JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описывается комплексная стратегия изучения ключевых мишеней и механизмов Fructus Phyllanthi против гиперлипидемии, основанная на прогнозировании сетевой фармакологии и проверке метаболомики.

Аннотация

Гиперлипидемия стала ведущим фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и повреждения печени во всем мире. Fructus Phyllanthi (FP) является эффективным препаратом против гиперлипидемии в традиционной китайской медицине (ТКМ) и теориях индийской медицины, однако потенциальный механизм требует дальнейшего изучения. Настоящее исследование направлено на выявление механизма ФП против гиперлипидемии на основе комплексной стратегии, сочетающей прогнозирование сетевой фармакологии с валидацией метаболомики. Модель мышей, индуцированная диетой с высоким содержанием жиров (HFD), была создана путем оценки уровней липидов в плазме, включая общий холестерин (TC), триглицериды (TG), холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL-C) и холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C). Сетевая фармакология была применена для выяснения активных ингредиентов FP и потенциальных мишеней против гиперлипидемии. Метаболомика плазмы и печени была выполнена для выявления дифференциальных метаболитов и соответствующих им путей среди нормальной группы, модельной группы и группы вмешательства. Взаимосвязь между сетевой фармакологией и метаболомикой была дополнительно построена для получения всестороннего представления о процессе ФП против гиперлипидемии. Полученные ключевые белки-мишени были верифицированы методом молекулярного докинга. Эти результаты показали, что FP улучшил уровень липидов в плазме и повреждение печени при гиперлипидемии, вызванной HFD. Галловая кислота, кверцетин и бета-ситостерол в FP были продемонстрированы в качестве ключевых активных соединений. Было обнаружено, что в общей сложности 16 и шесть потенциальных дифференциальных метаболитов в плазме и печени, соответственно, участвуют в терапевтических эффектах FP против гиперлипидемии путем метаболомики. Кроме того, интеграционный анализ показал, что эффекты вмешательства были связаны с CYP1A1, AChE и MGAM, а также с корректировкой L-кинуренина, кортикостерона, ацетилхолина и рафинозы, в основном с участием пути метаболизма триптофана. Молекулярный докинг гарантирует, что вышеуказанные ингредиенты, действующие на белковые мишени, связанные с гиперлипидемией, играют ключевую роль в снижении уровня липидов. Таким образом, это исследование предоставило новую возможность для профилактики и лечения гиперлипидемии.

Введение

Гиперлипидемия является распространенным метаболическим заболеванием с серьезными последствиями для здоровья человека, а также основным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний1. В последнее время наблюдается тенденция к снижению возрастного заболевания, и молодые люди стали более восприимчивыми из-за длительного нерегулярного образа жизни и нездоровых привычек питания2. В клинике для лечения гиперлипидемии применялись различные препараты. Например, одним из наиболее часто используемых препаратов для пациентов с гиперлипидемией и связанными с ней атеросклеротическими расстройствами являются статины. Однако длительное применение статинов имеет побочные эффекты, которыми нельзя пренебрегать, которые приводят к плохому прогнозу, такие как непереносимость, резистентность к лечению и нежелательные явления 3,4. Эти недостатки стали дополнительными болями для пациентов с гиперлипидемией. Поэтому следует предложить новые методы лечения для стабильной гиполипидемической эффективности и меньшего количества побочных эффектов.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) широко используется для лечения заболеваний из-за ее хорошей эффективности и небольшого количества побочных эффектов5. Fructus Phyllanthi (FP), сухофрукты Phyllanthus emblica Linn. (широко известный как ягода амлы или индийский крыжовник), является известным лекарственным и пищевым материалом, гомологичным для традиционных китайских и индийских лекарств 6,7. Это лекарство использовалось для очищения от жары, охлаждения крови и улучшения пищеварения в соответствии с теориями ТКМ8. Современные фармакологические исследования показали, что FP богат биологически активными соединениями, такими как галловые кислоты, эллаговые кислоты и кверцетин9, которые отвечают за ряд многогранных биологических свойств, действуя как антиоксидант, противовоспалительное средство, средство защиты печени, антигиполипидемическое и так далее10. Недавние исследования также показали, что FP может эффективно регулировать липиды крови пациентов с гиперлипидемией. Например, Variya et al.11 продемонстрировали, что фруктовый сок FP и его основной химический ингредиент галловая кислота могут снижать уровень холестерина в плазме и уменьшать инфильтрацию масла в печени и аорте. Терапевтическая эффективность была связана с регуляцией FP в увеличении экспрессии рецептора-альфа, активируемого пролифератором пероксисом, и снижении липогенной активности печени. Тем не менее, основной механизм FP в улучшении гиперлипидемии должен быть дополнительно изучен, поскольку его биологически активные ингредиенты довольно обширны. Мы стремились изучить потенциальный механизм терапевтической эффективности ФП, который может быть полезен для дальнейшей разработки и использования этого лекарства.

В настоящее время сетевая фармакология рассматривается как целостная и эффективная методика изучения терапевтического механизма ТКМ. Вместо того, чтобы искать отдельные болезнетворные гены и лекарства, лечащие исключительно индивидуальную мишень, строится полная сеть лекарств-ингредиентов-генов-заболеваний, чтобы найти многоцелевой механизм многокомпонентного лекарственного средства в отношении их комплексного лечения12. Этот метод особенно подходит для ТКМ, так как их химический состав огромен. К сожалению, сетевая фармакология может быть использована только для прогнозирования целей, на которые влияют химические ингредиенты в теории. Эндогенные метаболиты в модели заболевания следует наблюдать, чтобы подтвердить эффективность сетевой фармакологии. Метод метаболомики, появившийся с развитием системной биологии, является важным инструментом мониторинга изменений эндогенных метаболитов13. Изменения в метаболитах отражают устойчивые изменения состояния хозяина, что также является важным показателем для изучения внутреннего механизма. Некоторые исследователи успешно интегрировали сетевую фармакологию и метаболомику для изучения механизма взаимодействия между лекарствами и заболеваниями14,15.

В этой статье исследуются механистические основы ФП против гиперлипидемии путем интеграции методов сетевой фармакологии и метаболомики. Сетевая фармакология была применена для анализа взаимосвязи между основными активными ингредиентами в FP и молекулярными мишенями для гиперлипидемии. Впоследствии была проведена метаболомика для наблюдения изменения эндогенных метаболитов на животной модели, что может объяснить действие лекарства на метаболическом уровне. По сравнению с применением только сетевой фармакологии или метабономики, этот интегрированный анализ обеспечил более конкретный и всеобъемлющий механизм исследования. Кроме того, стратегия молекулярного докинга использовалась для анализа взаимодействия между активными ингредиентами и ключевыми белками. В целом, этот комплексный подход может компенсировать отсутствие экспериментальных данных по сетевой фармакологии и отсутствие эндогенного механизма для метода метаболомики и может быть использован для анализа терапевтического механизма натуральной медицины. Основная схематическая блок-схема протокола показана на рисунке 1.

протокол

Все процедуры, связанные с обращением с животными, проводились в соответствии с Руководством Университета традиционной китайской медицины Чэнду по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены Комитетом по институциональной этике Университета традиционной китайской медицины Чэнду (протокол No 2020-36). Для настоящего исследования использовали самцов мышей C57BL/6 (20 ± 2 г). Мыши были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Прогнозирование на основе сетевой фармакологии

ПРИМЕЧАНИЕ: Сетевая фармакология используется для прогнозирования активных ингредиентов и их ключевых мишеней FP против гиперлипидемии.

  1. Выбор активных ингредиентов и ключевых мишеней
    1. Выполните поиск по ключевому слову «Phyllanthi Fructus» в базе данных фармакологии системы традиционной китайской медицины (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php), чтобы получить список потенциальных активных ингредиентов и мишеней FP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно в качестве активных ингредиентов включаются только ингредиенты с пероральной биодоступностью (OB) ≥30% и лекарственными (DL) значениями ≥0,18 в базе данных.
    2. Выполните поиск по ключевому слову «гиперлипидемия» в базе данных GeneCards (https://www.genecards.org/), онлайн-базе данных менделевского наследования у человека (OMIM; https://omim.org/) и базе данных терапевтических мишеней (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/), чтобы получить соответствующие мишени-кандидаты на гиперлипидемию. Загрузите электронные таблицы с целевыми показателями заболеваний. Удалите повторяющиеся мишени, чтобы получить список мишеней гиперлипидемии.
    3. Скопируйте эти списки из шагов 1.1.1 и 1.1.2 в новую электронную таблицу. Используйте функцию «Данные - Идентификация дубликатов» на панели инструментов, чтобы получить цели пересечения. Импортируйте список целевых пересечений в UniProtKB (http://www.uniprot.org/) для стандартизации названий генов и белков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти мишени связаны как с FP, так и с гиперлипидемией. Таким образом, предсказывайте эти перекрестные мишени как мишени FP против гиперлипидемии.
  2. Построение сети белково-белкового взаимодействия
    1. Откройте базу данных STRING (https://string-db.org/) 11.5. Вставьте список пересечений целей FP против гиперлипидемии в диалоговом окне «Список имен». Выберите Homo sapiens в разделе «Организмы» и нажмите на кнопку ПОИСК > ПРОДОЛЖИТЬ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Люди и мыши имеют очень похожие гены. Поэтому дальнейшая экспериментальная проверка проводится на мышах.
    2. Когда результаты будут доступны, поставьте галочку напротив скрытия отключенных узлов в сети в «Дополнительных настройках». Установите наивысшую достоверность (0,900) в «минимально необходимой оценке взаимодействия», затем нажмите кнопку ОБНОВИТЬ .
    3. Нажмите « Экспорт » в строке заголовка и загрузите короткий табличный текст сети белково-белкового взаимодействия (PPI) в формате PNG и TSV.
  3. Создание целевой сети по лекарственным компонентам и болезням
    1. Откройте Cytoscape 3.9.1 (см. Таблицу материалов). Импортируйте файл формата TSV шага 1.2.3. Оптимизируйте цвет, шрифт и боковые стороны сетевых узлов с помощью панели стилей на панели управления.
    2. Используйте функцию «Анализ сети» для анализа топологии сети. Получите гены-концентраторы с помощью CytoHubba в Cytoscape. Создайте сеть лекарств-ингредиентов-мишеней-болезней.
  4. Анализ обогащения GO и KEGG
    1. Откройте ресурсы по биоинформатике DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Нажмите «Начать анализ» и вставьте целевой список в левое диалоговое окно. Выберите OFFICIAL GENE SYMBOL в разделе «Select Identifier». Выберите Homo sapiens в разделе «Выбрать виды». Отметьте список генов в «Типе списка». Нажмите « Отправить список».
    2. Когда результаты будут доступны, нажмите « Проанализировать список генов» с помощью одного из инструментов DAVID. Отметьте GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT в разделе «Онтология генов» для анализа обогащения функций GO. Отметьте KEGG_Pathway в разделе «Пути» для анализа обогащения пути KEGG.
    3. Нажмите на функциональную диаграмму аннотаций , чтобы отобразить результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите порог статистической значимости анализа обогащения на уровне p < 0,05.

2. Экспериментальный дизайн

  1. Препарат водного экстракта FP
    ПРИМЕЧАНИЕ: FP обрабатывается в лаборатории профессора Лины Ся в Университете Чэнду TCM8.
    1. Замочите высушенный порошок FP (90 г) в 1 л чистой воды в чистой мерной колбе объемом 2 л. Используйте ультразвуковую обработку (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц), чтобы раствориться в течение 30 минут. Процеживают раствор для получения экстракта двухслойной стерильной медицинской марлей размером 1 мм х 1 мм. Повторите вышеописанную операцию три раза, чтобы обеспечить полное растворение ФП.
    2. Используйте метод ротационного выпаривания для дальнейшей концентрации. Установите скорость вращения 50 об/мин при температуре 60 °C в течение 4 ч. Сконцентрируйте водный экстракт до 100 мл.
    3. Разделите сырой экстракт FP (0,9 г / мл) равномерно на две части (50 мл). Одна часть используется в качестве жидкости для высоких доз FP (0,9 г / мл). Добавьте 50 мл чистой воды в другую часть и рассматривайте ее как жидкость с низкой дозой FP (0,45 г / мл). Для введения используйте водные растворы с высокими и низкими дозами ФП. Храните жидкость при температуре -20 °C до использования.
  2. Подготовка животных
    1. Содержание 50 мышей-самцов C57BL/6 (20 ± 2 г) в хорошо проветриваемом помещении при комнатной температуре, с 12-часовым циклом свет-темнота и свободным доступом к пище и чистой воде.
    2. Случайным образом распределите мышей на две группы: кормите 10 мышей обычной диетой и 40 мышей диетой с высоким содержанием жиров (см. Таблицу материалов), чтобы вызвать гиперлипидемию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После кормления в течение 8 недель мышей обследовали для дальнейшего медикаментозного вмешательства.
    3. На 8-й неделе изымают около 200 мкл крови с каждой орбиты мыши. Центрифугируют кровь в течение 10 мин при 5,733 x g при 4 °C для получения образцов плазмы. Определите уровни ТС и ТГ с помощью коммерчески доступных наборов для анализа (см. Таблицу материалов).
    4. Выберите шесть мышей с наиболее нормальным уровнем липидов в качестве контрольной группы без лечения (NC). Выберите 24 мыши со значительно более высоким уровнем липидов в качестве группы диеты с высоким содержанием жиров и случайным образом разделите их на четыре группы: группа диеты с высоким содержанием жиров (HFD), группа с низкими дозами FP (FP_L), группа с высокими дозами FP (FP_H) и группа положительного контроля (PC).
    5. Проводить промывание желудка в группах FP_L и FP_H двумя дозами ФП (низкая доза 4,5 г / кг и высокая доза 9 г / кг) соответственно; орошение желудка в группе ПК таблетками симвастатина (5 мг/кг; см. Таблицу материалов); и промывание желудка группам NC и HFD одинаковым объемом физиологического раствора один раз в сутки в течение 4 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании для лечения использовались водные растворы FP и симвастатина.
    6. На 12-й неделе, после анестезии 1% пентобарбиталом натрия (30 мг/кг), жертвуют мышами всех групп. Соберите ~ 400 мкл образцов крови из орбитальной вены каждой мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулируйте пальцы ног и подошвы мышей пинцетом. Если реакции нет, это доказывает адекватную анестезию.
    7. Центрифугируют кровь в течение 10 мин при 5,733 x g при 4 ° C для получения образцов плазмы и определения уровней TC, TG, LDLP-C и HDL-C с помощью коммерчески доступных наборов для анализа (см. Таблицу материалов). Получают образцы тканейпечени 16 и подвергают их гистопатологическому анализу. Используйте оставшиеся образцы плазмы и печени для анализа метаболомики (шаг 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы хранятся при температуре -80 °C до использования.
  3. Гистопатологическое исследование печени
    1. Фиксируют свежие ткани печени 4% раствором параформальдегида более 24 ч. Извлеките ткань из фиксатора и разгладьте ткани-мишени скальпелем. Поместите салфетку и соответствующую этикетку в дегидратор.
    2. Обезвоживание в градиенте этанола: 75% спирт в течение 4 ч, 85% спирт в течение 2 ч, 90% спирт в течение 2 ч, 95% спирт в течение 1 ч, абсолютный этанол в течение 1 ч, ксилол в течение 30 мин. Поместите тканевую кассету в тканевую форму в парафиновом воске на три стирки, по 30 мин каждая16.
    3. Поместите пропитанные воском салфетки в тканевую закладку (см. Таблицу материалов). Прежде чем воск застынет, извлеките салфетки из дегидратора, поместите их во встроенную коробку и прикрепите соответствующую этикетку.
    4. Охладите восковые блоки на морозильном столе с температурой -20 °C, извлеките их из встроенной рамы и обрежьте восковой блок.
    5. Разрежьте обрезанные восковые блоки на участки толщиной 3 мкм с помощью микротома (см. Таблицу материалов). Опустите срезы в воду с температурой 40 °C, снимите их с горок и запекайте в духовке при температуре 60 °C. После запекания водой и сухим воском выньте его и держите при комнатной температуре.
    6. Последовательно помещают срезы в ксилол I на 10 мин, ксилол II на 10 мин, ксилол III на 10 мин, абсолютный этанол I на 5 мин, абсолютный этанол II на 5 мин, 75% спирт на 5 мин и промывают в воде16.
    7. Окрасьте срезы раствором гематоксилина для окрашивания в течение 4 мин, 1% раствором солянокислого спирта (75% спиртом) для дифференциации, 1% раствором аммиачной воды обратно синего цвета и промойте их водой.
    8. Испачкайте срезы раствором для окрашивания эозином в течение 2 минут и промойте их водой.
    9. Наблюдайте за срезами с помощью оптического микроскопа с увеличением 200х и 400х.
  4. Жидкостная хромато-масс-спектрометрия (LC-MS) анализ
    1. Идентификация ингредиентов FP
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проводится с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с гибридной квадрупольной масс-спектрометрией высокого разрешения (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; см. Таблицу материалов).
      1. Точно отмерьте 1 г лиофилизированного порошка FP и поместите его в чистую мерную колбу объемом 50 мл.
      2. Добавьте 25 мл 70% метанола в мерную колбу и точно взвесьте. Используйте ультразвуковую обработку (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц) в течение 30 минут, чтобы помочь растворению. Снова точно взвесьте, чтобы точно определить потери после растворения, и используйте 70% метанола, чтобы восполнить потери.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не измеряйте объем, так как масштаб мерной колбы неточен, особенно после водяной бани 4 °C.
      3. Взбейте, чтобы полностью перемешать. Для фильтрации используйте микропористую мембрану размером 0,22 мкм.
    2. Подготовка образцов плазмы
      1. Точно добавьте 100 мкл плазмы (этап 2.2.7) в двойной объем (200 мкл) ацетонитрила в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл и встряхните его вихрем вибратора в течение не менее 30 с. Выполните эту процедуру для всех образцов.
      2. Центрифугу всех образцов при 17 200 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите надосадочные жидкости после центрифугирования в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Высушите надосадочную жидкость под азотом. Восстановите 200 мкл экстракционного растворителя (ацетонитрил: вода = 4:1 [об./об.]).
      3. Встряхните восстановленный раствор в течение не менее 30 с и используйте ультразвуковую обработку в течение 10 мин (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц). Центрифуга при 17 200 x g в течение 10 мин при 4 °C.
      4. Отфильтруйте надосадочные жидкости с помощью фильтрующих мембран 0,22 мкм и держите их при температуре 4 °C для анализа.
    3. Подготовка образцов печени
      1. Гомогенизируют 90 мг ткани печени (стадия 2.2.7) в течение 1 мин в ледяной метанольной воде (1:1, об./об., 1 мл) и центрифугируют их при 21 500 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перелейте надосадочную жидкость в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Выполните эту процедуру для всех образцов.
      2. Снова извлеките осадки, следуя той же процедуре, и объедините надосадочные жидкости в новые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Высушите надосадочную жидкость под азотом. Восстановите 300 мкл экстракционного растворителя (метанол: вода = 4:1 [об./об.]).
      3. Встряхните восстановленный раствор в течение не менее 30 с и используйте ультразвуковую обработку в течение 10 мин (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц). Центрифуга при 17 200 x g в течение 15 мин при 4 °C.
      4. Отфильтруйте надосадочные жидкости с помощью фильтрующих мембран 0,22 мкм и держите их при температуре 4 °C для анализа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Объединенные образцы контроля качества (КК) были подготовлены путем смешивания 10 мкл аликвот из каждого образца плазмы и печени (один на шесть образцов).
    4. Параметры анализа LC-MS
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подвижная фаза состоит из 0,1% муравьиной кислоты (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В). Перелейте эти растворители в чистую стеклянную бутылку и соедините их с системой LC-MS.
      1. Установите градиентные программы образцов плазмы в «входном файле» системы LC-MS следующим образом: 1% B (0-1,5 мин), 1%-60% B (1,5-13,0 мин), 60%-99% B (13,0-20,0 мин), поддерживать на уровне 99% B (20,0-25,0 мин), 99%-1% B (25,0-25,1 мин) и поддерживать на уровне 1% B до 27 мин.
      2. Установите условия автоподатчика образцов плазмы в «входном файле» системы LC-MS следующим образом: объем впрыска, 2 мкл; и расход 0,3 мл/мин для каждого анализа.
      3. Установите градиентную программу образцов печени во «входном файле» системы LC-MS следующим образом: 1% B (0-1 мин), 1%-53% B (1-15 мин), 53%-70% B (15-30 мин), 70%-90% B (30-32 мин), 90%-95% B (32-40 мин), 95%-1% B (40-42 мин) и поддерживайте на уровне 1% B до 45 мин.
      4. Установите условия автоподатчика образцов печени во «входном файле» системы LC-MS следующим образом: объем инъекции, 5 мкл; и расход 0,3 мл/мин для каждого анализа.
      5. Установите условия обнаружения МС образцов плазмы и печени в «файле настройки MS» системы LC-MS. Выполните сбор данных MS, используя как положительный, так и отрицательный режимы ионизации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры ионизации нагретого электрораспыления следующие: напряжение распыления: 3,5 кВ для положительной ионизации и 3,8 кВ для отрицательной ионизации; Расход газа в оболочке: 55 арб; Расход вспомогательного газа: 15 АРБ; температура нагревателя зонда: 300 °C; и капиллярная температура: 350 °C.
      6. Импортируйте собранные необработанные данные в программное обеспечение Compound Discoverer и установите шаблон метода, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).

3. Метаболомная валидация

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные метаболомного профилирования метаболитов плазмы и печени импортируются в программное обеспечение Compound Discoverer для выполнения экстракции метаболических признаков с использованием алгоритма экстракции молекулярных признаков. Установите параметры следующим образом: отклонение массы, 5 х 10-6; массовый диапазон, 100-1 500; пороговое значение отношения сигнал/шум (SNR), 3; и отклонение времени удержания - 0,05. Оцените стабильность и повторяемость метаболомики по относительному стандартному отклонению (RSD) областей пика КК.

  1. Используйте программное обеспечение SIMCA-P (см. Таблицу материалов) для многомерного статистического анализа интегральных значений, полученных по результатам LC-MS. Используйте ортогональный дискриминантный анализ частичных наименьших квадратов (OPLS-DA) для среднецентрированных данных и моделирования классов выборки.
  2. После теста OPLS-DA рассмотрите метаболиты с интегралом с переменной важностью в значениях проекции (VIP) >1 и p-значением <0,05 из t-критерия Стьюдента в качестве потенциальных дифференциальных метаболитов.
  3. Идентификация нарушенных метаболитов и метаболических путей с помощью открытых источников баз данных, включая Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) и MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Визуализируйте представления результатов с помощью MetaboAnalyst5.0 и платформы Wu Kong (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Молекулярный докинг

  1. Загрузите 3D-структуру выбранных ингредиентов FP из базы данных TCMSP соответственно. Найдите названия ингредиентов в поле поиска «Химическое название» и загрузите соответствующие файлы 3D-структур в формате mol2.
  2. Загрузите кристаллические структуры ключевых мишеней из базы данных AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Найдите имена целевых объектов в поле поиска и загрузите соответствующие файлы кристаллических структур в формате pdb.
  3. Импортируйте файлы ингредиентов и целевых структур в программное обеспечение AutoDockTools. Нажмите « Изменить» > «Удалить воду », чтобы удалить молекулы воды. Нажмите «Изменить > водорода» > «Добавить », чтобы добавить водород. Установите ингредиенты в качестве «лиганда» и выполните слепую стыковку, выбрав целые мишени в качестве «рецептора»17.
  4. Введите значение в поле за «центром» и «размером», чтобы скорректировать вновь разработанное пространство, что позволит полностью охватить лиганд и рецептор. Сохраните файлы лиганда и рецептора в формате pdbqt.
  5. Используйте AutoDock Vina для выполнения молекулярной стыковки. Задайте для панели «Рецептор» имя «receptor.pdbqt», а для панели «Лиганд» — имя «ligand.pdbqt». Получение оптимального места для связывания лиганда с рецептором. Запишите значение энергии связи в оптимальном положении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс стыковки был рассчитан с помощью генетического алгоритма14. Все параметры прогона стыковки были значениями по умолчанию. Стыковочные рамы будут автоматически ранжированы от самой высокой до самой низкой энергии связи.
  6. Импортируйте файлы стыковки в PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index), чтобы получить визуальную модель системы. Загрузите файлы модели в формате pse и импортируйте их в программное обеспечение PyMOL (см. Таблицу материалов) для построения дальнейшей визуализации.

5. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте статистическое программное обеспечение SPSS (см. Таблицу материалов) для анализа данных. Рассмотрим значение p < 0,05 как статистически значимое.

  1. Выразите значения как среднее значение ± стандартное отклонение (SD).
  2. Выполните одностороннюю ANOVA, за которой следует постфактум наименьшая значимая разница (LSD), Даннетта (в случае равной дисперсии) или T3 Даннетта (в случае неравной дисперсии), чтобы проверить статистическую значимость среди групп.

Результаты

Сетевая фармакология
В общей сложности 18 потенциальных ингредиентов в FP были проверены в соответствии с их фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами из базы данных и анализа LC-MS (общее количество ионных хроматограмм показано на дополнительном рисунке 1

Обсуждение

В последние годы уровень заболеваемости гиперлипидемией увеличивается, в основном из-за долгосрочных нездоровых привычек питания. ТКМ и ее химические ингредиенты обладают различной фармакологической активностью, которая была широко изучена в последние годы37,38

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Группой разработки продуктов и инноваций ТКМ «Сохранение здоровья и реабилитация» (2022C005) и Исследование трансграничной интеграции нового бизнеса «Сохранение здоровья и реабилитация +».

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

Ссылки

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены