En este protocolo, se describen dos enfoques para hacer más asequible la prueba de compresión uniaxial de las vértebras lumbares de ratón. En primer lugar, se describe la conversión de una máquina dobladora de tres puntos en una máquina de ensayo de compresión. En segundo lugar, se adapta un método de incrustación para preparar la superficie de carga que utiliza cemento óseo para las vértebras lumbares de ratón.
Cada vez hay más conciencia de que el hueso cortical y el hueso esponjoso difieren en la regulación y respuesta a las terapias farmacéuticas, las terapias hormonales y otros tratamientos para la pérdida ósea relacionada con la edad. La flexión de tres puntos es un método común utilizado para evaluar la influencia de un tratamiento en la región de diáfisis media de los huesos largos, que es rica en hueso cortical. Las pruebas de compresión uniaxial de vértebras de ratón, aunque son capaces de evaluar huesos ricos en hueso esponjoso, se realizan con menos frecuencia debido a desafíos técnicos. Aún menos común es el emparejamiento de pruebas de flexión y compresión de tres puntos para determinar cómo un tratamiento puede influir en la región de diáfisis media de un hueso largo y un centro vertebral de manera similar o diferente. Aquí, describimos dos procedimientos para hacer que la prueba de compresión de las vértebras lumbares del ratón sea un método menos difícil de realizar en paralelo con la flexión de tres puntos: primero, un procedimiento para convertir una máquina de flexión de tres puntos en una máquina de prueba de compresión, y segundo, un método de inclusión para preparar una superficie de carga de vértebras lumbares del ratón.
Los cambios óseos relacionados con la edad son ampliamente reconocidos como problemáticos debido al mayor riesgo de fracturas óseas asociadas con estos cambios. Las fracturas óseas en humanos pueden provocar dolor crónico, movilidad reducida, discapacidad a largo plazo, un mayor riesgo de muerte y cargaseconómicas. Las terapias comunes investigadas para abordar los síntomas de los cambios óseos relacionados con la edad incluyen suplementos dietéticos, tratamientos hormonales y medicamentos 2,3,4,5,6,7,8,9. Las investigaciones iniciales de estos tratamientos para sujetos humanos se realizan comúnmente utilizando modelos de animales pequeños (por ejemplo, ratas y ratones de laboratorio), que poseen los dos tipos principales de huesos que se encuentran en el esqueletohumano. Los huesos largos apendiculares, como el húmero, el fémur y la tibia, son ricos en hueso cortical (es decir, compacto), mientras que las vértebras son ricas en hueso esponjoso (es decir, hueso tejido, esponjoso o trabecular)4. Cada vez se sabe más que los mecanismos de regulación ósea y las vías de señalización difieren entre el hueso cortical (p. ej., hueso largo, diáfisis media) y el hueso esponjoso (p. ej., centro vertebral)2. Debido a esto, las terapias pueden tener efectos diferenciales que son específicos del hueso o incluso específicos del sitio dentro del mismo hueso 2,3,4.
La aplicación de fuerza a un objeto (por ejemplo, un hueso) hace que el objeto sufra aceleración, deformación o ambas, dependiendo de las condiciones de contorno del objeto. Cuando el hueso está constreñido, una fuerza opuesta de igual magnitud resiste la aceleración del hueso y se produce una deformación. A medida que el hueso sufre deformación, se genera una resistencia interna llamada tensión, de la cual existen dos tipos básicos: Fuerza normal, en forma de tensión o compresión, y fuerza cortante10. A menudo, se genera una combinación de los tipos básicos de tensión, dependiendo del sistema de fuerza aplicado10. La resistencia de un material es su capacidad para soportar la tensión sin fallar. A medida que se aplican fuerzas cada vez mayores a un material, eventualmente sufre una deformación permanente, momento en el que se dice que ha pasado de un estado elástico (es decir, volverá a su forma original si se elimina la fuerza) a un estado plástico (es decir, no volverá a su forma original si se elimina la fuerza)11. El punto en el que se produce la transición de un estado elástico a un estado plástico se denomina punto de fluencia. A medida que se aplican fuerzas aún mayores al material más allá del límite elástico, sufre cada vez más microfracturas (es decir, daños) hasta que se produce la fractura total; En este punto, se dice que el material ha fallado11,12. La fractura de un hueso representa un fallo tanto a nivel estructural como tisular10. Por ejemplo, la rotura de un hueso vertebral se produce porque no solo fallan múltiples trabéculas a nivel estructural, sino que también hay una falla de elementos de la matriz extracelular como los cristales de colágeno e hidroxiapatita en una trabécula individual a nivel tisular.
