JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).

Abstract

חלבוני היסטון נפוצים מאוד ונשמרים בקרב האיקריוטים וממלאים תפקיד גדול בבקרת גנים כתוצאה ממבנים הידועים כשינויים פוסט-תרגומיים (PTM). זיהוי המיקום והאופי של כל PTM או תבנית של PTM ביחס לגורמים חיצוניים או גנטיים מאפשר למידע זה להיות מתואם סטטיסטית עם תגובות ביולוגיות כגון שעתוק DNA, שכפול או תיקון. בעבודה הנוכחית מתואר פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לזיהוי PTM היסטון מדגימות ביולוגיות. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסות זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) מאפשר הפרדה והקצאה של PTM של השינויים הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית באנליזה יחידה. הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישת נתונים תלויים (DDA) באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות, ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. רכיבי Histone PTM מוקצים בבטחה בהתבסס על זמן השמירה, הניידות ודפוס הפיצול שלהם.

Introduction

בתאים איקריוטים, דנ"א ארוז ככרומטין ליחידות פונקציונליות הנקראות נוקלאוזומים. יחידות אלה מורכבות מאוקטמר של ארבעה אבני ליבה (שניים כל אחד מ-H2A, H2B, H3 ו-H4)1,2,3,4. היסטונים הם בין החלבונים הנפוצים והשמורים ביותר באיקריוטים, האחראים במידה רבה לבקרת גנים5. שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון (PTM) ממלאים תפקיד גדול בוויסות הדינמיקה של הכרומטין ובתהליכים ביולוגיים שונים כגון שעתוק DNA, שכפול ותיקון6. PTMs מתרחשים בעיקר על פני השטח הנגישים של אזורי N-terminal של היסטונים הבאים במגע עם DNA 3,7. עם זאת, שינויים בזנב ובליבה משפיעים על מבנה הכרומטין, משנים אינטראקציות בין נוקלאוזומים ומגייסים חלבונים ספציפיים 3,8.

אתגר עכשווי במהלך פרוטאומטריה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) מבוססת פרוטאומיקה הוא שיתוף הפעולה הפוטנציאלי של אנליטים בעלי עניין. במקרה של ניתוחים תלויי נתונים (DDA), זה מתורגם לאובדן פוטנציאלי של מספר יונים מקדימים במהלך תהליך רכישת MS/MS9. מכשירי זמן טיסה (ToF) רוכשים ספקטרום בתדר גבוה מאוד 9,10 (עד עשרות קילוהרץ)11; זה הופך אותם למסוגלים לסרוק במהירות את סך כל היונים המקדימים בתוך מדגם מורכב (MS1), ובכך להבטיח רגישות אופטימלית וקצבי ריצוף MS/MS (עד 100 הרץ)9 ולהפוך אותם לאידיאליים לניתוח דגימה ביולוגית10. עם זאת, הרגישות הזמינה בקצבי סריקה גבוהים אלה מוגבלת על ידי קצב MS/MS9. התוספת של ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים (TIMS) בשילוב עם ספקטרומטר מסות זמן טיסה מרובע אורתוגונלי (qToF) שימשה למיתון מגבלות אלה. ב-TIMS, כל היונים המקדימים נצברים יחד ומדוללים כפונקציה של הניידות שלהם, במקום לבחור מסות מקדימות בודדות עם9 מרובע. פיצול טורי מצטבר מקבילי (PASEF) מאפשר מאות אירועי MS/MS בשנייה ללא כל אובדן רגישות9.

המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להראות את ההתפתחויות האחרונות של DDA באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID). PTMs היסטון הוקצו בביטחון בהתבסס על זמני השמירה שלהם (RTs), ניידות ודפוסי פיצול.

Protocol

הערה: דגימות היסטון חולצו בשיטה שאומצה מ- Bhanu et al. (2020)12.

