Cribado de modificación de histonas mediante cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Resumen

Un flujo de trabajo analítico basado en cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para un análisis "ascendente" de alta confianza y altamente reproducible de las modificaciones e identificación de histonas en función de los parámetros principales (tiempo de retención [RT], sección transversal de colisión [CCS] y relación masa-carga [m/z] precisa).

Resumen

Las proteínas histonas son muy abundantes y se conservan entre los eucariotas y desempeñan un papel importante en la regulación génica como resultado de estructuras conocidas como modificaciones postraduccionales (PTM). La identificación de la posición y la naturaleza de cada PTM o patrón de PTM en referencia a factores externos o genéticos permite correlacionar estadísticamente esta información con respuestas biológicas como la transcripción, replicación o reparación del ADN. En el presente trabajo se describe un protocolo analítico de alto rendimiento para la detección de histonas PTM a partir de muestras biológicas. El uso de cromatografía líquida complementaria, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) permite la separación y la asignación de PTM de las modificaciones biológicamente más relevantes en un solo análisis. El enfoque descrito aprovecha los desarrollos recientes en la adquisición de datos dependientes (DDA) utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad, seguida de la fragmentación secuencial y la disociación inducida por colisiones. Los PTM de Histone se asignan con confianza en función de su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación.

Introducción

En las células eucariotas, el ADN se empaqueta como cromatina en unidades funcionales llamadas nucleosomas. Estas unidades están compuestas por un octámero de cuatro histonas centrales (dos de H2A, H2B, H3 y H4)1,2,3,4. Las histonas se encuentran entre las proteínas más abundantes y mejor conservadas en los eucariotas, que son en gran parte responsables de la regulación génica⁵. Las modificaciones postraduccionales de histonas (PTM) desempeñan un papel importante en la regulación de la dinámica de la cromatina y en la preparación de diversos procesos biológicos, como la transcripción, replicación^{y reparación del} ADN. Los PTM se encuentran principalmente en la superficie accesible de las regiones N-terminales de las histonas que están en contacto con el ADN ^3,7. Sin embargo, las modificaciones de la cola y el núcleo influyen en la estructura de la cromatina, alterando las interacciones entre nucleosomas y reclutando proteínas específicas ^3,8.

Un reto actual durante la proteómica basada en cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS) es la posible coelución de analitos de interés. En el caso de los análisis dependientes de los datos (DDA), esto se traduce en la pérdida potencial de varios iones precursores durante el proceso de adquisición de MS/MS⁹. Los instrumentos de tiempo de vuelo (ToF) adquieren espectros a muy alta frecuencia ^9,10 (hasta decenas de kHz)¹¹; esto los hace capaces de escanear rápidamente el total de iones precursores dentro de una muestra compleja (MS1), lo que promete una sensibilidad óptima y velocidades de secuenciación MS/MS (hasta 100 Hz)⁹ y los hace ideales para el análisis de muestras biológicas¹⁰. Sin embargo, la sensibilidad disponible a estas altas velocidades de exploración está limitada por la velocidad MS/MS⁹. Para mitigar estas limitaciones, se utilizó la adición de espectrometría de movilidad de iones atrapados (TIMS) en combinación con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar ortogonal (qToF). En TIMS, todos los iones precursores se acumulan en tándem y se eluyen en función de su movilidad, en lugar de seleccionar masas precursoras individuales con un cuadrupolo⁹. La fragmentación en serie de acumulación paralela (PASEF) permite cientos de eventos MS/MS por segundo sin pérdida de sensibilidad⁹.

El objetivo principal de este trabajo fue mostrar los desarrollos recientes de DDA utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad seguida de fragmentación secuencial y disociación inducida por colisión (CID). Los PTM de Histone se asignaron con confianza en función de sus tiempos de retención (RT), movilidades y patrones de fragmentación.

Protocolo

NOTA: Las muestras de histonas se extrajeron utilizando un método adaptado de Bhanu et al. (2020)¹².

1. Preparación de la muestra

1. Recolección de células cultivadas
   1. Cuando las células sean confluentes en un 80%, asegúrese de que sean viables utilizando la exclusión del azul de tripano.
      NOTA: Para estos experimentos se utilizó una línea celular HeLa S3, pero este método se puede aplicar a cualquier célula cultivada.
   2. Aspire el medio, luego aplique 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x a cada placa.
   3. Agite la(s) placa(s) para enjuagar todos los medios residuales, luego aspire PBS y aplique 5 ml de 1x PBS.
   4. Separe suavemente las células de la placa raspándolas con un elevador de células desechable.
   5. Transfiera cada suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.
   6. Gellet las células centrifugando a 800 x g durante 5 min.
   7. Aspire el PBS del gránulo de la célula.
   8. Proceder a la extracción de histonas.
      NOTA: Congele rápidamente el gránulo de celda en nitrógeno líquido si no se puede procesar de inmediato. Guarde los gránulos a -80 °C hasta que estén listos para continuar.
2. Extracción de histonas
   1. Estime el volumen de cada gránulo celular y marque el menisco con un marcador permanente.
   2. Prepare suficiente tampón de aislamiento nuclear (NIB; 15 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM de NaCl, 60 mM de KCl, 5 mM de MgCl₂, 1 mM de CaCl₂ y 250 mM de sacarosa) para todas las muestras. Alternativamente, si es necesario procesar muchas muestras a lo largo del tiempo, hacer el tampón a granel y almacenarlo a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses, o alícuota y congelar a -15 °C a -25 °C indefinidamente descongelando solo la cantidad necesaria para cada extracción.
      NOTA: El búfer debe permanecer despejado durante el almacenamiento. Si el tampón adquiere una apariencia turbia o anormal en cualquier momento, deséchelo y prepare un tampón nuevo.
   3. Prepare 50 veces el volumen de los gránulos celulares de tampón de lavado y agregue los inhibidores de la siguiente manera (aproximadamente 10 ml de tampón de lavado por 2 muestras).
      1. Para preparar 10 ml de tampón de lavado, mezcle 10 ml de NIB, 30 μl de 200 mM de clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo [AEBSF], 10 μl de ditiotreitol [DTT] 1 M, 20 μL de microcistina de 5 μM, 20 μL de butirato de sodio 5 M.
   4. Retire 1/5 del tampón de lavado para preparar el tampón de lisis (1/5 de volumen del tampón de lavado, 0,3% NP-40 o NP-40 alternativo).
      NOTA: No utilice Triton-X 100 en lugar de NP-40 o NP-40 alternativo, ya que puede ser demasiado abrasivo para ciertos tipos de celdas.
   5. Lavar bien el gránulo celular suspendiéndolo en 5 columnas de tampón de lavado y centrifugando a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Complete este paso dos veces, aspirando y desechando el sobrenadante entre lavados.
   6. Asegúrese de que el volumen del gránulo de celda aún esté marcado con un marcador permanente. Vuelva a suspender en 10 volúmenes de tampón de lisis.
   7. Mezcle bien cada gránulo con una pipeta para volver a suspender, luego incube durante 15 minutos en hielo.
   8. Después de 15 minutos, centrifugar a 800 x g durante 5 minutos a 4 °C.
   9. Aspire y deseche el sobrenadante.
      NOTA: El gránulo debe reducirse a ^{≤ 1}/₂ del tamaño original del gránulo (como lo indica la línea de marcador). Si el gránulo no se ha reducido lo suficiente, repita el procedimiento de lisis e incluya un paso de homogeneización suave con un mortero para abrir las células.
   10. Una vez completada la lisis, vuelva a suspender el gránulo en 500 μL de tampón de lavado, luego centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche el sobrenadante, luego repita el paso de lavado una vez más para eliminar todos los rastros de NP-40.
       NOTA: En este punto, el gránulo consiste en cromatina, que contiene histonas.
   11. Vuelva a suspender el gránulo en 5 volúmenes (del tamaño original del gránulo de la célula) de 0,4 N H₂SO₄.
   12. Incubar durante 2 h en una cámara frigorífica o frigorífica con un agitador.
   13. Después de 2 h, centrifugar la(s) muestra(s) a 3400 x g durante 5 min a 4 °C. No deseche el sobrenadante.
   14. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos y aumente el ácido tricloroacético (TCA) al 100% a 1/3 del volumen del contenido (la concentración final de TCA será de aproximadamente el 20%).
   15. Invierta suavemente el tubo y observe que la solución transparente e incolora se vuelve blanca y/o turbia, lo que indica precipitación de proteínas.
       NOTA: Para soluciones con bajas concentraciones de histonas, es posible que la precipitación de proteínas no se note de inmediato, pero el precipitado debe ser visible después de la incubación durante la noche.
   16. Incubar sin perturbaciones durante la noche (12-18 h) a 4 °C para precipitar completamente las proteínas histonas.
