El establecimiento de un modelo de ortodoncia maxilar murina

Resumen

Aquí demostramos paso a paso un protocolo de movimiento dental de ortodoncia manejable operado en un modelo maxilar murino. Con la explicación explícita de cada paso y la demostración visual, los investigadores pueden dominar este modelo y aplicarlo a sus necesidades experimentales con algunas modificaciones.

Resumen

Debido a la falta de protocolos reproducibles para establecer un modelo de ortodoncia maxilar murina, presentamos un protocolo confiable y reproducible para proporcionar a los investigadores una herramienta factible para analizar el remodelado óseo asociado a la carga mecánica. Este estudio presenta un diagrama de flujo detallado, además de diferentes tipos de diagramas esquemáticos, fotos de operaciones y videos. Realizamos este protocolo en 11 ratones adultos de tipo ancho C57/B6J y recolectamos muestras en los días postoperatorios 3, 8 y 14. La micro-TC y los datos histopatológicos han demostrado el éxito de los movimientos dentales junto con el remodelado óseo mediante este protocolo. Además, de acuerdo con los resultados de la micro-TC en los días 3, 8 y 14, hemos dividido el modelado óseo en tres etapas: etapa de preparación, etapa de resorción ósea y etapa de formación ósea. Se espera que estas etapas ayuden a los investigadores que se ocupan de las diferentes etapas a establecer el tiempo de recolección de muestras de manera razonable. Este protocolo puede dotar a los investigadores de una herramienta para llevar a cabo análisis regenerativos del remodelado óseo.

Introducción

El hueso es un tejido reconstruido altamente activo que adapta su tamaño, forma y propiedades a lo largo de la vida del individuo ^1,2. Además de las hormonas, el envejecimiento, la nutrición y otros factores biológicos o bioquímicos³, la idea de que la carga mecánica es el factor más determinante ha obtenido una aceptación general ^4,5. En algunas circunstancias con carga mecánica anormal, el desequilibrio entre la resorción ósea y la formación ósea puede conducir a una remodelación ósea anormal y trastornos óseos. Las enfermedades óseas como la osteoporosis por desuso y la pérdida ósea durante el reposo en cama a largo plazo o en presencia de microgravedad en vuelos espaciales tienen una estrecha relación con la carga mecánica anormal ^6,7,8.

La carga mecánica también se ha utilizado para tratar enfermedades relacionadas con los huesos, como el tratamiento de distracción y el tratamiento de ortodoncia. El tratamiento de distracción se ha utilizado en enfermedades del desarrollo como la craneosinostosis y la hipoplasia mandibular ^9,10, mientras que el tratamiento de ortodoncia se ha utilizado ampliamente para rectificar la posición anormal de los dientes y cualquier maloclusión¹¹. El núcleo del tratamiento de ortodoncia es también el manejo de la carga mecánica. Cuando el tejido óseo es sometido a carga mecánica, se induce un proceso de remodelación ósea altamente coordinado mediante el acoplamiento de la resorción ósea seguido de la formación de hueso, que puede mover los dientes para lograr el propósito ortodóncico^12,13.

Aunque el tratamiento de ortodoncia se ha aplicado ampliamente en la práctica clínica, ya que nuestro conocimiento de los efectos biológicos de la carga mecánica es limitado, los resultados del tratamiento de ortodoncia son incontrolables. Para superar estas limitaciones, se han establecido varios modelos animales como ratón, rata, conejo, gato, perro, mono y cerdo para investigar el mecanismo subyacente de la remodelación ósea inducida por la carga mecánica (Tabla 1)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24^, 25,26,27,28,29,30,31,32. Los animales grandes como perros, monos y cerdos tienen algunas ventajas sobre los animales pequeños en la operación de ortodoncia: tienen dientes y dentición más parecidos a los humanos, por lo que el procedimiento quirúrgico es fácil de replicar en humanos. Además, una visión amplia puede reducir la dificultad de la operación y posibilitar la aplicación de una variedad de esquemas de ortodoncia^33,34. Sin embargo, los animales grandes son difíciles de obtener, lo que genera desafíos relacionados con el tamaño de la muestra y están sujetos a restricciones éticas³⁵. Además, los procedimientos de extracción rutinarios y los instrumentos complejos dificultan la realización de los experimentos, por lo que rara vez se utilizan animales grandes.

En tales circunstancias, los roedores se utilizan principalmente para establecer modelos de ortodoncia. Entre estos modelos, las ratas y los conejos tienen menor dificultad de operación y más esquemas de movimiento de los dientes en comparación con los ratones. Sin embargo, el modelo murino tiene la ventaja única de que hay un gran número de ratones modificados genéticamente disponibles, lo que es especialmente crucial para investigar los mecanismos subyacentes³⁶. Sin embargo, el modelo murino es el modelo más difícil de manipular debido a su pequeño tamaño. Revisando los métodos actuales, mover el primer molar en la dirección mesial es el único método práctico para un modelo de ortodoncia. Se utilizan principalmente dos dispositivos para mover el resorte helicoidal y la banda elástica. Usar una banda elástica es más fácil, pero la fuerza de ortodoncia varía mucho, lo que dificulta la obtención de resultados estables.

Xu et ^al.15 han establecido un modelo murino con un muelle helicoidal en la mandíbula. Sin embargo, debido a la movilidad de la mandíbula y a la naturaleza obstructiva de la lengua, la operación en el maxilar es siempre la primera opción tanto para consideraciones intraoperatorias como postoperatorias. Taddei et ^al.16 describieron un protocolo más detallado en el maxilar murino hace 10 años y se deben añadir más detalles visuales y pelúcidos. En resumen, este protocolo ha descrito sistemáticamente un protocolo detallado de movimiento dental ortodóncico en un modelo maxilar murino para ayudar a los investigadores a dominar el método de modelado de forma estandarizada y permitir la evaluación comparativa entre diferentes estudios.

Protocolo

Los procedimientos con animales en este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). En este estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6 (véase la Tabla de materiales). Este protocolo añade carga mecánica al primer molar maxilar derecho (M1) para el movimiento mesial, donde se induce un proceso de remodelación ósea altamente coordinado mediante el acoplamiento de la resorción ósea y la formación ósea (Figura 1).

1. Preparación preoperatoria

1. Artículos quirúrgicos
   1. Prepare los siguientes artículos quirúrgicos para la operación: plataforma quirúrgica (Figura 2A), sujetador (Figura 2B), instrumentos quirúrgicos (Figura 2C y Figura Suplementaria S1), suministros de ortodoncia (Figura 2C) y suministros de restauración dental (Figura 2D).
      NOTA: El resorte helicoidal personalizado está hecho a medida y proporciona una fuerza de 10cN cuando se estira a 10 mm.
2. Esterilización
   1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos en autoclave y todos los artículos quirúrgicos con irradiación ultravioleta durante al menos 30 min.
3. Anestesia
   1. Anestesiar al ratón mediante la administración de ketamina (100 mg/kg) y diazepam (5 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.
   2. Aplique ungüento veterinario en los ojos del murino con un bastoncillo de algodón para evitar la sequedad ocular.
   3. Proceda con la cirugía solo cuando el ratón no responda cuando se le pellizquen los dedos de los pies con fórceps.

2. Proceso quirúrgico

1. Extienda y pegue con cinta adhesiva las extremidades del ratón anestesiado en posición supina a la plataforma quirúrgica con cinta adhesiva.
2. Coloque una aguja de 27 G a cada lado por encima de la cabeza y otra aguja de 27 G a cada lado por debajo de la axila.
3. Enrolle una banda elástica alrededor de las dos agujas anteriores y los incisivos superiores y otra alrededor de otras dos agujas y los incisivos inferiores. Cambie las posiciones de la aguja para controlar el grado de apertura y la orientación de la boca (Figura 3A).
   NOTA: Para la operación de movimiento dental de ortodoncia, mantenga la boca abierta al máximo antes de que el buccinador se apriete por completo. La lengua debe ser tirada hacia el lado no quirúrgico para exponer el campo quirúrgico y prevenir la isquemia.
4. Doble el extremo de 1,5 mm de un alambre de acero inoxidable 304 de 3 cm y empuje el extremo doblado a través del espacio interproximal entre el M1 y el segundo molar maxilar (M2) desde el lado bucal con pinzas oftálmicas curvas (Figura 3B). Cuando el extremo palatino del alambre de la ligadura se vea desde el lado palatino, sáquelo hasta aproximadamente la mitad de su longitud y páselo a través de un extremo del resorte helicoidal personalizado.
5. Haga un nudo cuadrado con los dos extremos del alambre de ligadura en la dirección mesial del maxilar M1 hasta que el resorte esté firmemente fijado al diente (Figura 3C). Resta el exceso de alambre.
6. Del mismo modo, perfore un segundo alambre de acero inoxidable 304 de 3 cm a través del otro extremo del resorte helicoidal.
7. Limpie y seque las superficies de los incisivos con bolas de algodón. Aplique adhesivos en todas esas superficies con barras de algodón y cúrelas con luz.
8. Empuje el segundo alambre de acero inoxidable a través del espacio interproximal entre los incisivos maxilares y haga un nudo corredizo en la dirección labial (Figura 3D). Reste el exceso de alambre y haga que el resto del alambre quede cerca de la superficie del diente.
9. Inyecte resina fotopolimerizable para cubrir el nudo y los incisivos; fotocure la resina (Figura 3E).

3. Manejo postoperatorio

1. Después de la cirugía, inyectar a los ratones 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía intraperitoneal para la analgesia postoperatoria.
2. Coloque el ratón anestesiado sobre una manta eléctrica termostática a 37 °C. Cuando el murino recupere la conciencia con la deambulación, devuélvalo a una jaula de alojamiento separada.
3. Debido al funcionamiento limitado de los incisivos después de la cirugía, reemplace el forraje duro regular con solo una dieta blanda.
4. Revise los aparatos de ortodoncia todos los días. Si se observa alguna condición durante la inspección que afecte la conducción de la fuerza de ortodoncia, como la deformación del resorte, el aflojamiento del resorte y la caída del dispositivo, el ratón debe excluirse del experimento.
5. Con el fin de mantener la comparabilidad de los experimentos, evalúe el peso de los ratones diariamente después de la cirugía. Cualquier ratón que muestre una pérdida de peso superior al 30% de su peso preoperatorio debe ser excluido del experimento.

Resultados

Hemos realizado la cirugía OTM en 11 ratones machos adultos (C57/BL6, de 3 meses de edad). Se les practicó la eutanasia para obtener resultados en los días 3, 8 y 14 después de la cirugía. En estos experimentos, el lado maxilar derecho es el lado de operación, mientras que el lado maxilar izquierdo es el lado de control. La micro-TC mostró que hubo un aumento temporal consecutivo en la distancia entre M1 y M2: 30 μm, 70 μm y 110 μm a los 3, 8 y 14 días postoperatorios, respectivamente (Fig...

Discusión

En este trabajo, intentamos describir paso a paso el protocolo de movimiento dental de ortodoncia más simple en el modelo maxilar murino para estudiar los mecanismos latentes de la remodelación ósea inducida por carga mecánica. Aparte de la investigación sobre la remodelación ósea, existen otras aplicaciones principales de este método: 1) investigación metodológica sobre la aceleración del movimiento dental de ortodoncia; 2) investigación sobre la reabsorción radicular ortodóncica; 3) mecanismos biológicos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental Models: Mouse Lines
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J
Critical Commercial Assays
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Instruments
27 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
Adhesives	Minnesota Mining and Manufacturing Co., Ltd.	41282
Corkboard	DELI Group Co., Ltd.	8705
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	20120047
Cotton sticks	Lakong Medical Devices Co., Ltd.	M6500R
Customized coil spring	Chengdu Mingxing Spring Co., Ltd.	1109-02
Forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Light-cured fluid resin	Shofu Dental Trading (SHANGHAI) Co., Ltd.	518785
Light curer	Liang Ya Dental Equipment Co., Ltd.	LY-A180
Medical adhesive tapes	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	0008-2014
Medical non-woven fabric	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	01011500018
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Rubber bands	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	32X1
Surgical scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Tweezers	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none