1. הכנת מדגם

  1. קצירת תאים בתרבית
    1. כאשר התאים נפגשים ב-80%, ודא שהם בני קיימא באמצעות הרחקת טריפאן כחול.
      הערה: קו תאי HeLa S3 שימש לניסויים אלה, אך ניתן ליישם שיטה זו על כל תא בתרבית.
    2. יש לשאוף את המדיה, ולאחר מכן למרוח 5 מ"ל של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) על כל צלחת.
    3. סובבו את הצלחות כדי לשטוף את כל שאריות המדיה, ואז שאפו PBS ומרחו 5 מ"ל של 1x PBS.
    4. הפרידו בעדינות את התאים מהצלחת על ידי גירודם עם מרים תאים חד פעמי.
    5. מעבירים כל תרחיף תא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    6. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות.
    7. שאפו את PBS מכדורית התא.
    8. המשך למיצוי היסטון.
      הערה: יש להקפיא במהירות הבזק את כדורית התא בחנקן נוזלי אם לא ניתן לעבד אותה באופן מיידי. אחסנו את הכדוריות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות להמשך.
  2. מיצוי היסטון
    1. להעריך את הנפח של כל כדור תא ולסמן את המניסקוס עם סמן קבוע.
    2. הכינו מספיק מאגר בידוד גרעיני (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 ו-250 mM סוכרוז) עבור כל הדגימות. לחלופין, אם יש צורך לעבד דגימות רבות לאורך זמן, יש ליצור את החיץ בכמויות גדולות ולאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 6 חודשים, או ליצור aliquot ולהקפיא ב-15°C עד -25°C ללא הגבלת זמן על ידי הפשרת הכמות הדרושה לכל מיצוי בלבד.
      הערה: המאגר צריך להישאר נקי במהלך האחסון. אם המאגר מקבל מראה מעונן או חריג אחר בכל עת, השליכו והכינו מאגר חדש.
    3. הכינו פי 50 מנפח כדורי התא של חיץ השטיפה והוסיפו מעכבים כדלקמן (כ-10 מ"ל חיץ שטיפה לכל 2 דגימות).
      1. להכנת 10 מ"ל של חיץ כביסה, יש לערבב 10 מ"ל של NIB, 30 μL של 200 מ"מ 4-(2-אמינואתיל)בנזנסולפוניל פלואוריד הידרוכלוריד [AEBSF], 10 μL של 1 M dithiothreitol [DTT], 20 μL של 5 מיקרוציסטין 5 מיקרו, 20 μL של 5 M נתרן בוטיראט.
    4. הסר 1/5 ממאגר הכביסה כדי להכין את חיץ הליזיס (1/5 נפח ממאגר הכביסה, 0.3% NP-40 או NP-40 חלופי).
      הערה: אל תשתמש ב- Triton-X 100 במקום בחלופה NP-40 או NP-40, מכיוון שהוא עשוי להיות שוחק מדי עבור סוגי תאים מסוימים.
    5. שטפו היטב את גלולת התא על ידי השעייתה ב-5 עמודות של חיץ כביסה וצנטריפוגות בטמפרטורה של 800 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השלימו שלב זה פעמיים, שאפו והשליכו את הסופרנאטנט בין הכביסה.
    6. ודא שנפח גלולת התא עדיין מסומן בטוש קבוע. השהיה מחדש ב-10 כרכים של מאגר ליזיס.
    7. פיפטה - מערבבים היטב כל גלולה להשעיה מחדש, ואז דוגרים במשך 15 דקות על קרח.
    8. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
    9. שאפו והשליכו את הסופר-נאנט.
      הערה: הגלולה צריכה להקטין עד ≤ 1/2 מגודל הגלולה המקורי (כפי שמצוין בקו הסמן). אם הגלולה לא הצטמצמה מספיק, חזור על הליך הליזיס וכלול שלב הומוגניזציה עדין באמצעות מזיק כדי לפתוח את התאים.
    10. לאחר השלמת הליזה, השהה מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של חיץ שטיפה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו והשליכו את הסופרנטנט, ואז חזרו על שלב הכביסה פעם נוספת כדי להסיר את כל העקבות של NP-40.
      הערה: בשלב זה, הגלולה מורכבת מכרומטין, המכיל היסטונים.
    11. השהה מחדש את הגלולה ב -5 כרכים (מגודל גלולת התא המקורית) של 0.4 N H2SO4.
    12. יש לדגור במשך שעתיים בחדר קר או במקרר באמצעות מתסיס.
    13. לאחר שעתיים, צנטריפוגה את הדגימה (ים) ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. אל תשליך את הסופר-נטנט.
    14. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות חדשים, ומזנקים 100% חומצה טריכלורואצטית (TCA) ל-1/3 מנפח התכולה (ריכוז ה-TCA הסופי יהיה כ-20%).
    15. הפכו בעדינות את הצינור ושימו לב שהתמיסה השקופה וחסרת הצבע הופכת ללבנה ו/או מעוננת, מה שמעיד על משקעים חלבוניים.
      הערה: עבור תמיסות עם ריכוזי היסטון נמוכים, משקעי החלבון עשויים שלא להיות מורגשים באופן מיידי, אך המשקע צריך להיות גלוי לאחר הדגירה בלילה.
    16. יש לדגור ללא הפרעה למשך הלילה (12-18 שעות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לזרז לחלוטין את חלבוני ההיסטון.
    17. למחרת, צנטריפוגה ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
    18. שואפים את הסופרנטנט, נזהרים לא לגעת בצידי הצינור עם קצה הפיפטה. בשלב זה, ההיסטונים מופקדים בעיקר כסרט סביב צידי הצינור(ים).
    19. הוסף 500 μL של אצטון קר כקרח + 0.1% HCl (חומצה אצטון) לכל צינור, באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, ולאחר מכן להפוך בעדינות את הצינור(ים) מספר פעמים. סדרו את הדגימות בסדר (1, 2, 3 וכו') תוך כדי כך, שכן כל אצטון תועה עלול להסיר את הסימונים על הצינורות. צנטריפוגה ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בעדינות decant את supernatant.
    20. חזור על שלב שטיפה זה עם 500 μL של 100% אצטון קר כקרח, גם עם פיפטה פסטר זכוכית. צנטריפוגה ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בעדינות decant את supernatant.
    21. השאירו את הצינורות פתוחים לייבוש בטמפרטורת החדר עד שהאצטון שנותר יתאדה.
    22. כאשר יבש, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של מים ברמת ספקטרומטריית מסה (MS) לכל צינור. השתמש בטיפה זו כדי לספוג את כל צידי המיכל כדי להשהות מחדש את כל סרט ההיסטון. עשו זאת על ידי הצמדת הטיפה לצד הצינור וסיבובה תוך כדי פיטום למעלה ולמטה או ניפוק מחצית מ-100 מיקרוליטר ושימוש בקצה כדי לערבב אותה מסביב. שילוב של שתי השיטות עובד בצורה הטובה ביותר. היסטונים מסיסים בקלות במים ויהיו בתמיסה.
    23. לאחר השעיית כל הדגימות, אם נותר מוצק לבן, יש להסוניק באמבטיה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    24. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. העבירו את התמיסה השקופה לצינורות טריים. יש להשליך את כל הכדורים הבלתי מסיסים שנותרו.
    25. הפעל SDS-PAGE בתנאים מחמירים כדי לוודא שהחילוץ נקי.
      הערה: ניתן להפעיל ג'לים באמצעות כל ריכוז מתאים של פוליאקרילאמיד כל עוד הוא יכול להבדיל חלבונים בטווח של 10-20 kDa. עיין בטבלת החומרים עבור הג'לים המשמשים בפרוטוקול זה.
    26. בצע בדיקת ריכוז חלבון (כלומר, ברדפורד או BCA) כדי לקבוע את ריכוז החלבון הכולל.
  3. derivatization כימי (propionylation) של שאריות ליזין
    1. מעבירים 20 מיקרוגרם של היסטונים (נקבעים על ידי בדיקת החלבון) לצינור נקי. יבש דגימה זו עד <5 μL באמצעות רכז ואקום, ולאחר מכן השהה מחדש באמצעות 20 μL של 100 mM אמוניום ביקרבונט (NH4CO3) (~ 1 מיקרוגרם / תמיסת μL). התאם את ה- pH ל~8 באמצעות אמוניום הידרוקסיד במידת הצורך.
      אזהרה: אין להשתמש באמוניום הידרוקסיד (NH4OH) להשעיה מחדש, אלא רק כדי לכוונן את רמת החומציות במידת הצורך. אחרת, חלבונים יהיה denature ו לזרז.
      הערה: כדי לבדוק את רמת החומציות עם אובדן דגימה מינימלי, השתמש בקצה פיפטה כדי לטבול את הדגימה ולטפוח על רצועת pH. הליך בדיקה זה יהיה שימושי לאורך שלבי הכנת הדגימה הנותרים.
    2. הכינו את מגיב הפרופיונילציה על ידי הוספת אנהידריד פרופיוני לאצטוניטריל (ACN) ביחס של 1:3 (v/v) (כלומר, כדי ליצור 40 מיקרוליטר של מגיב, שלבו 10 מיקרוליטר של אנהידריד פרופיוני עם 30 מיקרוליטר של ACN).
      הערה: באופן מסורתי, מתנול או איזופרופנול שימשו להכנת מגיב פרופיונילציה. מכיוון שפרופיונילציה היא תגובת היווצרות אמיד, נדרש ממס לא פרוטוני, כמו אצטוניטריל, כדי למנוע תוצרי לוואי ותגובות לא רצויות, כגון מתיל פרופיוניל אסטר, הנובע משימוש במתנול. רק להכין מספיק מגיב propionylation עבור עד 4 דגימות בכל פעם, כך מגיב נשאר טרי. השתמש מגיב בתוך 1-2 דקות של הכנה. כאשר המגיב יושב, אנהידריד פרופיוני יגיב עם כל לחות הסביבה, וחומצה אצטית תתחיל להיווצר, אשר יכולה לשנות את האפקטיביות של מגיב וישנה את ה- pH של תמיסת היסטון לאחר הוספת המגיב.
    3. הוסף מגיב פרופיונילציה לכל דגימה ביחס של 1:4 (v/v) (כלומר, עבור 20 μL של היסטונים, הוסף 5 μL של מגיב פרופיונילציה).
    4. הוסף במהירות 1:5 (v/v) NH4OH (כלומר, הוסף 4 μL עבור 20 μL של תמיסת ההיסטון) כדי לבסס מחדש את ה- pH של התמיסה ל~8. אם ה- pH עדיין נמוך מדי, הוסף 1-2 μL של NH4OH בכל פעם עד להשגת pH של 8. בדרך כלל, יחס של 1:5 (v/v) הוא מספיק.
    5. יש לדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ללא הפרעה.
    6. חזור על תגובת הפרופיונילציה עבור לא יותר מ 3-4 דגימות לכל אצווה של מגיב פרופיונילציה כדי להבטיח היווצרות חומצה מינימלית.
    7. חזור על הליך הפרופיונילציה שלבים 1.3.2-1.3.5. סבב שני של פרופיונילציה מבטיח כי >95% מהליזין הזמין יעברו דה-ריווטציה.
    8. יבש את הדגימות עד <5 μL באמצעות רכז ואקום. פעולה זו תאדה כל מגיב פרופיונילציה, מוצרי חומצה וגז אמוניה המשתחררים מ- NH4OH. אם הדגימות מתייבשות לחלוטין, זה בסדר, מכיוון שלא מתרחשים הפסדי דגימה משמעותיים.
      הערה: יש להחליף את האוויר בבקבוק האנהידריד הפרופיוני עם גז ארגון לפני האחסון כדי למנוע היווצרות חומצה אצטית עקב מגע עם לחות הסביבה שנותרה בבקבוק.
  4. עיכול פרוטאוליטי עם טריפסין
    1. מרחפים מחדש את ההיסטונים ב-100 mM NH4HCO3 כדי להגיע לנפח של 20 μL, ולהשיג ריכוז אופטימלי של 1 מיקרוגרם/μL.
      הערה: תמיסות לדוגמה עם ריכוזים נמוכים מ-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר יגרמו לירידה ביעילות הטריפסין.
    2. הוסף טריפסין לדגימות היסטון ביחס של 1:10 (wt/wt) (כלומר, הוסף 2 μL של תמיסת 1 מיקרוגרם/μL של טריפסין ל-20 מיקרוגרם של היסטונים).
    3. יש לדגור על תגובות בטמפרטורה של 37°C למשך 6-8 שעות. לחלופין, יש לדגור למשך הלילה (12-18 שעות) בטמפרטורת החדר.
    4. עצור את העיכול על ידי הקפאה ב -80 ° C לפחות 1 שעה.
      הערה: אין להשתמש בחומצה כדי להרוות את תגובת העיכול, מכיוון שהדבר יגרום לירידה לא רצויה ב- pH בשלב זה של ההליך. ניתן לאחסן את הדגימה ב -80 ° C עד מוכן להמשיך (נקודת עצירה ביניים).
  5. derivatization כימי (propionylation) של פפטיד N-terminals
    1. יבש את הדגימות ל <5 μL באמצעות רכז ואקום.
    2. השהה מחדש את הדגימות עד 20 μL (1 מיקרוגרם/μL) באמצעות 100 mM NH4HCO3.
    3. חזור על פרופיונילציה כמו קודם (שלב 1.3).
      הערה: זה נורמלי שלדגימות לוקח יותר זמן להתייבש בשלב זה בגלל יחס פאזה מימי: אורגני גבוה יותר.
  6. התפלה לדוגמה עם עצות שלב
    1. יש להשהות או לדלל דגימות עם 50 מיקרוליטר מים ברמת MS + 0.1% TFA.
    2. באמצעות קורר מדגם 11-G, ניקב 5 דיסקים של חומר C18 מדיסק חילוץ פאזה מוצקה (ניקוב כל 5 הדיסקים לפני העברתם לקצה פיפטה). הכנס וודא שהדיסקים מחוברים בצורה מאובטחת ואחידה בתחתית קצה פיפטה של 200 μL (איור 1).
      הערה: יש להשתמש בקורר של 15 גרם אם מתפלים מעל 25 מיקרוגרם דגימה דרך קצה שלב יחיד.
    3. השתמש במתאם צנטריפוגות כדי להחזיק את קצות הבמה במקומם בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל או 2 מ"ל.
      הערה: עבור שלבי הצנטריפוגה הבאים, השתמש בסיבוב איטי (400-500 x גרם) ב- 4 ° C, למשך 1-2 דקות בכל פעם; הממסים בדרך כלל עוברים דרך השרף תוך פחות מדקה, תלוי עד כמה החומר C18 ארוז בקצוות.
    4. שטפו את השרף על ידי צנטריפוגה עם 50 μL של 100% אצטוניטריל כדי להפעיל את החומר C18 ולהסיר מזהמים פוטנציאליים.
      הערה: ייתכן שיהיה קל יותר להעמיס פתרונות על קצות הבמה באמצעות קצוות פיפטה להעמסת ג'ל. לאחר הפעלת חומר C18 , חשוב לא לאפשר לשרף להתייבש למשך הליך ההתפלה.
    5. אזנו את חומר הדיסק עם 80 מיקרוליטר מים ברמת MS + 0.1% TFA על ידי צנטריפוגה.
    6. חומצי את הדגימה ל- pH 4 או נמוך יותר באמצעות חומצה אצטית קרחונית. בדוק את ה- pH עם רצועות pH כמו בעבר כדי למזער את אובדן הדגימה.
    7. טען את כל הדגימה על דיסק השרף על ידי צנטריפוגה איטית.
    8. לשטוף את הדגימה עם 80 μL של מים כיתה MS + 0.1% TFA על ידי צנטריפוגה.
    9. יש להכניס את הדגימה לצינור נקי של 1.5 מ"ל על ידי שטיפה של 70 מיקרוליטר של 75% אצטוניטריל ו-0.5% חומצה אצטית על ידי צנטריפוגה איטית. ניתן להשתמש בזמן צנטריפוגה נוסף כדי להבטיח שנפח הדגימה המלא מדולל מקצה הבמה. זה בסדר אם השרף מתייבש עם זמן הצנטריפוגה הנוסף, מכיוון שהוא כבר לא נחוץ מעבר לפליטת הדגימה.
    10. יבשו כל דגימה לחלוטין ברכז ואקום.
      הערה: ניתן לאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות להמשיך (נקודת עצירת ביניים).
    11. לניתוח LC-MS/MS, יש לשחזר את הדגימות בנפח של ממס A (0.1% חומצה פורמית) מפרוטוקול הכרומטוגרפיה הנוזלית (LC) הנותן את הריכוז הסופי של 0.4 מיקרוגרם/מיקרוליטר (כלומר, להמיס 20 מיקרוגרם של היסטונים ב-50 מיקרוליטר של ממס A).

2. ממשק תוכנת TIMS

  1. בחר בכרטיסיה לוח מחוונים ועבור להפעלה (ודא ששם המכשיר מסומן בירוק) (איור 2).
  2. אמת פרמטרים של TIMS (איור 2).
  3. אמת את הגדרות MS (תחילת סריקה, סוף סריקה, קוטביות יונים, מצב סריקה) (איור 2).
  4. אמת הגדרות TIMS (מצב, התחלת ניידות, סיום ניידות, זמן רמפה, זמן צבירה, מחזור פעילות, קצב רמפה, קצב MS, ממוצע MS וכיול אוטומטי) (איור 2).
  5. עבור אל הכרטיסייה מקור והפעל את אפשרות המזרק (Hamilton 500 μL) רק עבור שלב הכיול של TuneMix (איור 3)13.
  6. עבור אל הכרטיסיה כיול , לחץ על m/z, בחר מצב כיול ובחר את המצב (Q משופר, באופן כללי), זום (+0.01%) STD Dev (0.24) ולחץ על כיול; כאשר משיגים ציון של 100%, מקבלים (תרשים 4).
  7. עבור אל כרטיסיית הניידות וחזור על תהליך הכיול (מצב ליניארי, באופן כללי), טווח זיהוי ( +5%), רוחב (0.1 Da), STD Dev (0.1855) ולאחר מכן לחץ על כיול; כאשר אתם מקבלים ציון ≥ 98.5%, קבלו (תרשים 5).
  8. עבור אל השיטה ובחר את השיטה לשימוש; עבור דוגמה זו, נבחרה Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (איור 5).

3. LC-TIMS-PASEF-TOF MS/MS

  1. השתמש בתנאי ההפעלה האופייניים של nESI: מתח נימי של 4500 וולט, היסט לוח קצה של 800 וולט, לחץ נבולייזר של 3.0 בר, גז יבש של 10.0 ליטר לדקה, מחמם יבש של 200 מעלות צלזיוס וקצב זרימה של הזרקה של 50 מיקרוליטר לדקה.
  2. השתמש בהגדרות MS טיפוסיות: אנרגיית התנגשות 6 eV, RF התנגשות 1200 Vpp, זמן העברה של 75 μs, אחסון דחף של 5 μs.
  3. קבע את זרימת גז הסחף באמצעות הפרש הלחצים ממשפך הכניסה P1 ומשפך היציאה P2. פיצול טורי-צבירה מקבילית (PASEF) מתרחש בתא TIMS, וצובר את כל היונים המקדימים בו זמנית ולא בנפרד. לאחר מכן יונים מקדימים משתחררים בפסגות יונים צרות לעומת פסגות רחבות בהרבה בדרך כלל (קצרות בערך פי 50), מה שמגדיל את יחס האות לרעש תוך הפרדת פפטידים פולטים באמצעות ניידות14.
  4. פיתוח שיטת LC-TIMS-ToF MS/MS לניתוח פפטידי היסטון פרוטאוליטיים. שלב כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים (HPLC) המצויד בעמוד C18 (300 Å, 5 מיקרומטר, 4.6 מ"מ x 250 מ"מ) עם מכשיר TIMS-TOF MS מסחרי עם טכנולוגיית PASEF קניינית.
    הערה: גודל עמודה זה נקבע כמספק הפרדה טובה ב- pH גבוה ונמוך עבור תערובות פפטידים, בהתבסס על עבודות שפורסמו בעבר 15,16,17.
    1. הגדר את נפח ההזרקה ל- 20 μL (8 מיקרוגרם) של דגימה וקצב זרימה של 0.4 מ"ל לדקה.
    2. הפעל שיפוע LC לא ליניארי של 60 דקות באמצעות מים עם 0.1% חומצה פורמית (ממס A) ואצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית (ממס B). הגדר את השיפוע: 10% B למשך 2.7 דקות, ואז ל- 20% B ב- 5.3 דקות, 28% B ב- 4 דקות, 35% B ב- 18 דקות נוספות, ל- 40% B ב- 13 דקות, ו- 100% B ב- 2 דקות נוספות. לאחר החזקת 100% B במשך 5 דקות, להוריד את הריכוז ל 10% B ב 5 דקות ולהחזיק במשך 5 הדקות האחרונות.
  5. אמת את פליטת הדגימה מה-HPLC לתוך TIMS-TOF באמצעות יינון ננו-אלקטרוספריי (nESI) במצב יינון חיובי.

4. ניתוח נתונים

  1. זהה את רצפי הפפטידים ואת אתרי השינוי.
    1. הכינו רשימה תיאורטית של פפטידים באמצעות ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] תחת הכלי MS-digest.
      1. בצע תקציר תיאורטי תוך התחשבות בתנאי העיכול (האנזים שבו נעשה שימוש), סוגי PTM שמחפשים (למשל, מונו, די או טרימתילציה), טווח הגדלים של הפפטידים שמחפשים, כמו גם טווח זיהוי המסה והמספר הפוטנציאלי של מחשופים שהוחמצו.
  2. נתח ידנית את הנתונים שנרכשו בהתבסס על פפטידים תיאורטיים (איור 6)12.
    1. חפש את המסות במספר מצבי מטען (+1 עד +4) עבור כל פפטיד תיאורטי.
    2. לאחר הזיהוי הראשוני של כל m/z, בחר את הפסגה ואשר את MS/MS באמצעות רשימה תיאורטית של יוני פיצול המבוססים על רצף הפפטידים, כולל PTM.
      הערה: אם הניידות של הפפטיד שזוהה הייתה ידועה בעבר, גם זה אושר.
  3. חשב את השפע היחסי של PTM שונים ודווח על כל שינוי כאחוז מרצף הפפטידים שצוין.
    1. השפע היחסי של כל PTM שזוהה מחושב באמצעות המשוואה הבאה:
      שפע יחסי = שטח PTM/שטח כולל של PTM ללא שינוי ו- PTM עבור פפטיד נתון

תוצאות

תהליך עבודה פרוטאומי מלמטה למעלה (איור 7) כולל בדרך כלל את הדברים הבאים: מיצוי חלבוני המטרה מדגימה גולמית, ולאחר מכן כימות ריכוז החלבונים, ולאחר מכן שבירה, בדרך כלל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל או כרומטוגרפיה נוזלית. לאחר השבירה, החלבונים מתעכלים באמצעות אנזים פרוטאוליטי (לעתים...

Discussion

היסטונים הם חלבונים בסיסיים המווסתים את מבנה הכרומטין על ידי אינטראקציה עם דנ"א בצורה של אוקטמרים המורכבים מארבעת אבני הליבה (שניים כל אחד מ-H2A, H2B, H3 ו-H4)20. היסטונים מכילים שאריות ליזין וארגינין רבות, אשר משתנות בקלות, מה שמוביל ל-PTM נרחב המשנה את הכימיה של הכרומטין על ידי השפעה ע...

Disclosures

מלווין א. פארק ומתיו ווילטס הם עובדים של Bruker Daltonics Inc., יצרנית מכשיר timsTOF.

Acknowledgements

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס '. HRD-1547798 ומענק מס' HRD-2111661. מענקי NSF אלה הוענקו לאוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה כחלק מתוכנית המרכז למצוינות במחקר במדע וטכנולוגיה (CREST). זוהי תרומה מספר 1672 מהמכון לסביבה, תוכנית בולטת באוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה. תמיכה נוספת ניתנה על ידי המכון הלאומי לבריאות במסגרת מענק מס '. R21AI135469 לפרנסיסקו פרננדז-לימה וגרנט לא. R01HD106051 לבנג'מין א. גרסיה, כמו גם על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס '. CHE-2127882 לבנג'מין א. גרסיה. המחברים רוצים להודות על התמיכה הראשונית של ד"ר מריו גומז הרננדז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023Animal Origin-Free
1 mL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-282-300Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Conical TubesCorning352196Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette TipsThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette TipsThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical TubesCorning352070Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plateThermo Fisher Scientific12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μLAxygenP-DW-500-C-S
AcetoneSigma Aldrich179124ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OHSigma AldrichAX1303Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC columnWaters186003625XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA7906Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2Sigma AldrichC4901Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation bufferThermo Fisher Scientific13151014
Ceramic scoring waferRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Disposable Cell LiftersThermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet PestlesThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Formic acid (FA)Sigma Aldrich695076ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Glacial Acetic AcidThermo Fisher ScientificA38SAcetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur PipettesSigma AldrichBR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HClSigma Aldrich258148ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 ÅThermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep cartridgeThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2Sigma AldrichM8266Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube AdaptersGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL PartsLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientificmodel: ND3300
Nitrogen (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, InstachekMicro Essential LabJR-113Model: Hydrion
Potassium chloride, KClSigma AldrichP3911ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection CellNext Advance model: PC77
Propionic AnhydrideSigma Aldrich8.00608For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g)NuAire, model: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GelsBio-Rad4569035Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrateThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
Sodium chloride, NaClSigma AldrichS9888ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18VWR76333-134Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotorSavantmodel: SC210A
SucroseMillipore1.07651suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF Mass SpectrometerBruker Daltonicsmodel Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCASigma AldrichT06996.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma Aldrich302031Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa NanomateAdvionmodel: TR263
TrypsinProtease, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
Tube rotatorThermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

References

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved