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Resumen

Aquí, describimos la identificación de Rhodiola Crenulata a partir del hábitat, la morfología de la planta, las propiedades medicinales, las características microscópicas y la cromatografía en capa fina.

Resumen

La identificación de los materiales medicinales es la premisa y garantía de la seguridad de los medicamentos. La mayoría de los investigadores científicos están obligados a favorecer el proceso de identificación simple, rápido, efectivo y económico de las hierbas. La Rhodiola crenulata es una medicina tradicional tibetana que se cultiva a gran altitud, distribuida principalmente en las regiones chinas de Tíbet, Yunnan y Sichuan. La crenulato de Rhodiola posee múltiples bioactividades, como propiedades antiinflamatorias, antihipoxia y antioxidantes, y tiene un gran potencial de desarrollo. Con el aumento de la demanda del mercado y una rápida disminución en el contenido de recursos, una gran cantidad de productos confusos de Rhodiola crenulata han estado preocupando a las personas. Por lo tanto, este protocolo introduce un proceso estándar para la identificación de Rhodiola crenulata en el campo combinado con pruebas de laboratorio de rutina. La combinación del hábitat, las características microscópicas y la cromatografía de capa delgada sin duda identificará a Rhodiola crenulata de manera rápida, eficiente y económica, contribuyendo al desarrollo continuo de la medicina tibetana y al control de calidad de los materiales medicinales.

Introducción

La medicina herbal tiene una larga historia y una rica experiencia de aplicación en China, y fue el primer registro sistemático en el clásico herbal de Shennong1. El descubrimiento de la artemisinina aplicada a la malaria promovió el desarrollo de la medicina herbal en una nueva etapa1. El uso de la tecnología científica moderna para descubrir el mecanismo exacto de la medicina herbaria aumenta la tasa de utilización y la demanda de la medicina herbal, abriendo un nuevo mercado internacional para ella 2,3,4. Sin embargo, esto ha provocado una serie de efectos negativos. Los no profesionales tienen una comprensión vaga de las características de la fitoterapia, lo que hace que el uso de la fitoterapia se enfrente a un enorme riesgo de seguridad5.

Rhodiola crenulata, una de las plantas de la especie Rhodiola, se distribuye principalmente en el Tíbet, el noroeste de Yunnan y el oeste de Sichuan en China (Figura 1)6,7. La Rhodiola crenulata comprende salidrósido, tirosol, ácido gálico y otros compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la hipóxica a través de la función de "vigorizar el qi y promover la circulación sanguínea, limpiar el pulso y calmar el asma"8,9,10,11. La investigación de campo muestra que Rhodiola crenulata se puede encontrar en las zonas de taludes alpinos, laderas de barrancos y grietas rocosas a una altitud de 4.000-5.600 m. Su entorno de cultivo es frío, lleno de sol y radiación intensa, y pertenece al ecosistema de la pradera alpina. Rhodiola crenulata puede distribuirse en poblaciones laminares y puntuales según el terreno de crecimiento, y el flujo génico puede llevarse a cabo a través de la polinización cruzada.

El aborto polínico del género Rhodiola, la ilegalidad de la excavación y el ambiente ecológico degenerado hacen de Rhodiola crenulata una especie en peligro de extinción 6,12. En vista del alto valor medicinal de la Rhodiola crenulata, se espera que los productos falsificados fluyan hacia el mercado. Este artículo presenta el hábitat de Rhodiola crenulata y algunos métodos convenientes de identificación de laboratorio. En primer lugar, observamos el entorno de crecimiento de Rhodiola crenulata y sus propiedades medicinales. En segundo lugar, se observó la microestructura del polvo medicinal al microscopio. El último paso es el punto clave. Los componentes representativos de Rhodiola crenulata se separaron e identificaron de acuerdo con las diferentes propiedades de adsorción o disolución de estos componentes en una determinada sustancia. Los métodos de autenticación basada en el ADN o análisis metabolómico de plantas medicinales son complicados y costosos13. Estos métodos básicos, convenientes y económicos pueden identificar rápidamente la Rhodiola crenulata.

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Protocolo

Rhodiola crenulata se recolecta en la montaña nevada de Zhuoda, condado de Ganzi, prefectura autónoma tibetana de Ganzi, provincia de Sichuan, China (N 31.44570°, E 99.96086°, 4892 m). Las plantas son autentificadas como genuinas por el profesor Yi Zhang de la Escuela de Medicina Étnica de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu.

1. Colección de Rhodiola crenulata

  1. Fotografía el mapa del hábitat de Rhodiola crenulata.
  2. Fotografía toda la planta, las hojas, el cáliz y el rizoma de Rhodiola crenulata.
  3. Use una pala para limpiar las malezas y las piedras rotas dentro de 1 m de la Rhodiola crenulata para garantizar la extracción suave posterior.
  4. Desentierra la tierra con una azada hasta que se vea toda la rizosfera y recoge la raíz principal.
    NOTA: Las raíces y rizomas de Rhodiola crenulata utilizados en partes medicinales deben recolectarse en otoño, cuando los tallos de las flores se marchitan.

2. Identificación de características

  1. Observe los rasgos de apariencia de Rhodiola crenulata a simple vista: raíces y rizomas cilíndricos y cortos, superficie marrón, epidermis membranosa amarilla con un patrón rosado y rodajas de color rojo anaranjado o burdeos.
  2. Identifícalo por el olor: Da un olor fragante cuando está cerca de la nariz.
  3. Identifíquelo por su sabor: Tome un pequeño trozo de raíz en la boca, primero beba y luego mastique, tenga un sabor ligeramente amargo, luego dulce.

3. Identificación microscópica de gránulos de almidón en polvo medicinal

  1. Retire la tierra de la superficie de la Rhodiola crenulata con un cepillo, póngala en el horno a 40 °C y voltee las hierbas cada 24 h.
    NOTA: La facilidad de rotura de los materiales medicinales se considera el estándar para secar la humedad.
  2. Pulverizar los materiales medicinales secos con una máquina de polvo y filtrar el polvo medicinal con el tamiz medicado Nº 3 (véase la Tabla de Materiales).
  3. Tome un portaobjetos limpio (ver Tabla de Materiales), excave el polvo con una aguja de disección (ver Tabla de Materiales) y colóquelo uniformemente en un tercio del portaobjetos dentro de 2 mm.
  4. Use un gotero de vidrio (consulte la Tabla de materiales) para agregar una gota de agua desionizada al polvo. Use una pinza (ver Tabla de Materiales) para sostener un extremo de la cubierta de vidrio (ver Tabla de Materiales) para tocar el nivel de líquido rápidamente y cubrir el polvo.
    NOTA: Utilice una aguja anatómica para mezclar suavemente el agua y el polvo medicinal para garantizar una mezcla uniforme de la muestra. No debe haber burbujas de aire entre el portaobjetos, el polvo y la cubierta de vidrio.
  5. Abra el microscopio (consulte la tabla de materiales) y coloque el portaobjetos del paso 3.4 sobre la plataforma para asegurarlo. Ajuste la fuente de luz y la espiral de enfoque grueso para ver el polvo. Ajuste la espiral parafocal fina hasta que los tejidos se vean claramente. Cambie a un objetivo de 40x y observe los gránulos de almidón.
    NOTA: El almidón de los granos se presenta como granos simples o múltiples, y el punto umbilical aparece en forma de espiga o grieta.

4. Identificación microscópica de catéteres, células de corcho, fibras, células del parénquima de la madera y masas pigmentarias en polvo medicinal

  1. Tome un portaobjetos limpio (ver Tabla de Materiales), excave el polvo con una aguja de disección (ver Tabla de Materiales) y colóquelo en un tercio del portaobjetos.
  2. Use un gotero de vidrio (ver Tabla de Materiales) para agregar una gota de hidrato de cloral (ver Tabla de Materiales) al polvo. Tome el portaobjetos con una pinza (ver Tabla de materiales) y caliéntelo en la lámpara de alcohol tres veces, cada vez durante 1 s.
    NOTA: Se deben evitar las burbujas durante el calentamiento. El líquido permanece sin fluir, lo que indica que la penetración es completa.
  3. Use un gotero de vidrio para agregar una gota de glicerina (consulte la Tabla de materiales). Use una pinza para sostener un extremo de la cubierta de vidrio para tocar el nivel de líquido rápidamente.
  4. Abra el microscopio y coloque el portaobjetos en la plataforma para asegurarlo. Ajuste la fuente de luz y la espiral de enfoque grueso para ver el polvo. Ajuste la espiral parafocal fina hasta que los tejidos se vean claramente. Observe el catéter, las células de corcho, las fibras, las células del parénquima de la madera y el bloque de pigmento cambiando a una lente de objetivo de 40x.
    NOTA: Poligonal o poligonal largo de las células de corcho, vaso espiral con estructura helicoidal evidente, parénquima del xilema que contiene cristales de arena de oxalato cálcico y bloque de pigmento rojo o rojo parduzco.

5. Preparación de muestras cromatográficas en capa fina (TLC) de Rhodiola crenulata y su referencia

  1. Coloque el papel de pesaje en la balanza (consulte la tabla de materiales) y pese 3 g de polvo de Rhodiola crenulata.
  2. Tome el polvo en un frasco cónico de 100 ml (consulte la tabla de materiales) y agregue 25 ml de metanol con una pipeta de vientre grande (consulte la tabla de materiales). Coloque el frasco cónico en el instrumento ultrasónico. Ajuste la potencia a 250 W, la frecuencia a 40 kHz y el tiempo a 30 min (consulte la Tabla de materiales) y encienda el instrumento.
    NOTA: El propósito del instrumento de ultrasonido es asegurar que el polvo de Rhodiola crenulata se disuelva completamente sin afectar los resultados de los experimentos cromatográficos de capa delgada posteriores.
  3. Retire la botella cónica y enjuague la botella exterior con agua corriente hasta que esté a temperatura ambiente (RT).
  4. Aspirar 800 μL de líquido preparado en el paso 5.3 con una jeringa de 1 mL. Filtrar con una membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabla de materiales) y recoger 400 μL de solución de muestra de Rhodiola crenulata en un frasco de muestra cromatográfica.
  5. Pesar y agregar 2 mg de salidrósido, tirosol y ácido gálico (ver Tabla de materiales) en 3 frascos cónicos separados de 100 ml, respectivamente. Agregue 25 ml de metanol con una pipeta de vientre grande en cada botella cónica.
  6. Coloque la botella cónica en el instrumento ultrasónico, ajuste la potencia a 250 W, la frecuencia a 40 kHz y el tiempo a 30 min, y repita el paso 5.3 (consulte la Tabla de materiales).
  7. Aspirar 800 μL de líquido preparado en el paso 5.6 con una jeringa de 1 mL. Filtrar con una membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabla de materiales) y recolectar 400 μL de solución estándar de salidrósido, tirosol y ácido gálico en los frascos de muestra cromatográfica correspondientes.

6. Identificación TLC

  1. Pipeta triclorometano (5 mL), acetato de etilo (4 mL), metanol (2 mL) y ácido fórmico (0,5 mL) (ver Tabla de Materiales). Agregue a un lado del cilindro de cromatografía de doble tanque (consulte la Tabla de materiales), agite y mezcle uniformemente. Cubra la culata superior.
  2. Coloque el ácido gálico, el salidrósido, la solución estándar de tirosol y la solución de Rhodiola crenulata en la gradilla de muestras en las posiciones A1-A4.
  3. Coloque la lámina de silicona de 5 cm x 10 cm (ver Tabla de Materiales) sobre la mesa de muestreo. Encienda la máquina de muestreo automático (consulte la Tabla de materiales) y abra la válvula de control de aire.
  4. Abra el software visionCATS (consulte la tabla de materiales). Haga clic en Nueva > Nueva carpeta ( denominada Rhodiola crenulata sample test) > Aceptar. Haga clic en Nuevo método (nombre prueba de muestra de Rhodiola crenulata ) > Aceptar > ATS 4.
  5. Haga clic en Finalizar definición de paso. Haga clic en Asignación de pista para editar la descripción (muestra de ácido gálico, salidrósido, tirosol y Rhodiola crenulata ).
  6. Haga clic en Pasos de HPTLC. Establezca los parámetros de la capa fina (5 cm x 10 cm). Seleccione Tipo de aplicación (banda), establezca los parámetros (Tabla 1) y haga clic en el botón Aceptar .
  7. Calidad de llenado/enjuague abierta. Marque Rellenar solo volumen programado. Ajuste el nivel inferior del vial (mm) a 0,5 y haga clic en el botón Aceptar.
  8. Haga clic en Ejecutar método.
  9. Haga clic en el botón Asignación de pistas , marque Centro y establezca los parámetros (Tabla 2).
  10. Haga clic en el botón Continuar para el muestreo automático.
  11. Apague la máquina de muestreo automático y la válvula de aire. Retire la lámina de silicona de la máquina de muestreo automático.
  12. Coloque la lámina de silicona en el otro lado del cilindro de cromatografía de doble tanque en el paso 6.1, cubra la culata superior y sature previamente durante 20 minutos.
  13. Sujete suavemente el extremo superior de la placa de capa delgada con una pinza, coloque rápidamente la lámina de silicona en el agente de desarrollo y cubra la culata superior.
    NOTA: Saque la lámina de silicona cuando el borde frontal desplegado esté a 0,5-1,0 cm del extremo superior de la placa de capa delgada.
  14. Después de que el solvente orgánico se evapore, rocíe la solución cromogénica sobre la superficie de la lámina de silicona a temperatura ambiente para obtener resultados cromogénicos.
    NOTA: La solución cromogénica es una solución acuosa que contiene un 2% de FeCl3 y un 1% de K3[Fe(CN)6].

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Resultados

Este protocolo experimental describe la identificación y recolección de crenulato de Rhodiola en el campo. La crenula de Rhodiola tiende a vivir en las zonas de talud alpino, laderas de barrancos y grietas rocosas a grandes altitudes. El hábitat, la planta entera, la flor y las hojas de Rhodiola crenulate se pueden mostrar en la Figura 2. La crenula de Rhodiola tiene un rizoma de color marrón rojizo (Figura 3A). En la

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Discusión

Hay más de 90 especies de plantas de Rhodiola en el mundo, y más del 60% de todas las especies se encuentran en China, las comunes incluyen Rhodiola crenulata, Rhodiola rosea, Rhodiolas achalinensis y Rhodiola algida17. Rhodiola crenulata, registrada en la primera parte de la Farmacopea China (2020), es una medicina tradicional tibetana cultivada a gran altitud. La demanda del mercado de Rhodiola crenulata aumenta cada año, por lo que garantizar el ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973569, 82274207 y 82104533), el Proyecto de Promoción de la Investigación Xinglin Scholar de la Universidad de Chengdu de MTC (XKTD2022013) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm millipore filterMilliporeSLGP033RB
Automatic sampling machineCAMAGATS 4
Chloral hydrateFuzhou Brunei Technology Co., LtdST1002
Chromatographic sample bottlesZhejiang ALWSCI Technology Co., LtdC0000008
Conical flaskSichuan Shubo Co., Ltd1121
Cover glassCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd10211818c
Dissecting needleShanghai Bingyu Fluid Technology Co., LtdBY-5026
Electronic balanceSHIMADZUATX124
Ethyl acetateChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2022120901
Formic acidChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021110801
Gallic acidChengdu Herbpurify Co., LtdM-017
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618
High speed  crusherBeijing Zhongxingweiye Instrument Co., LtdFW-100
MethanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
MicroscopeChongqing Oprec Nistrument Co.,  LtdB203
Microscope slideCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
OvenShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Pharmacopoeia sieveHangzhou Xingrun sieve factory572423281330
PipetteChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120302008
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., LtdH-040
Saturate tank Yancheng Liegu Technology Co., Ltd10*20 P-1
Silica gel plateYantai Jiangyou Silica Gel Development  Co., LtdHSG20211227
TrichloromethaneChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20221013-1
Tweezer Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
TyrosolChengdu Herbpurify Co., LtdL-042
Ultrasound equipmentNingbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., LtdSB-8200DTS
Volumetric pipetChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120301006

Referencias

  1. Zhang, J., et al. Traditional herbal medicine and nanomedicine: Converging disciplines to improve therapeutic efficacy and human health. Advanced Drug Delivery Reviews. 178, 113964(2021).
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  3. Li, F. S., Weng, J. K. Demystifying traditional herbal medicine with modern approach. Nature Plants. 3, 17109(2017).
  4. da Fonseca, L. R., et al. Herbal medicinal products from Passiflora for anxiety: An unexploited potential. The Scientific World Journal. 2020, 6598434(2020).
  5. Aziato, L., Antwi, H. O. Facilitators and barriers of herbal medicine use in Accra, Ghana: an inductive exploratory study. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16, 142(2016).
  6. Tao, H., et al. Rhodiola species: A comprehensive review of traditional use, phytochemistry, pharmacology, toxicity, and clinical study. Medicinal Research Reviews. 39 (5), 1779-1850 (2019).
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  8. Xie, N. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240(2022).
  9. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278(2022).
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