JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы опишем идентификацию родиолы кренулатной по среде обитания, морфологию растений, лекарственные свойства, микроскопические особенности и тонкослойную хроматографию.

Аннотация

Идентификация лекарственного сырья является предпосылкой и гарантией безопасности лекарственного средства. Большинство научных исследователей склоняются к простому, быстрому, эффективному и недорогому процессу идентификации растительных препаратов. Родиола зубчатая - это традиционная тибетская медицина, выращиваемая на больших высотах, в основном распространенная в Тибете, Юньнани и Сычуань в Китае. Родиола зубчатая обладает множеством биологических свойств, таких как противовоспалительные, антигипоксические и антиоксидантные свойства, и имеет большой потенциал для развития. В связи с растущим рыночным спросом и быстрым снижением ресурсосодержания, большое количество запутанных продуктов родиолы кренулатной беспокоит людей. Таким образом, этот протокол вводит стандартный процесс идентификации родиолы кренулаты в полевых условиях в сочетании с рутинным лабораторным тестированием. Сочетание среды обитания, микроскопических характеристик и тонкослойной хроматографии, несомненно, позволит быстро, эффективно и экономично идентифицировать родиолу кренулату , способствуя постоянному развитию тибетской медицины и контролю качества лекарственных материалов.

Введение

Фитотерапия имеет долгую историю и богатый опыт применения в Китае, и это была первая систематическая запись в классической траве Шэньнуна1. Открытие артемизинина применительно к малярии способствовало развитию фитотерапии на новой ступени1. Использование современных научных технологий для раскрытия точного механизма фитотерапии повышает коэффициент использования и спрос на фитотерапию, открывая для нее новый международный рынок 2,3,4. Однако это привело к ряду негативных последствий. Непрофессионалы имеют смутное представление о характеристиках фитотерапии, что ставит использование фитотерапии с огромным риском для безопасности5.

Родиола зубчатая, одно из растений вида Родиола, в основном распространена в Тибете, на северо-западе провинции Юньнань и на западе провинции Сычуань в Китае (рис. 1)6,7. Родиола кренулата содержит салидрозид, тирозол, галловую кислоту и другие соединения для лечения заболеваний, связанных с гипоксией, благодаря функции «оживления ци и улучшения кровообращения, очищения пульса и успокоения астмы»8,9,10,11. Полевые исследования показывают, что родиола зубчатая встречается в альпийских осыпных зонах, овражных склонах и расщелинах скал на высоте 4000-5600 м. Среда его произрастания холодная, полная солнечного света и интенсивной радиации, и он принадлежит к экосистеме альпийских лугов. Родиола кренулатная может быть распределена в пластинчатых и точечных популяциях в зависимости от рельефа произрастания, а поток генов может осуществляться путем перекрестного опыления.

Пыльцевой аборт рода Rhodiola, незаконная выемка и деградация экологической среды делают Rhodiola crenulata исчезающим видом 6,12. В связи с высокой лекарственной ценностью родиолы кренистой (Rhodiola crenulata) ожидается поступление на рынок контрафактной продукции. В данной статье представлен ареал обитания родиолы кренулатной и некоторые удобные лабораторные методы идентификации. Во-первых, мы наблюдали за средой произрастания родиолы кренулатной и ее лечебными свойствами. Во-вторых, микроструктуру лекарственного порошка наблюдали под микроскопом. Последний шаг является ключевым моментом. Репрезентативные компоненты родиолы кренулатной были разделены и идентифицированы в соответствии с различными адсорбционными или растворяющими свойствами этих компонентов в определенном веществе. Методы аутентификации или метаболомного анализа лекарственных растений на основе ДНК сложны и дорогостоящи13. Эти простые, удобные и экономичные методы позволяют быстро определить родиолу кренитовидную.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Родиола зубчатая (Rhodiola crenulata) добывается на снежной горе Чжуода, уезд Ганьцзы, Ганьцзы-Тибетский автономный округ, провинция Сычуань, Китай (N 31.44570°, E 99.96086°, 4892 м). Подлинность растений подтверждена профессором И Чжаном из Школы этнической медицины Университета традиционной китайской медицины Чэнду.

1. Коллекция родиолы кренулатной

  1. Сфотографируйте карту местообитаний родиолы кренистой.
  2. Сфотографируйте все растение, листья, чашечку и корневище родиолы городчатой.
  3. Используйте лопату, чтобы очистить сорняки и битые камни в пределах 1 м от родиолы кренулатной , чтобы обеспечить последующую плавную добычу.
  4. Перекопайте почву мотыгой, пока не будет видна вся ризосфера, и соберите стержневой корень.
    ПРИМЕЧАНИЕ:Корни и корневища родиолы кренулаты , используемые в лекарственных частях, следует собирать осенью, когда цветоносы увядают.

2. Идентификация характеристик

  1. Невооруженным глазом наблюдают за особенностями внешнего вида родиолы кренулатой : цилиндрические и короткие стержневые корни и корневища, коричневая поверхность, пленчато-желтый эпидермис с розовым рисунком, оранжево-красные или бордовые срезы.
  2. Определите его по запаху: он дает ароматный запах, когда находится рядом с носом.
  3. Определите его по вкусу: возьмите небольшой кусочек корня в рот, сначала выпейте глотком, а затем пожуйте, на вкус слегка горьковатый, затем сладкий.

3. Микроскопическая идентификация гранул крахмала в лекарственном порошке

  1. Удалите кистью почву с поверхности родиолы кренулятной , поставьте в духовку при температуре 40 °C и переворачивайте травы каждые 24 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легкость измельчения лекарственных материалов считается стандартом для высыхания влаги.
  2. Высушенные лекарственные материалы измельчают с помощью порошковой машины и фильтруют лекарственный порошок с помощью лечебного сита No 3 (см. таблицу материалов).
  3. Возьмите чистое предметное стекло (см. Таблицу материалов), выкопайте порошок препарирующей иглой (см. Таблицу материалов) и равномерно поместите его на одну треть предметного стекла в пределах 2 мм.
  4. С помощью стеклянной пипетки (см. Таблицу материалов) добавьте в порошок каплю деионизированной воды. Используйте пинцет (см. Таблицу материалов), чтобы удерживать один конец покровного стекла (см. Таблицу материалов), чтобы быстро коснуться уровня жидкости и покрыть порошок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте анатомическую иглу для аккуратного смешивания воды и лекарственного порошка, чтобы обеспечить равномерное смешивание образца. Между предметным стеклом, порошком и покровным стеклом не должно быть пузырьков воздуха.
  5. Откройте микроскоп (см. Таблицу материалов) и поместите предметное стекло в шаге 3.4 на платформу, чтобы закрепить его. Отрегулируйте источник света и спираль грубой фокусировки, чтобы увидеть порошок. Отрегулируйте тонкую парафокальную спираль до тех пор, пока ткани не станут четко видны. Переключитесь на объектив 40x и наблюдайте за гранулами крахмала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крахмал Зерна представляют собой одно или несколько зерен, а пупочная точка выглядит как елочка или трещина.

4. Микроскопическая идентификация катетеров, пробковых клеток, волокон, клеток паренхимы древесины и пигментных масс в лекарственном порошке

  1. Возьмите чистое предметное стекло (см. Таблицу материалов), выкопайте порошок препарирующей иглой (см. Таблицу материалов) и поместите его на одну треть предметного стекла.
  2. С помощью стеклянной пипетки (см. Таблицу материалов) добавьте в порошок каплю хлоралгидрата (см. Таблицу материалов). Возьмите предметное стекло пинцетом (см. Таблицу материалов) и нагрейте его в спиртовой лампе три раза, каждый раз в течение 1 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время нагрева следует избегать образования пузырьков. Жидкость остается нетекущей, указывая на то, что проникновение завершено.
  3. Стеклянной пипеткой добавьте каплю глицерина (см. Таблицу материалов). Используйте пинцет, чтобы удерживать один конец покровного стекла, чтобы быстро коснуться уровня жидкости.
  4. Откройте микроскоп и поместите предметное стекло на платформу, чтобы закрепить его. Отрегулируйте источник света и спираль грубой фокусировки, чтобы увидеть порошок. Отрегулируйте тонкую парафокальную спираль до тех пор, пока ткани не станут четко видны. Наблюдайте за катетером, пробковыми клетками, волокнами, клетками древесной паренхимы и пигментным блоком, переключившись на объектив с 40-кратным увеличением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многоугольный или длинный многоугольник пробковых клеток, спиральный сосуд с очевидной спиральной структурой, паренхима ксилемы, содержащая кристаллы песка оксалата кальция и красный или коричневато-красный пигментный блок.

5. Подготовка тонкослойных хроматографических (ТСХ) образцов родиолы кренулатной и ее эталона

  1. Положите бумагу для взвешивания на весы (см. Таблицу материалов) и взвесьте 3 г порошка родиолы кренистой.
  2. Возьмите порошок в коническую бутылку объемом 100 мл (см. Таблицу материалов) и добавьте 25 мл метанола с помощью большой пипетки для живота (см. Таблицу материалов). Поместите коническую бутылку в ультразвуковой прибор. Установите мощность 250 Вт, частоту 40 кГц и время 30 минут (см. Таблицу материалов) и включите прибор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью ультразвукового прибора является обеспечение полного растворения порошка родиолы кренулата, не влияя на результаты последующих тонкослойных хроматографических экспериментов.
  3. Снимите коническую бутылку и промойте внешнюю бутылку проточной водой до комнатной температуры (RT).
  4. Отсасывайте 800 мкл жидкости, приготовленной на этапе 5.3, шприцем объемом 1 мл. Отфильтруйте с помощью микропористой фильтрующей мембраны 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) и соберите 400 мкл промежуточного раствора родиолы кренулатной в хроматографический флакон для образцов.
  5. Взвесьте и добавьте 2 мг салидрозида, тирозола и галловой кислоты (см. таблицу материалов) в 3 отдельных конических флакона по 100 мл соответственно. Добавьте 25 мл метанола с помощью большой пипетки в каждую коническую бутылку.
  6. Поместите конический флакон в ультразвуковой прибор, установите мощность 250 Вт, частоту 40 кГц и время 30 мин и повторите шаг 5.3 (см. Таблицу материалов).
  7. Отсасывайте 800 мкл жидкости, приготовленной на этапе 5,6, с помощью шприца объемом 1 мл. Отфильтруйте с помощью микропористой фильтрующей мембраны 0,22 мкм (см. таблицу материалов) и соберите 400 мкл стандартного раствора салидрозида, тирозола и галловой кислоты в соответствующие флаконы для хроматографических образцов.

6. Идентификация TLC

  1. Пипетка трихлорметан (5 мл), этилацетат (4 мл), метанол (2 мл) и муравьиная кислота (0,5 мл) (см. таблицу материалов). Добавьте на одну сторону цилиндра для хроматографии с двумя резервуарами (см. Таблицу материалов), встряхните и равномерно перемешайте. Накройте верхнюю головку блока цилиндров.
  2. Поместите галловую кислоту, салидрозид, стандартный раствор тирозола и раствор родиолы кренулатой на штатив для образцов в положениях A1–A4.
  3. Положите силиконовый лист размером 5 см x 10 см (см. Таблицу материалов) на стол для отбора проб. Запустите автоматическую машину для отбора проб (см. Таблицу материалов) и откройте клапан управления воздухом.
  4. Откройте программное обеспечение visionCATS (см. Таблицу материалов). Нажмите кнопку «Создать» > «Новая папка » (с именем « Образец теста на родиолу кренулату ») > кнопку «ОК». Нажмите «Новый метод » (название «Образец теста на родиолу кренулату ») > «ОК » > ATS 4.
  5. Нажмите кнопку Finish Step Definition. Щелкните Отследить назначение, чтобы отредактировать описание (образец галловой кислоты, салидрозида, тирозола и родиолы кренулаты).
  6. Щелкните Шаги ВЭТСХ. Установите параметры тонкого слоя (5 см х 10 см). Выберите Application Type (band), задайте параметры (Таблица 1) и нажмите кнопку OK.
  7. Качество открытого наполнения/промывки. Установите флажок Заполнять только запрограммированный объем. Установите уровень дна флакона (мм) на 0,5 и нажмите кнопку OK.
  8. Нажмите кнопку Execute Method.
  9. Нажмите кнопку Track Assignment , установите флажок Center (Центрировать) и задайте параметры (Таблица 2).
  10. Нажмите кнопку «Продолжить » для автоматической выборки.
  11. Выключите автоматическую пробоотборную машину и воздушный клапан. Снимите силиконовый лист с автоматической машины для отбора проб.
  12. Поместите силиконовый лист в другую сторону хроматографического цилиндра с двойным баком на шаге 6.1, накройте верхнюю головку блока цилиндров и предварительно насыщайте в течение 20 минут.
  13. Аккуратно зажмите пинцетом верхний конец тонкослойной пластины, быстро вставьте силиконовый лист в проявитель и накройте верхнюю головку блока цилиндров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выньте силиконовый лист, когда раскрывающийся передний край будет находиться на расстоянии 0,5-1,0 см от верхнего края тонкослойной пластины.
  14. После того, как органический растворитель испарится, распылите хромогенный раствор на поверхность силиконового листа при комнатной температуре, чтобы получить хромогенные результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хромогенный раствор представляет собой водный раствор, содержащий 2% FeCl3 и 1% K3[Fe(CN)6].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом экспериментальном протоколе описывается идентификация и сбор родиолы зубчатой в полевых условиях. Родиола зубчатая , как правило, обитает в альпийских осыпных зонах, на склонах оврагов и в расщелинах скал на больших высотах. Среда обитания, целое растение, цветок и лист...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В мире насчитывается более 90 видов родиолы, и более 60% всех видов встречаются в Китае, распространены такие распространены, как родиола кренистая, родиола розовая, родиолас ахалиненский и родиола белая17. Родиола кренистая, зафиксированная в первой части...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81973569, 82274207 и 82104533), Проектом содействия научным исследованиям Xinglin Университета ТКМ в Чэнду (XKTD2022013) и Ключевой программой исследований и разработок Нинся (2023BEG02012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm millipore filterMilliporeSLGP033RB
Automatic sampling machineCAMAGATS 4
Chloral hydrateFuzhou Brunei Technology Co., LtdST1002
Chromatographic sample bottlesZhejiang ALWSCI Technology Co., LtdC0000008
Conical flaskSichuan Shubo Co., Ltd1121
Cover glassCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd10211818c
Dissecting needleShanghai Bingyu Fluid Technology Co., LtdBY-5026
Electronic balanceSHIMADZUATX124
Ethyl acetateChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2022120901
Formic acidChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021110801
Gallic acidChengdu Herbpurify Co., LtdM-017
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618
High speed  crusherBeijing Zhongxingweiye Instrument Co., LtdFW-100
MethanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
MicroscopeChongqing Oprec Nistrument Co.,  LtdB203
Microscope slideCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
OvenShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Pharmacopoeia sieveHangzhou Xingrun sieve factory572423281330
PipetteChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120302008
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., LtdH-040
Saturate tank Yancheng Liegu Technology Co., Ltd10*20 P-1
Silica gel plateYantai Jiangyou Silica Gel Development  Co., LtdHSG20211227
TrichloromethaneChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20221013-1
Tweezer Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
TyrosolChengdu Herbpurify Co., LtdL-042
Ultrasound equipmentNingbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., LtdSB-8200DTS
Volumetric pipetChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd120301006

Ссылки

  1. Zhang, J., et al. Traditional herbal medicine and nanomedicine: Converging disciplines to improve therapeutic efficacy and human health. Advanced Drug Delivery Reviews. 178, 113964(2021).
  2. Yin, R., et al. The positive role and mechanism of herbal medicine in Parkinson's Disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 9923331(2021).
  3. Li, F. S., Weng, J. K. Demystifying traditional herbal medicine with modern approach. Nature Plants. 3, 17109(2017).
  4. da Fonseca, L. R., et al. Herbal medicinal products from Passiflora for anxiety: An unexploited potential. The Scientific World Journal. 2020, 6598434(2020).
  5. Aziato, L., Antwi, H. O. Facilitators and barriers of herbal medicine use in Accra, Ghana: an inductive exploratory study. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16, 142(2016).
  6. Tao, H., et al. Rhodiola species: A comprehensive review of traditional use, phytochemistry, pharmacology, toxicity, and clinical study. Medicinal Research Reviews. 39 (5), 1779-1850 (2019).
  7. Wang, Y., et al. The dietary supplement Rhodiola crenulata extract alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice through anti-inflammation, mediating gut barrier integrity and reshaping the gut microbiome. Food & Function. 12 (7), 3142-3158 (2021).
  8. Xie, N. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240(2022).
  9. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278(2022).
  10. Ma, D., et al. Chemical characteristics of Rhodiola Crenulata and its mechanism in acute mountain sickness using UHPLC-Q-TOF-MS/MS combined with network pharmacology analysis. Journal of Ethnopharmacology. 294, 115345(2022).
  11. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801(2019).
  12. d'Avigdor, E., Wohlmuth, H., Asfaw, Z., Awas, T. The current status of knowledge of herbal medicine and medicinal plants in Fiche, Ethiopia. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine. 10, 38(2014).
  13. Sánchez, M., González-Burgos, E., Divakar, P. K., Gómez-Serranillos, M. P. DNA-based authentication and metabolomics analysis of medicinal plants samples by DNA barcoding and ultra-high-performance liquid chromatography/triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-MS). Plants (Basel, Switzerland). 9 (11), 1601(2020).
  14. Rhodiola renulata (Hook.fil & Thomson) H.Ohba. , Available from: https://www.gbif.org/species/4200529 (2023).
  15. Plant + data center. , Available from: https://www.iplant.cn/ (2023).
  16. Chinese virtual herbarium. , Available from: https://www.cvh.ac.cn/ (2023).
  17. Cunningham, A. B. There "ain't no mountain high enough"?: The drivers, diversity and sustainability of China's Rhodiola trade. Journal of Ethnopharmacology. 252, 112379(2020).
  18. Wang, Q., Ruan, X., Jin, Z. H., Yan, Q. C., Tu, S. Identification of Rhodiola species by using RP-HPLC. Journal of Zhejiang University. Science. B. 6 (6), 477-482 (2005).
  19. Dong, X., Guo, Y., Xiong, C., Sun, L. Evaluation of two major Rhodiola species and the systemic changing characteristics of metabolites of Rhodiola crenulata in different altitudes by chemical methods combined with UPLC-QqQ-MS-based metabolomics. Molecules. 25 (18), 4062(2020).
  20. Zhao, W., et al. HPLC fingerprint differentiation between natural and ex situ populations of Rhodiola sachalinensis from Changbai Mountain, China. PloS One. 9 (11), 112869(2014).
  21. Yu, Y. Y. Quality evaluation of Tibetan medicine Rhodiolae crenulatae radix et rhizome based on sensory recognition and near infrared spectrum analysis. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. , Chinese Master's Thesis (2020).
  22. Lv, X. M. Simultaneous determination of 5 chemical components in 3 kinds of Rhodiola rosea by HPLC. China Pharmacy. 29 (18), 2515-2519 (2018).
  23. Dong, T., Sha, Y., Liu, H., Sun, L. Altitudinal variation of metabolites, mineral elements and antioxidant activities of Rhodiola crenulata (Hook.f. & Thomson) H.Ohba. Molecules. 26 (23), 7383(2021).
  24. Ma, D., et al. Application of UHPLC fingerprints combined with chemical pattern recognition analysis in the differentiation of six Rhodiola species. Molecules. 26 (22), 6855(2021).
  25. Li, X. H., et al. Metabolic discrimination of different Rhodiola species using 1H-NMR and GEP combinational chemometrics. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 67 (2), 81-87 (2019).
  26. Liu, Y., et al. Identification of Hippophae species (Shaji) through DNA barcodes. Chinese Medicine. 10, 28(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE200

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены