La matriz de anestesia en serie para la investigación de alto rendimiento de agentes volátiles utilizando Drosophila melanogaster

Resumen

La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) es ampliamente utilizada para la investigación biológica y toxicológica. Para ampliar la utilidad de las moscas, desarrollamos un instrumento, el serial anesthesia array, que expone simultáneamente múltiples muestras de moscas a anestésicos generales volátiles (VGA), lo que permite investigar los efectos colaterales (tóxicos y protectores) de los VGA.

Resumen

Los anestésicos generales volátiles (VGA) se utilizan en todo el mundo en millones de personas de todas las edades y afecciones médicas. Altas concentraciones de VGAs (cientos de micromolares a milimolares bajos) son necesarias para lograr una supresión profunda y no fisiológica de la función cerebral presentándose como "anestesia" para el observador. No se conoce el espectro completo de los efectos colaterales desencadenados por concentraciones tan altas de agentes lipofílicos, pero se han observado interacciones con el sistema inmunoinflamatorio, aunque no se comprende su importancia biológica.

Para investigar los efectos biológicos de las VGA en animales, desarrollamos un sistema denominado matriz de anestesia en serie (SAA) para explotar las ventajas experimentales que ofrece la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). El SAA consta de ocho cámaras dispuestas en serie y conectadas a una entrada común. Algunas piezas están disponibles en el laboratorio, y otras se pueden fabricar o comprar fácilmente. Un vaporizador, que es necesario para la administración calibrada de VGAs, es el único componente fabricado comercialmente. Los VGA constituyen sólo un pequeño porcentaje de la atmósfera que fluye a través de la SAA durante la operación, ya que la mayor parte (típicamente más del 95%) es gas portador; El transportista predeterminado es el aéreo. Sin embargo, el oxígeno y cualquier otro gas pueden ser investigados.

La principal ventaja de la SAA sobre los sistemas anteriores es que permite la exposición simultánea de múltiples cohortes de moscas a dosis exactamente titulables de VGA. Se alcanzan concentraciones idénticas de VGA en cuestión de minutos en todas las cámaras, proporcionando así condiciones experimentales indistinguibles. Cada cámara puede contener desde una sola mosca hasta cientos de moscas. Por ejemplo, el SAA puede examinar simultáneamente ocho genotipos diferentes o cuatro genotipos con diferentes variables biológicas (por ejemplo, macho vs. hembra, viejo vs. joven). Hemos utilizado el SAA para investigar la farmacodinámica de las VGA y sus interacciones farmacogenéticas en dos modelos experimentales de moscas asociadas con mutantes mitocondriales de neuroinflamación y lesión cerebral traumática (LCT).

Introducción

La existencia de efectos anestésicos colaterales (es decir, efectos que no son inmediatamente observables pero que pueden tener consecuencias conductuales retardadas) es generalmente aceptada, pero la comprensión de sus mecanismos y factores de riesgo sigue siendo rudimentaria ^1,2. Su manifestación tardía y sutileza limitan el número de variables potencialmente importantes que pueden investigarse en modelos de mamíferos dentro de plazos razonables y a un costo aceptable. La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) ofrece ventajas únicas en el contexto de la enfermedad neurodegenerativa³ y para el cribado toxicológico⁴ que, hasta la fecha, no se han aplicado al estudio de los efectos colaterales anestésicos.

Desarrollamos el serial anesthesia array (SAA) para facilitar el uso de moscas de la fruta en el estudio de la farmacodinámica anestésica y la farmacogenética. Una ventaja clave del SAA es la exposición simultánea a condiciones experimentales idénticas de múltiples cohortes. Cuando se combina con la flexibilidad experimental de las moscas de la fruta, el alto rendimiento de la SAA permite la exploración de variables biológicas y ambientales en una escala imposible en modelos de mamíferos.

En principio, el SAA es simplemente una serie de ubicaciones de anestesia conectadas (cámaras hechas de viales de 50 ml) a través de las cuales un gas portador suministra agentes volátiles. La primera cámara del sistema contiene agua destilada a través de la cual se humidifica el gas portador (las moscas son sensibles a la deshidratación), y termina con un indicador de flujo simple que indica el flujo de gas a través del sistema. Las redes finas colocadas en las aberturas del tubo de conexión separan las cámaras para evitar la migración de moscas entre las cámaras. El número de ubicaciones "en serie" está limitado por la resistencia al flujo de gas no presurizado (tubería, redes).

Caracterizamos la cinética de este prototipo de SAA en una publicación anterior⁵. Aunque las propiedades farmacocinéticas exactas variarán entre las SAA, los fundamentos relevantes que se han probado experimentalmente son los siguientes: (i) un flujo inicial de 1.5-2 L / min equilibra todas las cámaras (volumen total de ±550 ml) con la concentración deseada de anestésico dentro de 2 min; ii) la concentración de vapor anestésico suministrado a las cámaras no cambia apreciablemente entre la primera y la última ubicación porque la cantidad de anestésico contenida en el volumen de gas en una cámara individual (50 ml) supera con creces la cantidad absorbida por cualquier número de moscas; y (iii) una vez que las cámaras se han equilibrado, el flujo de gas portador puede reducirse (50-100 ml / min o menos) para evitar el desperdicio y la contaminación del medio ambiente (los anestésicos volátiles tienen propiedades de gases de efecto invernadero). El flujo mínimo necesario para mantener una concentración de vapor en estado estable depende principalmente de la fuga de la SAA, ya que la absorción de vapor por las moscas es insignificante. Bajo estas condiciones estándar (2% de isoflurano y 1,5 L/min de flujo de gas portador), las moscas son anestesiadas (es decir, inmóviles) en todas las posiciones de la matriz dentro de 3-4 min, con diferencias imperceptibles entre posiciones. Los VGA se pueden administrar durante minutos u horas, y nuestros paradigmas de exposición típicos están en el rango de 15 min a 2 h. Para enjuagar el sistema, el vaporizador se apaga y el flujo se mantiene para intercambiar aproximadamente 10 veces los volúmenes de la matriz (1,5 L/min durante 5 min). La velocidad de eliminación del anestésico variará con la velocidad de flujo establecida.

Los agentes anestésicos volátiles interactúan con numerosos objetivos aún no identificados, incluido el sistema inmunoinflamatorio⁶. La contribución de los objetivos moleculares individuales a los resultados primarios versus colaterales (el "estado anestésico" frente a los "efectos secundarios" a largo y corto plazo) es poco conocida. Por lo tanto, un sistema de moscas sensible y de alto rendimiento es valioso para informar experimentos en animales superiores, a pesar de las diferencias obvias entre moscas y mamíferos⁷. Algunas diferencias pueden, de hecho, ser ventajosas; Por ejemplo, el sistema inmunológico de la mosca difiere del de los animales superiores en que carece del brazo adaptativo de la respuesta⁸. Si bien esto puede parecer una limitación para comprender la enfermedad en humanos, ofrece una oportunidad única para estudiar la interacción de VGA con la respuesta inmune-inflamatoria innata aislada de la respuesta adaptativa⁹. Esto permite estudiar los efectos farmacológicos de VGA sobre la inflamación y su modulación por los variados antecedentes genéticos presentes en una población.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en el protocolo.

1. Construcción del AEA

1. Haga el marco cortando madera y ensamblando el marco utilizando las dimensiones de la Figura 1A.
2. Modifique las tapas de los tubos cónicos de 50 ml.
   1. Perfore dos agujeros en cada tapa con una broca de 9/32. Lija los agujeros para limpiar el plástico irregular. Lije la parte superior de la tapa para endurecer la superficie (esto ayuda con la adhesión del pegamento).
   2. Corte 5 ml de pipetas serológicas a medida (3 pulgadas para el flujo de entrada y 1,5 pulgadas para el flujo de salida) marcando el plástico y luego rompiéndolo limpio en la línea marcada. Lijar los extremos de las pipetas cortadas/rotas.
   3. Pegue la red a los tubos (permita un tiempo de secado adecuado para el adhesivo). Corte la red al tamaño del tubo después de que el adhesivo se seque.
   4. Inserte los tubos en los orificios de las tapas cónicas con ambos tubos que se extienden (3/4 in) por encima de la tapa; asegúrese de que el tubo de entrada se extienda más tiempo en el tubo que el flujo de salida (Figura 1B).
   5. Aplique pegamento en la parte superior de las tapas alrededor de los tubos para asegurar las piezas juntas (permita un tiempo de secado adecuado para el adhesivo antes de continuar).
3. Fije las tapas al marco y dirija el tubo (Figura 1C).
   1. Fije los amarres de cables adhesivos al marco (3,25 pulgadas de distancia, de centro a centro).
   2. Fije las tapas al marco con bridas; Corta los extremos de la etiqueta de corbata de cremallera.
   3. Corte y conecte longitudes (9 pulgadas) del tubo Tygon a los tubos de entrada/salida de cada tapa modificada (Figura 1D). Comenzando en el extremo aguas arriba, conéctelo primero a la entrada y luego conecte la tubería desde la salida a la entrada de la siguiente posición.
   4. Agregue un indicador de flujo a la "entrada" más descendente (posición 10, Figura 1E).
   5. Coloque un tubo cónico de 50 ml en la primera posición y llénelo con agua justo debajo del tubo de entrada (Figura 1F).
4. Prepara la interfaz para el vaporizador. Retire los émbolos, corte las muescas de dos jeringas dispensadoras de 10 ml (1/2 pulgada de profundidad x 1/4 de ancho, Figura 1G) e insértelas en la entrada y salida del vaporizador con las muescas orientadas directamente hacia la parte frontal del vaporizador para alinearlas con los orificios (Figura 1H). Opcional: Pegue las jeringas modificadas en su lugar. Si es asequible, use un colector comercial (consulte la Tabla de materiales para una opción).
5. Conecte todo el sistema. Utilice el tubo Tygon para unir los componentes en el siguiente orden: tanque de gas portador con regulador > medidor de flujo específico de gas > vaporizador > SAA (Figura 1C).
6. Llene las posiciones vacías en la matriz con tubos cónicos vacíos de 50 ml. Encienda el tanque de gasolina, abra el medidor de flujo a ~ 2 L / min y encienda el vaporizador al 0%. Confirme el flujo de gas a través del sistema comprobando el caudalímetro aguas arriba del vaporizador y el indicador de flujo aguas abajo de la última cámara de la SAA para el flujo. Alternativamente, inserte el extremo del tubo aguas abajo en el agua y busque burbujas.
   NOTA: Como el sistema no está presurizado, una columna de agua superior a un par de centímetros detendrá el flujo. Si no hay flujo en el extremo aguas abajo de la matriz, verifique lo siguiente: el vaporizador debe estar encendido para permitir el flujo; verifique que el regulador del tanque y los medidores de flujo permitan el flujo; compruebe las posiciones de la matriz para asegurarse de que los tubos estén bien atornillados; y compruebe si hay fugas alrededor del adhesivo en las tapas modificadas.

Figura 1: Construcción de la SAA. (A) Esquema, con medidas, del marco de madera que soporta la SAA. (B) Sección transversal esquematizada, con medidas, de una tapa modificada con tubos de entrada y salida hechos de pipetas serológicas de 5 ml. (C) SAA ensamblada (reproducida de Olufs et ^al.5) (D) Detalles de una tapa cónica modificada de 50 ml que muestra tubos de entrada y salida. (E) Flujo descendente (posición 10) con el indicador de flujo. (F) Tubo de llenado de agua aguas arriba (posición 1) para humidificar el gas portador. La flecha roja indica el nivel del agua. (G) Jeringa dispensadora modificada de 10 ml para el colector improvisado. El círculo rojo resalta la muesca recortada ubicada entre las marcas de 8 ml y 10 ml (o 1/2 pulgada x 1/4 pulgada). (H) Vista trasera del vaporizador Tec7 que muestra la inserción y orientación de las jeringas modificadas. Solo hay una jeringa en su lugar en esta vista para mostrar, a la izquierda, el orificio (flecha roja) que debe alinearse con la muesca de la jeringa modificada. Nota: La desalineación de esta muesca de corte y la abertura de salida interrumpirá la administración de anestesia. Esta parte es un punto débil potencial en este sistema hecho a medida. Si hay fondos disponibles, se debe utilizar un colector comercial. Abreviatura: SAA = matriz de anestesia en serie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Antes de la exposición anestésica

1. Veinticuatro horas o más antes de la exposición al anestésico, clasifique las cohortes de moscas según sea necesario para el experimento utilizando el método preferido (por ejemplo, CO₂ o éter).

3. Funcionamiento del AEA

1. Transfiera las moscas de los viales de alimentos a tubos cónicos vacíos de 50 ml (sin_CO2).
   1. Cuente y registre cualquier mosca muerta antes de la exposición.
2. Destapar y atornillar 50 ml de tubos cónicos con moscas en la SAA.
3. Encienda el gas portador y configúrelo en el caudal deseado.
   NOTA: Normalmente usamos 1-2 L/min.
4. Ajuste el vaporizador anestésico a la concentración deseada.
   NOTA: Normalmente usamos 2% para isoflurano y 3.5% para sevoflurano, que son dosis equipotentes en mamíferos¹⁰.
5. Exponer las moscas durante el tiempo deseado (min: 15 min).
   NOTA: Se recomienda un tiempo de exposición mínimo de 15 min para evitar la posible variabilidad en el equilibrio entre las posiciones de la AEA. En este sistema, los anestésicos tardan 2-3 minutos en equilibrarse en todas las posiciones.
6. Al final de la exposición, enjuague el sistema con flujo de gas fresco (vaporizador ajustado al 0%) a 1,5 L/min durante 5 minutos, lo que corresponde a aproximadamente 10 veces los volúmenes del volumen total de SAA.

4. Lista de verificación antes de comenzar un experimento

1. Abra completamente el regulador de alta presión (en la parte superior del tanque de aire) y luego ciérrelo media vuelta para garantizar el flujo de gas portador.
2. Siga los tubos de cada línea hasta i) caudalímetros y ii) vaporizador (asegúrese de que el flujo de entrada / salida esté conectado correctamente), y iii) verifique el nivel de anestesia en los vaporizadores.
3. Después de cargar las cámaras con sujetos, compruebe que el aire/gas fluye con la prueba de burbujas o el indicador de flujo.
   NOTA: Algunos vaporizadores no permiten el flujo de aire cuando el dial está en la posición de apagado.
4. Cuando el gas fluya, confirme que tanto el caudalímetro como el indicador de caudal aguas abajo indican caudal.
5. Al final del experimento, permita 4-5 minutos de flujo de aire para lavar el anestésico.

Resultados

Un enlace de video de SAA se proporciona aquí: Perouansky Research Methods - Department of Anesthesiology - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Nuestro laboratorio ha utilizado el SAA para (i) estudiar el efecto del genotipo en la sensibilidad conductual a los anestésicos⁵; (ii) detectar mutantes mitocondriales para detectar los efectos colaterales de los anestésicos¹¹; y (iii) investigar la farmacodinámica del isoflurano y el sevoflurano sobre los resultados en la lesión cerebral traumática (LCT)12,13,14,15,16,17. Los resultados publicados demuestran claramente que los antecedentes genéticos influyen en la farmacodinámica de las VGA utilizadas clínicamente tanto con respecto al fenotipo convencional de la anestesia como a los efectos colaterales de la toxicidad anestésica, así como a la protección tisular 5,11,13,14,15.

Ejemplo representativo 1 (Figura 2):Deriva genética en la resiliencia a la toxicidad del isoflurano detectada por condiciones experimentales fiablemente reproducibles
El descubrimiento de un cambio cuantitativo gradual en la mortalidad inducida por VGA entre moscas ND23⁶⁰¹¹⁴ cultivadas por separado es un ejemplo de la utilidad de comparaciones confiables de la farmacodinámica anestésica entre grupos experimentales que utilizan la SAA. ND23 es un gen que codifica una subunidad en el núcleo del Complejo I del mETC (análogo a Ndufs8 en mamíferos )¹⁸. Las mutaciones en esta subunidad son una causa del síndrome de Leigh, una enfermedad mitocondrial letal. Observamos un debilitamiento gradual del fenotipo de mortalidad inducida por isoflurano a lo largo del tiempo en varias cepas homocigotas ND23⁶⁰¹¹⁴ cultivadas simultáneamente en condiciones estándar de laboratorio (es decir, sin exposición a VGA). Esta adaptación evolutiva a la toxicidad del isoflurano se produjo en ausencia de cualquier exposición a VGAs y es probablemente un efecto colateral de la "supervivencia del más apto" dentro de las poblaciones mutantes. Este cambio gradual en la sensibilidad al isoflurano habría permanecido sin nuestra confianza en que las condiciones experimentales eran idénticas en todos los ensayos y a lo largo del tiempo. Concluimos que la selección favorece los modificadores de los efectos de ND23⁶⁰¹¹⁴, con una coincidencia de una mayor resistencia a la toxicidad del isoflurano. Como la inflamación en el sistema nervioso central juega un papel importante en la patogénesis del síndrome de Leigh, la evolución observada de la resistencia puede deberse a cambios adaptativos en la respuesta inmunoinflamatoria innata, siendo la resistencia a la toxicidad del isoflurano un subproducto accidental.

Figura 2: Variación en la mortalidad inducida por toxicidad por isoflurano como resultado de la presión evolutiva en moscas ND23⁶⁰¹¹⁴. Siete líneas (A-G) aisladas de una sola población a través de apareamientos de un solo par, expandidas y probadas para la mortalidad de 24 h (PM₂₄) después de una exposición de 2 h a isoflurano al 2% (a los 10-13 días de edad) muestran variabilidad en el fenotipo que surge de una sola población. Los datos se muestran como diagramas de caja y bigotes. Los cuadros representan el segundo y tercer cuartil de los datos, con los bigotes extendiéndose a los puntos de datos mínimos y máximos. La media y la mediana se indican con "+" y líneas horizontales, respectivamente. El porcentaje de mortalidad de las réplicas individuales (N) se muestra como círculos. N = 3-4 viales de 20-50 moscas/vial. Valor p para un ANOVA unidireccional ordinario; p = 0,012 indica una diferencia significativa entre las medias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ejemplo representativo 2 (Figura 3): Ilustración de una aplicación de alto rendimiento de la SAA para revelar los efectos genéticos de fondo en la farmacodinámica del isoflurano
Como ejemplo del alto rendimiento del sistema, la Figura 3 ilustra los efectos de exposiciones idénticas al isoflurano (15 min de isoflurano al 2%) antes de la lesión cerebral traumática (LCT)16, un protocolo que prueba el preacondicionamiento anestésico (AP) en este modelo de mosca^13,15,19. La lectura es mortalidad 24 h después de la LCT corregida por desgaste natural (MI₂₄). En este modelo, todas las moscas recuperaron la movilidad (es decir, estaban vivas) dentro de los 30 minutos después de la LCT, y la mortalidad registrada en el MI₂₄ fue el resultado de una lesión cerebral secundaria (sBI). En las cuatro líneas de mosca, AP con isoflurano redujo el MI₂₄ en varios grados, lo que indica que la capacidad de respuesta a AP es un rasgo cuantitativo. Como la respuesta inflamatoria es un factor importante en la morbilidad por BIS, la PA puede implicar la modulación del sistema inmune²⁰.

Figura 3: Influencia de los antecedentes genéticos en la supresión de la mortalidad (MI₂₄) mediante preacondicionamiento con isoflurano. Las moscas de preacondicionamiento con 15 min de isoflurano al 2% (púrpura) redujeron el índice de mortalidad a las 24 h (MI₂₄) en las cepas w 1118 y ¹w¹¹¹⁸ (p < 0,0001 y p = 0,036, respectivamente). El IM 24 no fue significativamente menor en las líneas R (OR) y Canton S (CS) precondicionadas de Oregón (p = 0,16 y p = _0,27, respectivamente). Los datos se muestran como diagramas de caja y bigotes. Los cuadros representan el segundo y tercer cuartil de los datos, con los bigotes extendiéndose a los puntos de datos mínimos y máximos. La media y la mediana se indican con "+" y líneas horizontales, respectivamente. Los valores MI₂₄ de las réplicas individuales (N) se muestran como círculos. N = 15-33 viales de 30-40 moscas/vial para moscas tratadas con LCT. N = 2-15 viales de 30-40 moscas/vial para controles no tratados. Valores p de una prueba t de Student no pareada y de dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los pasos críticos en la construcción de la SAA incluyen garantizar accesorios ajustados para evitar fugas de la mezcla anestésica de gases. El SAA debe estar alojado en una campana extractora para evitar la contaminación del espacio del laboratorio. Todos los elementos, desde los cilindros de gas portador hasta el indicador de flujo aguas abajo de la SAA, deben verificarse como se describe en la lista de verificación.

Otros métodos de administración de VGAs a moscas son complicados de operar (el inebriómetro)21, tienen bajo rendimiento 22, no permiten la exposición simultánea de múltiples poblaciones 23, no permiten un control preciso de la concentración anestésica 21, o tienen una lectura difícil de traducir en términos clínicamente aceptados ²⁴.

La versión actual de la SAA se basa en un vaporizador comercial y, por lo tanto, los estudios toxicológicos se limitan a los anestésicos volátiles. Si se usa con otras sustancias volátiles, se podría usar un vaporizador "fuera de etiqueta" después de calibrar la salida. Alternativamente, se podría aplicar un método diferente de vaporización de las sustancias volátiles, lo que requeriría mediciones dedicadas para valorar las concentraciones del fármaco, como se describió anteriormente²⁵.

Aparte de los indicadores de flujo, no hay alarmas (es decir, si los tanques se vacían, el flujo a través del SAA se interrumpirá). Dependiendo de la intensidad del uso, la SAA puede necesitar limpieza, apriete y posiblemente el reemplazo del tubo Tygon. Hemos realizado "mantenimiento" en nuestro SAA original dos veces en 7 años de uso.

Este método para anestesiar moscas de la fruta permite el uso de la caja de herramientas genéticas disponible para los investigadores de Drosophila en un sistema de alto rendimiento. Múltiples cohortes de moscas de diferentes poblaciones (por ejemplo, genotipo, edad, sexo) pueden exponerse simultáneamente a concentraciones anestésicas idénticas y a la combinación deseada de gas portador (aire,_O2, N₂O, gases nobles) adecuada a la pregunta de investigación en cuestión.

Mostramos aquí que la SAA ha sido útil para revelar cambios inesperados en la resistencia a la toxicidad del isoflurano en la línea de mosca ND23⁶⁰¹¹⁴ y que las líneas de mosca de laboratorio estándar difieren en su capacidad de respuesta a AP. La identificación de estos hallazgos fue posible debido al estricto control de las condiciones experimentales y el alto rendimiento de la SAA.

La SAA se puede adaptar para estudiar los efectos de otros compuestos orgánicos volátiles (COV) en insectos (por ejemplo, abejas). Para COV con presiones de vapor cercanas a las de los anestésicos volátiles (isoflurano: 240 mmHg a 20 °C), se podrían usar vaporizadores convencionales, pero la salida tendría que ser calibrada. El vaporizador comercial para desflurano se calienta, lo que puede ofrecer flexibilidad adicional.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Serial Anesthesia Array:
5 mL Serological Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10C	Polystyrene, 5mL serological pipette
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	1495949A	Polypropylene, 50 mL
Cable Tie Mounting Pad	Grainger	6EEE6	1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H
Dispensing Syringe	Grainger	5FVE0	10 mL with Luer-Lock Connection
Fabric Mesh Netting			1 mm mesh
Flow Indicator	Grainger	8RH52	5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style
Tygon Tubing	Tygon	E-3603	ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16
Wood Frame			10 feet of 2 inch x 3/4 inch
Zip Tie			>5inch
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):
Dispensing Syringe	Grainger	5FVE0	10 mL with Luer-Lock Connection
Commercial Manifold and Vaporizers:
1/4 inch Equal Barbed Y Connector	Somni Scientific	BF-9000
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic)	Somni Scientific	BF-9004
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob	Somni Scientific	FP-4002
Flowmeter auxiliary mounting bracket	Somni Scientific	NonInvPart
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male	Somni Scientific	GF-11012
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included)	Somni Scientific	TT-17000
Tec 7 Isoflurane Vaporizer	GE Datex-Ohmeda	1175-9101-000	Agent-specific vaporizer (Isoflurane)
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer	GE Datex-Ohmeda	1175-9301-000	Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)