Los eventos mecánicos que conducen a la falla de un material se pueden medir utilizando una variedad de métodos de prueba. La flexión de tres puntos es un método común para probar las propiedades mecánicas de los huesos largos del esqueleto apendicular. Este método es simple y reproducible, lo que lo convierte en el método preferido de pruebas biomecánicas para muchos investigadores13. Al bajar una viga de cruceta sobre la diáfisis media de un hueso largo que descansa sobre dos vigas de soporte inferiores, este método prueba específicamente las propiedades mecánicas de la región de la diáfisis media, que es un hueso cortical densamente organizado. A partir de curvas de carga-desplazamiento, se pueden determinar los efectos de la fuerza de tracción sobre la elasticidad, la tenacidad, la fuerza a la falla y la transición del comportamiento elástico al plástico de los materiales óseos, entre otras propiedades.
En el segundo tipo de hueso, denominado hueso trabecular, esponjoso, tejido o esponjoso, los elementos óseos se forman en una serie de varillas y vigas llamadas trabéculas, lo que da una apariencia "esponjosa". Los cuerpos vertebrales principales (es decir, el centro) son ricos en hueso esponjoso y a menudo son los sitios de fracturas óseas por compresión relacionadas con la edad en humanos14. Las vértebras lumbares (es decir, la parte baja de la espalda) son las vértebras más grandes, soportan la mayor parte del peso del cuerpo y son el sitio más común para las fracturas vertebrales15,16. La mejor manera de evaluar directamente las propiedades mecánicas de los cuerpos vertebrales es utilizando métodos de ensayo de compresión uniaxial, ya que la compresión axial es la carga de fuerza normal impuesta a las columnas vertebrales in vivo17. La compresión de los cuerpos vertebrales in vivo ocurre como resultado de las contracciones musculares y ligamentosas, la fuerza de la gravedad y las fuerzas de reacción del suelo18.
Las pruebas de compresión ex vivo de vértebras de animales pequeños pueden ser difíciles debido a su pequeño tamaño, forma irregular y fragilidad. La forma de los cuerpos vertebrales puede estimarse como un paralelogramo con leve inclinación ventral y ligera concavidad craneal17. Esta forma presenta desafíos para lograr pruebas de compresión uniaxial ex vivo porque, sin una preparación adecuada de la superficie de carga, las fuerzas de compresión se aplicarán solo a una parte de la superficie de carga, lo que dará como resultado un "contacto local"17,19. Esto puede causar resultados inconsistentes y fallas prematuras19. Este no es el caso in vivo porque la superficie de carga está rodeada por discos intervertebrales en las articulaciones vertebrales, lo que permite que la carga se distribuya por toda la placa terminal craneal. El complejo disco intervertebral-placa terminal craneal juega un papel importante en la aplicación de fuerza en todo el cuerpo vertebral y en la biomecánica de la fractura en el cuerpo vertebral14,20. Si bien las pruebas de compresión no son nuevas en el campo de la biología, existen limitaciones en los métodos actuales de pruebas mecánicas de huesos. Estas limitaciones incluyen la falta de modelos predictores y simulaciones para la mecánica ósea, la arquitectura espacial geométrica única e incluso las variaciones biológicas inherentes basadas en muestras21. Más importante aún, el campo se ve desafiado por la falta de estandarización entre los métodos y la falta general de métodos reportados en la literatura22.
Existen dos métodos reportados en la literatura para la preparación de vértebras lumbares de roedores para lograr la prueba de compresión uniaxial: el método de corte y el método de inclusión 17,19,23,24,25,26. El método de corte requiere que las apófisis vertebrales, la placa terminal craneal y la placa terminal caudal se corten del cuerpo vertebral. Pendleton et al.19 han descrito previamente un método detallado para el uso de este método en vértebras lumbares de ratón. Este método presenta los desafíos de lograr cortes perfectamente paralelos en las placas terminales caudal y craneal y, al mismo tiempo, evitar cualquier daño a la muestra. También tiene la limitación de que se retira la placa final craneal. La placa terminal craneal contiene una densa capa de hueso cortical y desempeña un papel importante en la distribución de las cargas de los discos intervertebrales in vivo y está involucrada en la falla del hueso para fracturas in vivo 17,20,27. Por el contrario, el método de inclusión consiste en extirpar las apófisis vertebrales manteniendo intacta la placa terminal craneal del cuerpo vertebral. A continuación, la superficie de carga se hace aproximadamente horizontal colocando una pequeña cantidad de cemento óseo en el extremo craneal del cuerpo vertebral. Este método tiene la ventaja de que supera los desafíos técnicos asociados con el método de corte y puede imitar mejor el mecanismo de aplicación de carga y falla ósea in vivo debido a la preservación de la placa terminal craneal. Este enfoque se ha documentado previamente en estudios que involucran pruebas de compresión uniaxial en huesos de rata. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha documentado previamente en el contexto de vértebras lumbares de ratón más pequeñas 17,25,26. El método en cuestión fue previamente detallado por Chachra et al.25 y originalmente utilizó una muestra ósea sostenida entre dos placas, cada una con una cavidad cilíndrica, que luego se rellenó con polimetilmetacrilato (PMMA). Posteriormente, el mismo grupo de investigación mejoró el método en el que un extremo se lija suavemente (caudal) y al otro extremo se le agrega una pequeña mancha de cemento óseo (craneal)26. Este método es una mejora con respecto al método anterior porque minimiza el material entre las platinas y es el enfoque de este artículo. A pesar de los desafíos asociados con las pruebas de compresión vertebral uniaxial, es un método que puede proporcionar información valiosa sobre los efectos de una terapia propuesta en el hueso, especialmente cuando se combina con la flexión de tres puntos.
Aquí, se presenta el uso de una máquina convertible de prueba de flexión / compresión de tres puntos para permitir una fácil prueba tanto de huesos largos como de cuerpos vertebrales utilizando una sola máquina. Además, se presenta el uso de un método de inclusión para lograr pruebas de compresión uniaxial de vértebras lumbares de ratón. El presente estudio se realizó como parte de un estudio más amplio que tuvo como objetivo investigar las influencias de la suplementación con semillas de cáñamo en la dieta sobre las propiedades del hueso esquelético en ratones hembra C57BL/6 jóvenes y en crecimiento 5,6. El probador de flexión de tres puntos fue construido originalmente por profesores y estudiantes del Departamento de Ingeniería de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo y utilizado por nuestro grupo de investigación en pruebas de flexión de tres puntos en huesos largos [fémur y tibia de rata7 y húmero, fémur y tibia de ratón 5,6,8,9]. Sin embargo, no se exploró su modificación y aplicación para su uso en pruebas de compresión del cuerpo vertebral en ratones. El diseño y la construcción de la máquina dobladora de tres puntos han sido descritos anteriormente7. Este informe se centrará en los métodos utilizados para modificar la máquina para las pruebas de compresión y para corregir el desplazamiento del sistema. En segundo lugar, se describe el método de inclusión para la preparación de la superficie de carga del cuerpo vertebral del ratón, junto con los métodos para los ensayos de compresión uniaxial y el análisis de los datos de carga-desplazamiento.
Todos los experimentos y protocolos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y recibieron la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo (Número de Protocolo: 000-000A-021). Los procedimientos detallados para el cuidado de los animales han sido descritos previamente 5,6. Los ratones se obtuvieron a las tres semanas de edad como parte de un estudio más amplio destinado a investigar los efectos de una dieta suplementada con semillas de cáñamo en ratones hembra C57BL/6 jóvenes y en crecimiento (ver Tabla de materiales). De las 5 a las 29 semanas de edad, los ratones se criaron con una de tres dietas: control (0% de semillas de cáñamo), 50 g/kg (5%) de semillas de cáñamo o 150 g/kg (15%) de semillas de cáñamo, con ocho ratones por grupo 5,6. A lo largo del estudio, los ratones tuvieron acceso ad libitum a sus respectivas dietas y agua, se alojaron en parejas en jaulas de policarbonato y se mantuvieron en un ciclo de luz de 12 h: 12 h de oscuridad (con luces encendidas de 06:00 a 18:00 h). El peso y la salud de los ratones se evaluaron semanalmente, y todos los ratones completaron con éxito el estudio sin desarrollar ninguna condición de salud adversa. A las veintinueve semanas de edad, los ratones fueron anestesiados profundamente con gas isoflurano y sacrificados a través de la luxación cervical 5,6. Se realizó una incisión en la línea media de la superficie ventral desde el esternón hasta la cola, y se extrajeron todos los órganos intratorácicos, peritoneales y retroperitoneales de las canales. Los cadáveres eviscerados se conservaron en una solución de cloruro de sodio al 0,9% a -70 °C hasta el momento de la disección ósea para la prueba de vértebras, que ocurrió aproximadamente un año después.
1. Conversión de una máquina dobladora de tres puntos en una máquina de prueba de compresión
2. Corrección del desplazamiento de la máquina de prueba de compresión
3. Disección de la 5ª vértebra lumbar (L5) del cadáver del ratón
4. Preparación de la superficie de carga de la vértebra L5 para la prueba de compresión uniaxial utilizando el método de inclusión de cemento óseo PMMA
5. Análisis de curvas de carga-desplazamiento para ensayos de compresión uniaxial de vértebras L5
Con este protocolo paso a paso que utiliza la incrustación de la superficie de carga L5 y una máquina de flexión de tres puntos convertible / máquina de prueba de compresión, es posible realizar pruebas de compresión en vértebras lumbares de ratón para comparaciones entre grupos. Un total de veinticuatro vértebras L5 de ratón se prepararon utilizando el método de inclusión. Sin embargo, tres de las muestras resultaron dañadas durante la extracción de las apófisis vertebrales utilizando un disco de corte de diamante en una herramienta rotativa y, por lo tanto, no se analizaron. Teniendo en cuenta esto, las propiedades mecánicas enumeradas se obtuvieron con éxito a partir de veintiuna de veinticuatro muestras utilizando el método de incrustación. Las muestras se inspeccionaron visualmente después de cada prueba, y la tapa de PMMA no sufrió daños en ninguna de las pruebas. Como se señaló, los ratones utilizados en el presente estudio formaron parte de un estudio más amplio con el objetivo de determinar los efectos de la semilla de cáñamo dietética en los huesos de ratones hembra C57BL/6 jóvenes y en crecimiento. En la Tabla 1 se ofrecen estadísticas descriptivas de cinco propiedades mecánicas de hueso entero comúnmente reportadas. Las curvas de carga-desplazamiento para las veintiuna muestras se proporcionan en la Figura 7.
Figura 1: Conversión de una máquina dobladora de tres puntos en una máquina de ensayo de compresión. (A) La máquina está totalmente equipada para funcionar como una máquina dobladora de tres puntos con el sensor de desplazamiento y el sensor de carga indicados (flechas blancas). (B) La máquina después de que se haya retirado la viga de la cruceta. (C) La máquina después de que se haya colocado una platina superior autoalineable donde se colocó previamente la viga de la cruceta. (D) Las vigas de soporte inferiores con agujeros perforados en ellas. (E) La platina inferior de acero inoxidable con cuatro orificios roscados roscados y un tornillo parcialmente atornillado en uno de los orificios. Los otros dos agujeros que no se ven en la foto están en el lado opuesto. (F) Las vigas de soporte inferiores con la platina inferior unida a ellas por cuatro tornillos hexagonales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un ejemplo de desplazamiento del sistema (máquina Δx) frente a un gráfico de carga ajustado con una regresión lineal (A), logarítmica (B), polinomial de segundo orden (C) y polinomio de tercer orden (D). En este ejemplo, el polinomio de tercer orden proporciona el mejor ajuste según el valor de R2 y su regresión se utiliza como factor de corrección de desplazamiento del sistema. Las imágenes representan datos de ejemplo para demostrar el ajuste de regresión y deberán ser obtenidas por los investigadores para máquinas individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Columna vertebral lumbar de ratón. Una columna vertebral lumbar de ratón bajo un microscopio de disección antes de que se extirpara L6 (A) y después de que se hubiera extirpado L6, quedando L5 adherida (B). Posteriormente, se retirará L5 y se preparará para la prueba de compresión. Las bandas de color blanco son los discos intervertebrales que fueron diseccionados y extirpados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Anatomía de la vértebra L5. Una vértebra L5 representativa de ratón en vistas craneal, caudal, dorsal y ventral bajo un microscopio de disección. Las dimensiones importantes para el cuerpo vertebral incluyen la altura, el ancho dorsoventral y el ancho lateral, como se muestra en las líneas de colores. Las líneas discontinuas negras muestran aproximadamente dónde se deben hacer los cortes para eliminar las apófisis vertebrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Período de endurecimiento del cemento óseo PMMA. Un ejemplo de vértebra L5 con cemento óseo de PMMA (verde) colocado en la placa terminal craneal y la platina superior bajada sobre el cemento óseo de PMMA + complejo óseo. Una vez que el cemento óseo de PMMA se haya endurecido por completo, comenzará la prueba de compresión. La platina superior se bajará aún más hasta que se observe una falla del material. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Prueba de compresión ósea vertebral de ratón, curva de carga-desplazamiento y análisis de datos. El cursor A marca el inicio de la prueba de compresión. El cursor B marca el punto de falla del material. El cursor C marca el inicio de la región elástica lineal, mientras que el cursor D marca el final (es decir, el límite elástico). El área sombreada en gris claro es la región elástica lineal, donde el material volverá a su forma original si se elimina la carga. El área sombreada de gris oscuro es la región plástica, donde el material ha sufrido una deformidad permanente y no volverá a su forma original si se retira la carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Curvas de carga-desplazamiento para las veintiún muestras óseas. Los patrones variaban entre los huesos. En general, la mayor variabilidad se produjo en el desplazamiento posterior a la producción, ya que algunos (n = 5) de los huesos tuvieron un desplazamiento posterior a la producción relativamente pequeño y otros (n = 16) tuvieron un desplazamiento posterior a la producción relativamente grande. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Grupo | Trabajo hasta el fallo (N*mm) | Carga máxima (N) | Rigidez (N/mm) | Límite elástico (N) | Desplazamiento posterior al rendimiento (mm) |
CON (n = 7) | 13.43 ± 2.44 A,B | 37,93 ± 3,28 | 109,14 ± 11,86 | 22,68 ± 2,04 | 0,34 ± 0,06 |
5HS (n = 8) | 12.12 ± 1.23 A | 33,62 ± 2,43 | 99,70 ± 16,62 | 20,88 ± 2,69 | 0,38 ± 0,08 |
15HS (n = 6) | 19,55 ± 2,13 B | 41,82 ± 1,85 | 134,58 ± 19,73 | 28.07 ± 3.20 | 0,51 ± 0,07 |
Grupos combinados (n = 21) | 14.68 ± 1.27 | 37.40 ± 1.63 | 121,82 ± 9,43 | 23.54 ± 1.60 | 0,40 ± 0,04 |
Tabla 1: Valores representativos de las propiedades mecánicas de hueso entero comúnmente reportadas obtenidas utilizando el método de inclusión de preparación de la superficie de carga. Los valores se obtuvieron utilizando todos los protocolos detallados en el presente estudio. Por lo tanto, los valores representan aquellos que se pueden obtener utilizando los métodos aquí descritos. Los valores son medias ± SEM. Los grupos representan ratones hembra C57BL/6 alimentados con una dieta enriquecida con semillas de cáñamo enteras a concentraciones de 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) o 150 g/kg (15%) (15HS) entre las 5 y las 29 semanas de edad. Para uno de los parámetros (work-to-failure), parece que la dieta influyó en los valores de ANOVA de un factor (p < 0,05). Los valores que comparten el mismo superíndice de letras no son significativamente diferentes (p > 0,05), mientras que los valores con diferentes superíndices de letras son significativamente diferentes (p < 0,05), según el análisis post hoc de Tukey-Kramer.
Archivo complementario 1: Código de ejemplo para obtener propiedades mecánicas de hueso entero. Haga clic aquí para descargar este archivo.
El objetivo del presente estudio fue describir la construcción de una máquina convertible de flexión de tres puntos/máquina de ensayo de compresión, así como el uso de un método de inclusión de cemento óseo PMMA para la preparación de muestras de vértebras lumbares de ratón antes de la prueba de compresión uniaxial. Se obtuvieron y reportaron estadísticas descriptivas para las muestras óseas, que serán útiles para la comparación en futuros estudios. En el presente estudio se analizaron algunas de las propiedades mecánicas de hueso entero más comúnmente reportadas. Sin embargo, vale la pena señalar que hay varias propiedades mecánicas adicionales a nivel de hueso entero y tejido que no se investigaron aquí.
Todavía no está claro cómo se comparan las propiedades mecánicas obtenidas de las muestras preparadas mediante el método de inclusión con las preparadas mediante el método de corte de las vértebras lumbares de ratón. Schumancher17 evaluó previamente las propiedades mecánicas de las vértebras de rata preparadas utilizando los dos métodos diferentes y encontró que las vértebras preparadas utilizando el método de inclusión tenían una rigidez significativamente menor, un mayor desplazamiento de fluencia y una mayor deformación de fluencia que las muestras preparadas con el método de corte. Se necesita una mayor caracterización para comprender cómo se comparan las propiedades mecánicas vertebrales de ratones u otros modelos animales cuando se miden utilizando los dos métodos diferentes de preparación de la superficie de carga. Se espera que algunos parámetros difieran entre las vértebras preparadas con diferentes métodos, dado que el método de inclusión agrega material a la muestra pero preserva la placa terminal, que es una estructura importante en las fracturas vertebrales in vivo17,27. La adición de cemento óseo al extremo craneal agrega altura a la muestra, mientras que el corte de las placas finales elimina la altura, alterando la relación de aspecto y, por lo tanto, cambiando las propiedades mecánicas como la rigidez. Además, aunque el PMMA es más rígido que el hueso esponjoso vertebral, es posible que el PMMA sufra desplazamiento, y la extensión de este desplazamiento necesita una mayor caracterización. Además, no está claro cómo se comparan los resultados obtenidos con el método de inclusión o el método de corte con las predicciones de los parámetros óseos mediante el análisis de elementos finitos para las vértebras de ratón o cómo varían los resultados en diferentes condiciones (por ejemplo, velocidad de descenso, diferentes niveles vertebrales, composiciones de PMMA). No obstante, debido a que todas las muestras se preparan de manera similar, este método es apropiado y permite un medio fácil y rentable de hacer comparaciones entre grupos de tratamiento en un solo estudio en el que las muestras se preparan y analizan en condiciones similares.
En cuanto a la preparación de la muestra antes de la prueba de compresión, es esencial preparar las muestras de manera reproducible. Una posible limitación del método descrito en el presente estudio es el uso de una herramienta rotativa para eliminar las apófisis vertebrales. Otro método para extirpar las apófisis vertebrales de las vértebras lumbares de ratón ha sido descrito por Pendleton et al.19, lo que puede permitir una preparación más consistente de la muestra. Además, pueden surgir inconsistencias de la aplicación de cemento óseo de PMMA. Por lo tanto, es importante aplicar el cemento óseo de manera consistente en términos de volumen, colocación y tiempo de endurecimiento. Sin embargo, el método de inclusión puede proporcionar un medio más simple para lograr una preparación de muestras consistente en comparación con el método de corte, ya que puede ser un desafío lograr cortes paralelos perfectamente uniformes y consistentes entre todas las muestras debido a su pequeño tamaño y fragilidad. Se necesitarán estudios futuros para evaluar la precisión de los resultados obtenidos a partir de muestras preparadas utilizando el método de inclusión vs. método de corte.
Como se mencionó, se necesita una mayor caracterización e investigación del método de inclusión para la preparación de muestras de vértebras lumbares de ratón antes de la prueba de compresión uniaxial. No obstante, este estudio demuestra que este método puede ser empleado, proporciona una descripción detallada del método propuesto y ofrece estadísticas descriptivas de los parámetros medidos a partir de muestras preparadas con el método. Este protocolo es valioso para el campo debido a la falta actual de metodología disponible. Además, este método puede imitar mejor el mecanismo por el cual ocurren las fracturas vertebrales in vivo en comparación con otros métodos17,27. El método también tiene la ventaja de superar las dificultades técnicas asociadas con otros métodos actualmente reportados, lo que hace que las pruebas de compresión uniaxial sean más factibles en la investigación ósea. Esto es particularmente significativo porque los fármacos, las dietas u otras intervenciones pueden influir de manera diferente en los huesos ricos en corticales (p. ej., hueso largo de diáfisis media) y en los huesos ricos en trabecular (p. ej., cuerpos vertebrales), sin embargo, la flexión de tres puntos es el método predominante para evaluar las propiedades mecánicas de los huesos13. La combinación de la prueba de flexión de tres puntos y la prueba de compresión uniaxial puede ser aún más fácil de lograr mediante el uso de una máquina convertible de prueba de flexión / compresión de tres puntos. Por lo tanto, el presente estudio propone dos posibles medios para hacer que la evaluación del hueso rico en corticales y trabecular en el mismo estudio esté más disponible para los investigadores, lo que podría conducir a una mejor comprensión de cómo un tratamiento determinado afecta a diferentes tipos de hueso entre grupos experimentales.
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Estamos agradecidos por los importantes esfuerzos que el Departamento de Ingeniería de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo proporcionó en la construcción de la máquina dobladora de tres puntos y su modificación a una máquina convertible de prueba de flexión / compresión de tres puntos. Estamos especialmente agradecidos al Sr. Paul Wallace, coordinador del taller de máquinas, por sus esfuerzos en la planificación y ejecución de la construcción y modificación de la máquina. La experiencia y los comentarios de la Dra. Bahaa Ansaf (Universidad Estatal de Colorado-Pueblo, Departamento de Ingeniería) y la Dra. Franziska Sandmeier (Universidad Estatal de Colorado-Pueblo, Departamento de Biología) también contribuyeron significativamente a este proyecto. La beca del Instituto de Investigación del Cannabis de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo financió el proyecto más grande del que formó parte este experimento y permitió la compra de los ratones, los reactivos y algunos de los equipos utilizados.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
120-Grit Sand Paper | N/A | N/A | For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities |
24-bit Load Cell Interface | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | DQ-1000 | To connect load and displacement sensors to personal coputer |
Base Mouse Diet | Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA | AIN-93G | Diet the mice were fed, without added hempseed |
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool | Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA | F0130200AK | To remove vertebral proccesses |
Displacement Sensor | Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA | ID-S112EX | Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy |
External Variable Voltage Power Source | Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA | 382213 | To provide power to compression testing machine |
Female C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA | 027 (Strain Code) | Mouse model used in present study |
Hempseed | Natera, Pitt Meadows, Canada | 670834012199 | Hempseed added to Base Mouse Diet |
Igor Pro Software (Version 8.04) | Wave Metrics, Portland, Oregon, USA | N/A | Sofware used for load-displacement curve analysis |
iLoad Mini Force Sensor | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | MFM-010-050-S | Load (force) sensor with 1.0% accuracy |
Isotonic (0.9%) Saline Solution | N/A | N/A | To keep bone sampels hydrated |
Leica EZ4 W Miscoscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | NC1601884 | For bone dissections and vertebral process removal |
Microsoft Excel Software | Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA | N/A | For data transfer from SensorVue software |
PALACOS R Bone Cement | Hareus Medical, Wehreim, Germany | 00-1112-140-01 | PMMA bone cement for embedding of the loading surface |
Personal Computer | N/A | N/A | For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software) |
SensorVue Software | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | N/A | Software used for real-time data collection during compression testing |
Small Animal Dissecting Kit | N/A | N/A | Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads |
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering |
Three-Point Bending Machine | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction |
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