L de agua pura en un matraz aforado limpio de 2 L. Use tratamiento ultrasónico (en un baño de agua a 4 ° C, potencia: 250W, frecuencia: 35 kHz) para ayudar a disolver durante 30 min. Filtrar la solución para obtener el extracto con una gasa médica estéril de doble capa, 1 mm x 1 mm. Repita la operación anterior tres veces para garantizar la disolución completa de FP.
    2. Utilice el método de evaporación rotativa para una mayor concentración. Ajuste la velocidad de rotación a 50 rpm con una temperatura de 60 °C durante 4 h. Concentrar el extracto acuoso a 100 mL.
    3. Divida el extracto crudo de FP (0,9 g/ml) uniformemente en dos partes (50 ml). Una parte se utiliza como líquido FP de dosis alta (0,9 g/ml). Agregue 50 ml de agua pura en otra parte y considérelo como el líquido FP de dosis baja (0.45 g / ml). Utilice las soluciones acuosas de FP de dosis altas y bajas para la administración. Conservar el líquido a -20 °C hasta su uso.
  2. Preparación animal
    1. Aloje a 50 ratones machos C57BL/6 (20 ± 2 g) en una habitación bien ventilada a temperatura ambiente, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso gratuito a alimentos y agua pura.
    2. Asigne aleatoriamente a los ratones a dos grupos: alimentar a 10 ratones con una dieta normal y 40 ratones con una dieta alta en grasas (ver Tabla de materiales) para inducir hiperlipidemia.
      NOTA: Después de alimentarse durante 8 semanas, los ratones fueron examinados para una mayor intervención farmacológica.
    3. En la 8ª semana, extraer unos 200 μL de sangre de cada órbita del ratón. Centrifugar la sangre durante 10 min a 5.733 x g a 4 °C para obtener muestras de plasma. Determine los niveles de TC y TG con kits de ensayo disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales).
    4. Seleccione seis ratones con los niveles de lípidos más normales como el grupo de control sin tratamiento (NC). Seleccione 24 ratones con un nivel de lípidos significativamente más alto como el grupo de dieta alta en grasas, y divídalos aleatoriamente en cuatro grupos: grupo de dieta alta en grasas (HFD), grupo de FP (FP_L) de dosis baja, grupo de FP de dosis alta (FP_H) y grupo de control positivo (PC).
    5. Administrar irrigación gástrica a los grupos FP_L y FP_H con dos dosis de PF (dosis baja, 4,5 g/kg y dosis alta, 9 g/kg), respectivamente; irrigación gástrica al grupo CP con tabletas de simvastatina (5 mg/kg; ver Tabla de Materiales); e irrigación gástrica a los grupos NC y HFD con el mismo volumen de solución salina fisiológica una vez al día durante 4 semanas.
      NOTA: El presente estudio utilizó las soluciones acuosas de PF y simvastatina para el tratamiento.
    6. En la semana 12, después de la anestesia con pentobarbital sódico al 1% (30 mg / kg), sacrificar los ratones de todos los grupos. Recolecte ~400 μL de muestras de sangre de la vena orbitaria de cada ratón.
      NOTA: Estimule los dedos de los pies y las plantas de los ratones con pinzas. Si no hay reacción, resulta anestesia adecuada.
    7. Centrifugar la sangre durante 10 min a 5.733 x g a 4 °C para obtener muestras de plasma y determinar los niveles de TC, TG, LDL-C y HDL-C con kits de ensayo disponibles comercialmente (ver Tabla de materiales). Obtener muestras de tejido hepático16 y someterlas a análisis histopatológicos. Utilice las muestras de plasma y hígado restantes para el análisis metabolómico (paso 3).
      NOTA: Todas las muestras se almacenan a -80 °C hasta su uso.
  3. Examen histopatológico hepático
    1. Fijar los tejidos hepáticos frescos con solución de paraformaldehído al 4% durante más de 24 h. Saque el tejido del fijador y alise los tejidos diana con un bisturí. Coloque el pañuelo y la etiqueta correspondiente en el deshidratador.
    2. Deshidratar en un gradiente de etanol: alcohol al 75% durante 4 h, alcohol al 85% durante 2 h, alcohol al 90% durante 2 h, alcohol al 95% durante 1 h, etanol absoluto durante 1 h, xileno durante 30 min. Coloque el cassette de tejido en un molde de pañuelo en cera de parafina durante tres lavados, 30 minutos cada16.
    3. Coloque los pañuelos empapados en cera en la incrustadora de tejido (consulte la Tabla de materiales). Antes de que la cera se solidifique, retire los tejidos del deshidratador, colóquelos en la caja incrustada y coloque la etiqueta correspondiente.
    4. Enfríe los bloques de cera en una mesa de congelación a -20 °C, retírelos del marco incrustado y recorte el bloque de cera.
    5. Corte los bloques de cera recortados en secciones de 3 μm de espesor con un micrótomo (consulte la Tabla de materiales). Flote las secciones en agua a 40 °C, retírelas de los toboganes y hornee en un horno a 60 °C. Después de hornear con agua y cera seca, sáquelo y manténgalo a temperatura ambiente.
    6. Coloque sucesivamente las secciones en xileno I durante 10 min, xileno II durante 10 min, xileno III durante 10 min, etanol absoluto I durante 5 min, etanol absoluto II durante 5 min, alcohol al 75% durante 5 min y lavar en agua16.
    7. Tiñe las secciones con solución de tinción de hematoxilina durante 4 minutos, solución de alcohol de ácido clorhídrico al 1% (alcohol al 75%) para diferenciación, solución de agua de amoníaco al 1% de azul y lávelas con agua.
    8. Manche las secciones con solución de tinción de eosina durante 2 minutos y lávelas con agua.
    9. Observe las secciones utilizando un microscopio óptico con un aumento de 200x y 400x.
  4. Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)
    1. Identificación de ingredientes de PF
      NOTA: El análisis se realiza utilizando cromatografía líquida de ultra alta resolución junto con espectrometría de masas híbrida cuadrupolo-órbita rap de alta resolución (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; ver Tabla de materiales).
      1. Medir con precisión 1 g de polvo seco de PF y ponerlo en un matraz aforado limpio de 50 ml.
      2. Añadir 25 ml de metanol al 70% en el matraz aforado y pesar con precisión. Use tratamiento ultrasónico (en un baño de agua a 4 ° C, potencia: 250 W, frecuencia: 35 kHz) durante 30 minutos para ayudar a la disolución. Pesa con precisión de nuevo para determinar con precisión la pérdida después de la disolución, y utiliza metanol al 70% para compensar la pérdida.
        NOTA: No mida el volumen, ya que la escala del matraz aforado no es exacta, especialmente después del baño maría a 4 °C.
      3. Agitar para mezclar completamente. Utilice una membrana microporosa de 0,22 μm para filtrar.
    2. Preparación de muestras de plasma
      1. Añadir con precisión 100 μL de plasma (paso 2.2.7) en un volumen doble (200 μL) de acetonitrilo en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, y vórtice con un vibrador de vórtice durante al menos 30 s. Siga este procedimiento para todas las muestras.
      2. Centrifugar todas las muestras a 17.200 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera los sobrenadantes después de la centrifugación a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Secar los sobrenadantes bajo nitrógeno. Reconstituir con 200 μL de disolvente de extracción (acetonitrilo:agua = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex la solución reconstituida durante al menos 30 s y utilizar tratamiento ultrasónico durante 10 min (en un baño de agua a 4 °C, potencia: 250 W, frecuencia: 35 kHz). Centrifugadora a 17.200 x g durante 10 min a 4 °C.
      4. Filtrar los sobrenadantes con membranas filtrantes de 0,22 μm y mantenerlos a 4 °C para su análisis.
    3. Preparación de la muestra de hígado
      1. Homogeneizar 90 mg de tejido hepático (paso 2.2.7) durante 1 minuto en agua helada de metanol (1:1, v/v, 1 ml) y centrifugarlos a 21.500 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga de 1,5 ml. Siga este procedimiento para todas las muestras.
      2. Extraiga los precipitados de nuevo siguiendo el mismo procedimiento y agrupe los sobrenadantes en nuevos tubos de centrífuga de 1,5 ml. Secar los sobrenadantes bajo nitrógeno. Reconstituir con 300 μL del disolvente de extracción (metanol:agua = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex la solución reconstituida durante al menos 30 s y utilizar tratamiento ultrasónico durante 10 min (en un baño de agua a 4 °C, potencia: 250 W, frecuencia: 35 kHz). Centrifugadora a 17.200 x g durante 15 min a 4 °C.
      4. Filtrar los sobrenadantes con membranas filtrantes de 0,22 μm y mantenerlos a 4 °C para su análisis.
        NOTA: Las muestras agrupadas de control de calidad (QC) se prepararon mezclando 10 μL de alícuotas de cada muestra de plasma y hígado (una por cada seis muestras).
    4. Parámetros de análisis de LC-MS
      NOTA: La fase móvil consiste en 0,1% de ácido fórmico (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B). Transfiera estos disolventes a una botella de vidrio limpia y conéctelos con el sistema LC-MS.
      1. Establezca los programas de gradiente de muestras de plasma en el "archivo de entrada" del sistema LC-MS de la siguiente manera: 1% B (0-1.5 min), 1% -60% B (1.5-13.0 min), 60% -99% B (13.0-20.0 min), mantener en 99% B (20.0-25.0 min), 99% -1% B (25.0-25.1 min) y mantener en 1% B hasta 27 min.
      2. Defina las condiciones del muestreador automático de las muestras de plasma en el "archivo de entrada" del sistema LC-MS de la siguiente manera: el volumen de inyección, 2 μL; y el caudal, 0,3 mL/min, para cada análisis.
      3. Establezca el programa de gradiente de muestras de hígado en el "archivo de entrada" del sistema LC-MS de la siguiente manera: 1% B (0-1 min), 1% -53% B (1-15 min), 53% -70% B (15-30 min), 70% -90% B (30-32 min), 90% -95% B (32-40 min), 95% -1% B (40-42 min), y mantener en 1% B hasta 45 min.
      4. Establezca las condiciones del muestreador automático de las muestras hepáticas en el "archivo de entrada" del sistema LC-MS de la siguiente manera: volumen de inyección, 5 μL; y el caudal, 0,3 mL/min, para cada análisis.
      5. Establezca las condiciones de detección de MS de las muestras de plasma y hígado en el "archivo de ajuste de MS" del sistema LC-MS. Realice la adquisición de MS utilizando los modos de ionización positiva y negativa.
        NOTA: Los parámetros de ionización por electrospray calentado son los siguientes: voltaje de pulverización: 3.5 kV para ionización positiva y 3.8 kV para ionización negativa; Flujo de gas de vaina: 55 ARB; Flujo de gas auxiliar: 15 ARB; temperatura del calentador de sonda: 300 °C; y temperatura capilar: 350 °C.
      6. Importe los datos sin procesar recopilados en el software Compound Discoverer y establezca la plantilla de método siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).

3. Validación metabolómica

NOTA: Los datos de perfil metabolómico de metabolitos plasmáticos y hepáticos se importan al software Compound Discoverer para realizar la extracción de características metabólicas mediante la adopción de un algoritmo de extracción de características moleculares. Establezca los parámetros de la siguiente manera: desviación de masa, 5 x 10-6; rango de masa, 100-1.500; umbral de relación señal/ruido (SNR), 3; y desviación del tiempo de retención, 0,05. Evaluar la estabilidad y repetibilidad de la metabolómica por la desviación estándar relativa (RSD) de las áreas pico de control de calidad.

  1. Utilice el software SIMCA-P (ver Tabla de materiales) para el análisis estadístico multivariado de los valores integrales obtenidos de los hallazgos de LC-MS. Utilice el análisis discriminante ortogonal parcial de mínimos cuadrados (OPLS-DA) para los datos centrados en la media y el modelado de clases de muestra.
  2. Después de la prueba OPLS-DA, considerar los metabolitos, con integral con importancia variable en los valores de proyección (VIP) de >1 y un valor p de <0.05 de la prueba t de Student como los metabolitos diferenciales potenciales.
  3. Identificar los metabolitos alterados y las vías metabólicas mediante fuentes de bases de datos abiertas, incluyendo Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) y MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualice las vistas de resultados de MetaboAnalyst5.0 y la plataforma 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Acoplamiento molecular

  1. Descargue la estructura 3D de los ingredientes PF seleccionados de la base de datos TCMSP, respectivamente. Busque los nombres de los ingredientes en el cuadro de búsqueda 'Nombre químico' y descargue los archivos de estructura 3D correspondientes en formato mol2.
  2. Descargue las estructuras cristalinas de los objetivos clave de la base de datos de estructura de proteínas AlphaFold (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Busque los nombres de destino en el cuadro de búsqueda y descargue los archivos de estructuras cristalinas correspondientes en formato pdb.
  3. Importe ingredientes y archivos de estructuras de destino en el software AutoDockTools. Haga clic en Editar > Eliminar agua para eliminar moléculas de agua. Haga clic en Editar > hidrógenos > Agregar para agregar hidrógenos . Establezca los ingredientes como el "ligando" y realice el acoplamiento ciego seleccionando todos los objetivos como el "receptor"17.
  4. Ingrese un valor en el cuadro detrás de "centro" y "tamaño" para ajustar el espacio recién desarrollado, lo que permite abarcar completamente el ligando y el receptor. Guarde los archivos de ligando y receptor en formato pdbqt.
  5. Utilice AutoDock Vina para realizar el acoplamiento molecular. Establezca la barra "Receptor" en el nombre de 'receptor.pdbqt' y la barra "Ligando" en el nombre del 'ligando.pdbqt'. Obtener la ubicación óptima para la unión del ligando al receptor. Registre el valor de energía de enlace en la posición óptima.
    NOTA: El proceso de acoplamiento fue calculado por el algoritmo genético14. Todas las opciones de ejecución de acoplamiento eran valores predeterminados. Los marcos de acoplamiento se clasificarán automáticamente de la energía de enlace más alta a la más baja.
  6. Importe los archivos de acoplamiento en PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) para obtener el modelo visual del sistema. Descargue los archivos del modelo en formato pse e impórtelos al software PyMOL (consulte Tabla de materiales) para construir una visualización adicional.

5. Análisis estadístico

NOTA: Utilice el software estadístico SPSS (véase el cuadro de materiales) para el análisis de datos. Considere el valor de p < 0,05 como estadísticamente significativo.

  1. Exprese los valores como medias ± desviación estándar (DE).
  2. Realizar un ANOVA unidireccional seguido de diferencia menos significativa post hoc (LSD), Dunnett (en caso de varianza igual) o T3 de Dunnett (en caso de varianza desigual) para probar la significación estadística entre los grupos.

Resultados

Farmacología de redes
Un total de 18 ingredientes potenciales en PF se examinaron de acuerdo con sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la base de datos y el análisis LC-MS (los cromatogramas iónicos totales se muestran en la Figura Suplementaria 1). A través de la literatura relevante, el contenido de ácido gálico es mucho mayor que otros ingredientes y es eficaz en la reducción de lípidos 9,11. Por ...

Discusión

En los últimos años, la tasa de incidencia de hiperlipidemia ha ido en aumento, principalmente debido a los hábitos alimenticios poco saludables a largo plazo. La MTC y sus ingredientes químicos tienen diversas actividades farmacológicas, que han sido ampliamente estudiadas en los últimos años37,38. La PF es un tipo de recurso frutícola, utilizado tanto como medicina como alimento, y tiene un potencial importante para tratar la hiperlipidemia. Sin embargo...

Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Equipo de Desarrollo e Innovación de Productos de TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) y la Investigación sobre la Integración Transfronteriza de Nuevos Negocios de "Preservación y Rehabilitación de la Salud +".

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

Referencias

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

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