   17. Al día siguiente, centrifugar a 3400 x g durante 5 min a 4 °C.
   18. Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no tocar los lados del tubo con la punta de la pipeta. En esta etapa, las histonas se depositan principalmente como una película alrededor de los lados de los tubos.
   19. Añadir 500 μL de acetona helada + 0,1% de HCl (acetona ácida) a cada tubo, utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, e invertir suavemente los tubos varias veces. Organice las muestras en orden (1, 2, 3, etc.) mientras hace esto, ya que cualquier acetona errante puede eliminar las marcas en los tubos. Centrifugar a 3400 x g durante 5 min a 4 °C y decantar suavemente el sobrenadante.
   20. Repita este paso de enjuague con 500 μL de acetona 100% helada, también con una pipeta Pasteur de vidrio. Centrifugar a 3400 x g durante 5 min a 4 °C y decantar suavemente el sobrenadante.
   21. Deje los tubos abiertos para que se sequen a temperatura ambiente hasta que la acetona restante se haya evaporado.
   22. Cuando esté seco, agregue 100 μL de agua de grado de espectrometría de masas (MS) a cada tubo. Use esta gota para frotar todos los lados del recipiente para resuspender toda la película de histonas. Para ello, pipetee la gota en el lateral del tubo y gírela mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo o dispensa la mitad de los 100 μL y utiliza la punta para removerla por todas partes. Una combinación de ambos métodos funciona mejor. Las histonas son fácilmente solubles en agua y estarán en la solución.
   23. Después de resuspender todas las muestras, si queda algún sólido blanco, sonicar en un baño a temperatura ambiente durante 5 min.
   24. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera la solución transparente a tubos nuevos. Deseche cualquier gránulo insoluble restante.
   25. Ejecute un SDS-PAGE en condiciones de reducción para comprobar que la extracción está limpia.
       NOTA: Los geles se pueden utilizar con cualquier concentración adecuada de poliacrilamida, siempre que pueda diferenciar proteínas en el rango de 10-20 kDa. Consulte la Tabla de materiales para conocer los geles utilizados en este protocolo.
   26. Realice un ensayo de concentración de proteínas (es decir, Bradford o BCA) para determinar la concentración total de proteínas.
3. Derivatización química (propionilación) de los residuos de lisina
   1. Transfiera 20 μg de histonas (determinadas por el ensayo de proteínas) a un tubo limpio. Seque esta muestra hasta <5 μL con un concentrador de vacío, luego vuelva a suspender usando 20 μL de bicarbonato de amonio 100 mM (NH₄CO₃) (~1 μg/μL de solución). Ajuste el pH a ~ 8 usando hidróxido de amonio si es necesario.
      PRECAUCIÓN: No utilice hidróxido de amonio (NH₄OH) para resuspender, solo para ajustar el pH si es necesario. De lo contrario, las proteínas se desnaturalizarán y precipitarán.
      NOTA: Para comprobar el pH con una pérdida mínima de muestra, utilice una punta de pipeta para sumergir la muestra y frotar en una tira de pH. Este procedimiento de prueba será útil a lo largo de los pasos restantes de preparación de la muestra.
   2. Prepare el reactivo de propionilación agregando anhídrido propiónico al acetonitrilo (ACN) en una proporción de 1:3 (v/v) (es decir, para hacer 40 μL de reactivo, combine 10 μL de anhídrido propiónico con 30 μL de ACN).
      NOTA: Tradicionalmente, el metanol o el isopropanol se han utilizado en la preparación de un reactivo de propionilación. Como la propionilación es una reacción de formación de amidas, se requiere un disolvente no protónico, como el acetonitrilo, para evitar productos secundarios y reacciones no deseados, como el éster de propionil metilo, que resulta del uso de metanol. Prepare solo suficiente reactivo de propionilación para un máximo de 4 muestras a la vez para que el reactivo permanezca fresco. Utilice el reactivo dentro de 1-2 minutos de la preparación. A medida que el reactivo se asienta, el anhídrido propiónico reaccionará con la humedad ambiental y comenzará a formarse ácido acético, lo que puede cambiar la efectividad del reactivo y cambiará el pH de la solución de histonas una vez que se agregue el reactivo.
   3. Agregue reactivo de propionilación a cada muestra en un 1:4 (v/v) (es decir, para 20 μL de histonas, agregue 5 μL de reactivo de propionilación).
   4. Agregue rápidamente 1:5 (v/v) NH₄OH (es decir, agregue 4 μL por 20 μL de la solución de histonas) para restablecer el pH de la solución a ~ 8. Si el pH sigue siendo demasiado bajo, agregue 1-2 μL de NH₄OH a la vez hasta alcanzar un pH de 8. Normalmente, una relación de 1:5 (v/v) es adecuada.
   5. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos sin alteraciones.
   6. Repita la reacción de propionilación para no más de 3-4 muestras por lote de reactivo de propionilación para garantizar una formación mínima de ácido.
   7. Repita los pasos 1.3.2 a 1.3.5 del procedimiento de propionilación. Una segunda ronda de propionilación asegura que el >95% de las lisinas disponibles estén derivatizadas.
   8. Seque las muestras hasta <5 μL con un concentrador de vacío. Esto evaporará cualquier reactivo de propionilación sin reaccionar, productos ácidos y gas amoníaco liberados por el NH₄OH. Si las muestras se secan por completo, está bien, ya que no se producen pérdidas significativas de muestras.
      NOTA: Desplace el aire de la botella de anhídrido propiónico con gas argón antes de almacenarlo para evitar la formación de ácido acético debido al contacto con la humedad ambiental que queda en la botella.
4. Digestión proteolítica con tripsina
   1. Resuspender histonas en 100 mM de NH₄HCO₃ para conseguir un volumen de 20 μL, consiguiendo una concentración óptima de 1 μg/μL.
      NOTA: Las soluciones de muestra con concentraciones inferiores a 1 μg/μL darán lugar a una disminución de la eficiencia de la tripsina.
   2. Añadir tripsina a las muestras de histonas en una proporción de 1:10 (peso/peso) (es decir, añadir 2 μL de solución de 1 μg/μL de tripsina a 20 μg de histonas).
   3. Incubar las reacciones a 37 °C durante 6-8 h. Alternativamente, incubar durante la noche (12-18 h) a temperatura ambiente.
   4. Detenga la digestión congelando a -80 °C durante al menos 1 h.
      NOTA: No use ácido para apagar la reacción de digestión, ya que esto causará una caída no deseada en el pH en este punto del procedimiento. La muestra se puede almacenar a -80 °C hasta que esté lista para continuar (punto de parada provisional).
5. Derivatización química (propionilación) de péptidos N-terminales
   1. Seque las muestras a <5 μL con un concentrador de vacío.
   2. Vuelva a suspender las muestras hasta 20 μL (1 μg/μL) con 100 mM de NH₄HCO₃.
   3. Repita la propionilación como antes (paso 1.3).
      NOTA: Es normal que las muestras tarden más en secarse en este paso debido a una mayor proporción de fase acuosa: orgánica.
6. Desalinización de muestras con puntas de etapa
   1. Vuelva a suspender o diluir las muestras con 50 μL de agua de grado MS + 0,1% de TFA.
   2. Con un desacanúcleos de muestras de 11-G, perfore 5 discos de material C₁₈ de un disco de extracción en fase sólida (perfore los 5 discos antes de transferirlos a la punta de la pipeta). Inserte y asegúrese de que los discos estén encajados de forma segura y uniforme en la parte inferior de una punta de pipeta de 200 μL (Figura 1).
      NOTA: Utilice un descoronador de 15 g si desala más de 25 μg de muestra a través de una sola punta de etapa.
   3. Utilice un adaptador de centrífuga para mantener las puntas de la platina en su lugar en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml o 2 ml.
      NOTA: Para los siguientes pasos de centrifugación, utilice una revolución lenta (400-500 x g) a 4 °C, durante 1-2 minutos a la vez; los disolventes normalmente atraviesan la resina en menos de 1 minuto, dependiendo de la fuerza con la que el material C₁₈ esté empaquetado en las puntas.
   4. Enjuague la resina centrifugando con 50 μL de acetonitrilo al 100% para activar el material C₁₈ y eliminar posibles contaminantes.
      NOTA: Puede ser más fácil cargar soluciones en las puntas de la platina utilizando puntas de pipeta con carga de gel. Una vez que se ha activado el material C₁₈ , es importante no permitir que la resina se seque durante el procedimiento de desalinización.
   5. Equilibrar el material del disco con 80 μL de agua de grado MS + 0,1% de TFA por centrifugación.
   6. Acidifique la muestra a pH 4 o inferior con ácido acético glacial. Compruebe el pH con tiras de pH como antes para minimizar la pérdida de muestra.
   7. Cargue la totalidad de la muestra en el disco de resina mediante centrifugación lenta.
   8. Lavar la muestra con 80 μL de agua de grado MS + 0,1% de TFA por centrifugación.
   9. Eluir la muestra en un tubo limpio de 1,5 ml enjuagando 70 μl de acetonitrilo al 75 % y ácido acético al 0,5 % mediante centrifugación lenta. Se puede utilizar un tiempo de centrifugación adicional para garantizar que el volumen total de la muestra se eluya de la punta de la etapa. Está bien si la resina se seca con el tiempo de centrifugación adicional, ya que ya no es necesaria después de la elución de la muestra.
   10. Seque cada muestra completamente en un concentrador de vacío.
       NOTA: La(s) muestra(s) puede(n) almacenarse(n) a -80 °C hasta que estén listas para continuar (punto de parada provisional).
   11. Para el análisis LC-MS/MS, reconstituir las muestras en un volumen de disolvente A (ácido fórmico al 0,1 %) del protocolo de cromatografía líquida (LC) que dé la concentración final de 0,4 μg/μL (es decir, disolver 20 μg de histonas en 50 μl de disolvente A).

2. Interfaz del software TIMS

1. Seleccione la pestaña Instrument (Instrumento ) y cambie a Operate (verifique que el nombre del instrumento se resalte en verde) (Figura 2).
2. Verifique los parámetros de TIMS (Figura 2).
3. Verifique la configuración de MS (inicio del escaneo, fin del escaneo, polaridad de iones, modo de escaneo) (Figura 2).
4. Verifique la configuración de TIMS (modo, inicio de movilidad, fin de movilidad, tiempo de rampa, tiempo de acumulación, ciclo de trabajo, velocidad de rampa, velocidad de MS, promedio de MS y calibración automática) (Figura 2).
5. Vaya a la pestaña Fuente y active la opción de jeringa (Hamilton 500 μL) solo para el paso de calibración de TuneMix (Figura 3)¹³.
6. Vaya a la pestaña Calibración , haga clic en m/z, seleccione Modo de calibración y elija el modo (Q mejorado, generalmente), zoom (+0,01%) Desarrollo STD (0,24) y haga clic en Calibrar; cuando se alcanza una puntuación del 100%, aceptar (Figura 4).
7. Vaya a la pestaña de movilidad y repita el proceso de calibración (modo lineal, generalmente), rango de detección (+5%), ancho (0,1 Da), desarrollo STD (0,1855) y, a continuación, haga clic en calibrar; cuando obtenga una puntuación ≥ 98,5%, acepte (Figura 5).
8. Vaya al método y seleccione el método que se va a utilizar; para este ejemplo, se seleccionó Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (Figura 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

1. Utilice las condiciones de funcionamiento típicas de nESI: tensión capilar de 4500 V, desplazamiento de la placa final de 800 V, presión del nebulizador de 3,0 bar, gas seco de 10,0 L/min, calentador seco de 200 °C y caudal de inyección de 50 μL/min.
2. Utilice la configuración típica de MS: energía de colisión de 6 eV, RF de colisión de 1200 Vpp, tiempo de transferencia de 75 μs, almacenamiento de prepulso de 5 μs.
3. Determine el flujo de gas de deriva utilizando la diferencia de presión entre el embudo de entrada P1 y el embudo de salida P2. La fragmentación en serie de acumulación paralela (PASEF) se produce en la célula TIMS, acumulando todos los iones precursores simultáneamente en lugar de individualmente. A continuación, los iones precursores se liberan en picos iónicos estrechos frente a los picos normalmente mucho más anchos (unas 50 veces más cortos), lo que aumenta la relación señal-ruido y separa los péptidos coeluyentes a través de la movilidad¹⁴.
4. Desarrollar un método LC-TIMS-ToF MS/MS para analizar péptidos proteolíticos de histonas. Acople un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento (HPLC) equipado con una columna C₁₈ (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) con un instrumento comercial TIMS-TOF MS con tecnología patentada PASEF.
   NOTA: Se determinó que el tamaño de esta columna proporciona una buena separación tanto a pH alto como bajo para mezclas de péptidos, con base en trabajos publicados anteriormente 15,16,17.
   1. Ajuste el volumen de inyección a 20 μl (8 μg) de muestra y un caudal de 0,4 ml/min.
   2. Ejecute un gradiente de LC no lineal de 60 minutos con agua con ácido fórmico al 0,1 % (disolvente A) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 % (disolvente B). Establezca el gradiente: 10% B durante 2,7 min, luego a 20% B en 5,3 min, 28% B en 4 min, 35% B en otros 18 min, 40% B en 13 min y 100% B en otros 2 min. Después de mantener el 100% de B durante 5 minutos, baje la concentración al 10% de B en 5 minutos y mantenga la posición durante los últimos 5 minutos.
5. Verifique la elución de la muestra del HPLC en el TIMS-TOF a través de ionización por nanoelectrospray (nESI) en modo de ionización positiva.

4. Análisis de datos

1. Identificar las secuencias peptídicas y los sitios de modificación.
   1. Prepare una lista teórica de péptidos utilizando ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] en la herramienta MS-digest.
      1. Realice un resumen teórico teniendo en cuenta las condiciones del resumen (enzima utilizada), los tipos de PTM que se buscan (por ejemplo, mono-, di- o trimetilación), el rango de tamaño de los péptidos que se buscan, así como el rango de detección de masa y el número potencial de escisiones perdidas.
2. Analice manualmente los datos adquiridos en función de los péptidos teóricos (Figura 6)¹².
   1. Se busca la búsqueda de las masas en varios estados de carga (+1 a +4) para cada péptido teórico.
   2. Después de la identificación inicial de cada m/z, seleccione el pico y confirme el MS/MS utilizando una lista teórica de iones de fragmentación basada en la secuencia peptídica, incluidos los PTM.
      NOTA: Si la movilidad del péptido identificado se conocía previamente, esto también se confirma.
3. Calcule las abundancias relativas de varios PTM e informe cada modificación como un porcentaje de la secuencia peptídica especificada.
   1. La abundancia relativa de cada PTM detectado se calcula mediante la siguiente ecuación:
      Abundancia relativa = Área de PTM/Área total de PTM no modificados y PTM para un péptido dado

Resultados

Un flujo de trabajo proteómico ascendente (Figura 7) suele implicar lo siguiente: extracción de la(s) proteína(s) objetivo(s) de una muestra cruda, seguida de la cuantificación de la(s) concentración(es) de la(s) proteína(s), y luego fraccionamiento, generalmente mediante electroforesis en gel o cromatografía líquida. Después del fraccionamiento, las proteínas se digieren utilizando una enzima proteolítica (a menudo tripsina) y, finalmente, el análisis por espectrometría de masa...

Discusión

Las histonas son proteínas básicas que regulan la estructura de la cromatina interactuando con el ADN en forma de octámeros formados por las cuatro histonas centrales (dos de H2A, H2B, H3 y H4)²⁰. Las histonas contienen numerosos residuos de lisina y arginina, que se modifican fácilmente, lo que da lugar a extensos PTM que alteran la química de la cromatina al influir en la función de las histonas o al unirse a otras proteínas celulares²¹. Los PTM pueden provocar res...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL Conical Tubes	Corning	352196	Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737	Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes	Corning	352070	Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate	Thermo Fisher Scientific	12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL	Axygen	P-DW-500-C-S
Acetone	Sigma Aldrich	179124	ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 HPLC column	Waters	186003625	XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer	Thermo Fisher Scientific	13151014
Ceramic scoring wafer	Restek	20116
Compass DataAnalysis 6.0	Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2	Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern	Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1	Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	89237526
Disposable Cell Lifters	Thermo Fisher Scientific	08100240	Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
Formic acid (FA)	Sigma Aldrich	695076	ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD	(Molex (Polymicro)	TSP075375
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientific	A38S	Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes	Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl	Sigma Aldrich	258148	ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Hypersep cartridge	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima for HPLC, Fisher Chemical
Microcentrifuge Tube Adapters	GL Sciences	501021514
Microcystin	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm	LEAP PAL Parts	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	model: ND3300
Nitrogen (N2)	Airgas	NI UHP300
PEAKS Studio X+	Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek	Micro Essential Lab	JR-113	Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl	Sigma Aldrich	P3911	ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell	Next Advance	model: PC77
Propionic Anhydride	Sigma Aldrich	8.00608	For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)	NuAire, model: Nuwind	NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g	ESI Source Solutions	r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels	Bio-Rad	4569035	Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate	Thermo Fisher Scientific	A11079.06	98+%
Sodium chloride, NaCl	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18	VWR	76333-134	Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor	Savant	model: SC210A
Sucrose	Millipore	1.07651	suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4	Sigma Aldrich	339741	99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer	Bruker Daltonics		model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA	Sigma Aldrich	T0699	6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate	Advion	model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057
Tube rotator	Thermo Fisher Scientific	88881001
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS118	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific