Purificación por afinidad de una proteína marcada con 6X His utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas

Resumen

Este artículo proporciona un procedimiento para la purificación por afinidad de una proteína recombinante humana, la endonucleasa flap 1 (FEN1), que ha sido marcada con una etiqueta de histidina 6X. El protocolo implica la utilización de dos columnas de iones metálicos inmovilizadas distintas para la purificación de la proteína marcada.

Resumen

La caracterización funcional de las proteínas requiere que se expresen y purifiquen en cantidades sustanciales con alta pureza para realizar ensayos bioquímicos. El sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) permite la separación de alta resolución de mezclas de proteínas complejas. Mediante el ajuste de varios parámetros en FPLC, como la selección de la matriz de purificación adecuada, la regulación de la temperatura de la muestra de proteína y la gestión del caudal de la muestra en la matriz y la tasa de elución, es posible garantizar la estabilidad y funcionalidad de la proteína. En este protocolo, demostraremos la versatilidad del sistema FPLC para purificar la proteína endonucleasa 1 (FEN1) con colgajo marcado con 6X-His, producida en cultivos bacterianos. Para mejorar la eficiencia de la purificación de proteínas, nos centraremos en múltiples consideraciones, incluido el empaquetamiento y la preparación adecuados de la columna, la inyección de muestras mediante un circuito de muestras, el caudal de la aplicación de muestras a la columna y los parámetros de elución de la muestra. Finalmente, se analizará el cromatograma para identificar las fracciones que contienen altos rendimientos de proteína y consideraciones para el almacenamiento adecuado de proteínas recombinantes a largo plazo. La optimización de los métodos de purificación de proteínas es crucial para mejorar la precisión y la fiabilidad del análisis de proteínas.

Introducción

Existen numerosas estrategias para comprender la biología celular. Un enfoque implica una estrategia de arriba hacia abajo, en la que se introducen mutaciones genéticas en un gen, seguidas de la evaluación de los cambios fenotípicos resultantes en un organismo modelo. Por el contrario, un enfoque reduccionista implica la elucidación inicial de los mecanismos moleculares y las funciones enzimáticas de una proteína en particular, acompañada de la caracterización de sus interacciones con otros componentes celulares. Posteriormente, se evalúa el impacto de esta proteína en una vía biológica. Aunque cada enfoque de investigación posee sus ventajas y limitaciones inherentes, lograr una comprensión integral de una vía biológica requiere investigaciones interdisciplinarias.

Dado que el ADN es el modelo genético de la vida, la comprensión de los mecanismos de duplicación del ADN y el mantenimiento del genoma ha sido un área de interés activo durante más de siete décadas. Los estudios en el campo de la replicación del ADN han proporcionado abundantes datos sobre las estructuras y funciones individuales de numerosas proteínas de replicación. Estas investigaciones, que abarcan aspectos mecanicistas y ensayos de actividad bioquímica, se han hecho posibles gracias a la purificación de estas proteínas, lo que ha permitido su examen meticuloso en un entorno in vitro . En consecuencia, la purificación de proteínas emerge como una técnica indispensable y ubicua en la mayoría de los esfuerzos de investigación orientados a desentrañar los conocimientos mecanicistas sobre la replicación del ADN.

Este artículo presenta una metodología para aislar una proteína de replicación de ADN marcada con 6X-histidina, que ha sido sobreexpresada en células bacterianas. La proteína de interés es la endonucleasa 1 (FEN1) de colgajo humano, una nucleasa específica de la estructura que desempeña un papel fundamental en la replicación de la hebra rezagada y también es un participante crítico en las vías de reparación del ADN, como la reparación por escisión de bases (BER)^1,2,3. La función principal de FEN1 es escindirse en la base de una estructura de colgajo desplazada 5', un intermediario que surge durante la replicación del ADN o BER. Inicialmente, las investigaciones bioquímicas que evaluaban la actividad enzimática de FEN1 sugirieron un mecanismo de "seguimiento", en el que la nucleasa reconocería el extremo libre de 5'-fosfato de una estructura de colgajo y luego seguiría a lo largo de la aleta hasta su base antes de^escindirla. Investigaciones posteriores revelaron que FEN1 opera a través de un mecanismo de "enhebrado", en el que primero se une a la base de la solapa y luego enhebra el extremo libre de 5' a través de su sitio activo antes de la escisión (Figura 1)⁵. La capacidad de sobreexpresar y aislar FEN1 recombinante ha facilitado estos avances, lo que permite a los investigadores emplearlo en investigaciones bioquímicas y estructurales.

La cromatografía de afinidad es un método de separación comúnmente utilizado para purificar el ADN. Esta técnica utiliza la afinidad de unión reversible de las proteínas diana hacia los ligandos inmovilizados en una resina para atrapar específicamente la proteína de interés. Una de las bioafinidades más utilizadas es la interacción robusta entre el aminoácido, la histidina y los iones metálicos como el níquel y el cobalto y, por lo tanto, se puede capturar en una resina cargada con Ni²⁺ o Co²⁺.

La secuencia de ADN que codifica una cadena de residuos de histidina 6-9 (His) se incorpora con frecuencia a la construcción del plásmido que codifica la proteína de interés (ya sea en el extremo N o en el extremo C), marcando la proteína con una etiqueta 6X-His o una etiqueta poli-His. A continuación, la proteína marcada con His puede purificarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizada (IMAC), un subtipo de cromatografía de afinidad en el que los iones metálicos de la resina capturan proteínas con una etiqueta de afinidad, que posteriormente pueden eluirse utilizando agentes de elución adecuados. Los iones de metales de transición, como Ni²⁺ y Co²⁺ , pueden inmovilizarse en matrices de agarosa o gel de sílice derivadas de los grupos N, N, N'-tris-(carboximetil)-etilendiamina o ácido nitrilotriacético (NTA)⁶.

Se sabe que los ligandos metálicos son robustos frente a la degradación por factores físicos, químicos y biológicos y tienen esta ventaja sobre otros tipos de ligandos ^6,7. Además, la etiqueta His es una etiqueta relativamente pequeña y no afecta significativamente la estructura o función de la proteína⁷. Sin embargo, en un sistema de expresión bacteriana, muchas proteínas expresadas cromosómicamente tienen afinidad hacia los iones metálicos y pueden copurificarse con la proteína objetivo. El níquel y el cobalto son los iones metálicos típicos utilizados en las matrices IMAC. La resina de Ni-NTA y la resina a base de cobalto TALON se utilizan habitualmente para la purificación de proteínas marcadas con His.

Ni-NTA frente a TALON
Los respectivos iones metálicos de Ni-NTA y TALON se inmovilizan en la resina a través de ligandos NTA. Se cree que el Ni-NTA tiene una mayor capacidad de unión, uniéndose a hasta 100 mg/mL de proteína. Esto puede resultar en un mayor rendimiento de proteínas, con la advertencia de que las proteínas contaminantes pueden ser co-purificadas. Por el contrario, la resina tiene una mayor especificidad de unión hacia las proteínas marcadas con His y puede ser capaz de producir fracciones de mayor pureza. En este estudio, nuestro objetivo es comparar la eficiencia de purificación de ambas resinas utilizando el sistema automatizado de cromatografía líquida rápida de proteínas referenciado, el sistema NGC (ver la Tabla de Materiales).

Búferes y compatibilidad
Los tampones son necesarios durante la purificación de proteínas para la lisis celular, la preparación de muestras, el equilibrio de la resina y la elución de la proteína capturada de la resina. Los tampones Tris, MOPS y HEPES hasta una concentración de 100 mM son los tampones compatibles conocidos para la resina Ni-NTA. Los tampones a menudo incluyen agentes reductores para evitar la oxidación de las proteínas y la agregación de proteínas. Sin embargo, por encima de un límite umbral, los agentes reductores podrían despojar a la resina de iones metálicos. La concentración recomendada de agentes reductores como el beta-mercaptoetanol (BME) o el ditiotreitol (DTT) es inferior a 1 mM para las resinas a base de níquel y cobalto mencionadas anteriormente.

Los tampones para la purificación de hFEN1 son tampones Tris que contienen NaCl, BME, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), EDTA y glicerol. El NaCl mantiene la proteína en forma soluble e interrumpe las interacciones moleculares, como la unión al ADN. El BME reduce las proteínas oxidadas y, por lo tanto, evita la agregación de proteínas. PMSF) es un inhibidor de la proteasa que previene la degradación mediada por la proteasa de la proteína diana. El EDTA elimina los cationes divalentes de la muestra, impidiendo su acceso a nucleasas y proteasas. El glicerol mejora la estabilidad de la proteína en forma acuosa. Además, el tampón de lisis contiene comprimidos completos de inhibidores de la proteasa para garantizar la máxima protección de la proteína diana frente a la degradación de las proteasas durante la lisis celular. Los tampones de equilibrio y elución contienen imidazol, y el tampón de elución contiene cantidades más altas para que el imidazol desplace la proteína unida a la resina durante la elución.

Sistema de cromatografía de próxima generación (NGC)
Este sistema automatizado de cromatografía de presión media diseñado para la cromatografía líquida de proteínas de flujo rápido (FPLC) utiliza dos bombas para bombear simultáneamente dos tampones diferentes y es capaz de inyectar una amplia gama de volúmenes de muestra de 250 μL a 100 mL. El bucle de muestra (conocido como Dynaloop en este sistema), permite inyectar volúmenes de muestra más grandes. El sistema se puede operar utilizando el software Chromlab, que facilita la creación de métodos personalizados, la manipulación de las tiradas de purificación y el análisis de los picos UV y las fracciones de proteínas.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Para purificar el FEN1 recombinante, se expresa el constructo (pET-FCH-FEN1) en células BL21(DE3) como se describió previamente por Ononye et ^al.8.
   1. Inocular los medios LB (Tabla 1) con un 1% de cultivo durante la noche y cultivar las células a 37 °C hasta que la OD alcance 0,6.
   2. Inducir con 0,4 M de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) y cultivar durante 3 h más.
   3. Recolectar las células centrifugando el cultivo a 5.000 × g durante 15 min a 4 °C. Almacene el pellet en un congelador a -80 °C.
   4. El día de la purificación, retire el pellet de celda del congelador a -80 °C, deje que se descongele en hielo y vuelva a suspender el pellet en 100 mL de tampón de lisis (Tabla 1).
      NOTA: El lisado celular siempre debe colocarse en hielo durante la manipulación para evitar la proteólisis. Una vez descongelado, todo el proceso de purificación debe completarse el mismo día. El lisado celular no debe almacenarse en el refrigerador durante la noche.
2. Transfiera la suspensión a un vaso de precipitados de 250 ml y sonique sobre hielo con 30 s ON y 30 s OFF al 35% de amplitud durante 15 min.
   NOTA: Consulte la configuración del fabricante para identificar la amplitud.
3. Transfiera la muestra sonicada a un tubo de centrífuga y centrifuga a 27.000 × g durante 30 minutos a 4 °C para obtener un lisado transparente. Coloque el lisado celular en hielo en el refrigerador a 4 °C hasta la inyección de la muestra.

2. Preparación de columnas de afinidad

1. Coloque las columnas (una para la resina Ni-NTA y otra para la resina a base de cobalto) en un soporte de abrazadera de manera que las columnas se mantengan lo más rectas posible, evitando cualquier inclinación de las columnas. Asegúrese de que la parte inferior de las columnas esté enchufada con un tapón y agregue 1-2 ml de tampón inicial a la parte inferior de cada columna para evitar burbujas de aire durante el empaquetado de la columna.
2. Agita suavemente las botellas de resina hasta que la resina se vuelva a suspender por completo. Abra la parte superior de las columnas y vierta 10 mL de cada purín de forma continua para evitar la inclusión de burbujas de aire. Vierta la resina contra una espátula de metal o una varilla de vidrio sostenida en el borde de la columna para evitar burbujas de aire en la columna.

3. Empaquetadura de columna mediante un adaptador de flujo

1. Desenchufe el tapón de la columna y conecte la parte inferior a un extremo del tubo. Conecte el otro extremo del tubo al puerto UV del sistema FPLC.
2. Asegúrese de que la carcasa de soporte de la cama se haya introducido en el cuerpo del adaptador de flujo y deslice el cuerpo del adaptador de flujo en la parte superior de la columna (Figura 2A). Con el pestillo de la leva en la posición 1, baje el adaptador de flujo teniendo cuidado de no insertarlo en el tampón (Figura 2B). Coloque el pestillo de la leva en la posición 2 (Figura 2B). Conecte el tubo al sistema e inicie el flujo del tampón de arranque durante 1-2 minutos para eliminar el aire del tubo y evitar burbujas de aire durante el embalaje.
3. Vuelva a colocar el pestillo en la posición 1 y baje el adaptador de flujo en el amortiguador con un movimiento suave, evitando la inclusión de burbujas de aire, y vuelva a colocar el pestillo en la posición 2. Esto permite que algo de búfer ingrese al adaptador de flujo y elimina las burbujas restantes.
4. Coloque el pestillo en la posición 3 y apriete la base de la leva y el anillo de bloqueo (Figura 2B).
5. Inicie el flujo de tampón a 10 mL/min para empaquetar la columna. Continúa este paso durante 3 minutos o hasta que la resina esté bien empaquetada.

4. Cebado del bucle de muestra del sistema FPLC

1. Conecte el tubo desde la parte superior del bucle de muestra al bucle E del sistema FPLC (Figura 3).
2. Conecte el tubo desde la parte inferior del circuito de muestra al Waste 2 en el sistema FPLC.
3. Inserte un extremo del tubo en el puerto de la columna del sistema FPLC y coloque el otro extremo en la botella de desechos.
4. Inserte el tubo de la bomba A en agua destilada doble filtrada (ddH₂O).
5. Haga doble clic en la configuración de la bomba usando el software (Figura 4A, etiquetada como 2) y seleccione el circuito de inyección de la bomba del sistema (Figura 4C).
6. Haga clic en la configuración del caudal (Figura 4A, etiquetada como 1) y cambie el caudal a 10 mL/min. Escriba 0% en el cuadro %B (Figura 4B).
7. Inicie el flujo para enjuagar el circuito de muestra con agua, lo que empujará el sello deslizante hacia abajo.
8. Una vez que el sello deslizante llegue al fondo del circuito de muestra, detenga el flujo. Conmute la bomba A de ddH₂O al tampón de arranque. Conecte el tubo desde la parte superior del bucle de muestra al Residuos 2 y el de la parte inferior al Bucle E. Deje el tubo del puerto de la columna en el desecho.
9. Inicie el flujo a 10 mL/min. Una vez que el sello deslizante empujado hacia arriba por el tampón de inicio entrante llegue a la parte superior del circuito de muestra, detenga el flujo. El bucle de muestra ya está listo para la inyección de muestras.

5. Inyección de muestras

1. Haga doble clic en la configuración de la bomba y seleccione Bucle de carga manual (Figura 4C).
2. Desenrosque el tubo del bucle E y colóquelo en el contenedor de residuos.
3. Conecte el tubo desde el puerto de la columna al tubo en la parte superior del adaptador de flujo.
4. Extraer la muestra con una jeringa de 30 ml; Luego, conecte la jeringa al adaptador del puerto de inyección.
5. Enrosque la jeringa en el puerto de inyección e inyecte la muestra, asegurándose de que se inyecte visiblemente en el circuito de muestra. Almacene 100 μl de la muestra ( lisado de entrada de etiqueta) en un tubo de microcentrífuga a -20 °C para el análisis SDS-PAGE
   NOTA: Dependiendo del volumen total de la muestra, es posible que se requieran 2-3 inyecciones.
6. Conecte el puerto de inyección con la tapa de la columna.
7. Conecte el tubo desde la parte inferior del bucle de muestra al puerto del bucle E.
8. Coloque el tubo de la bomba B en el tampón de elución.

6. Creación y análisis de métodos utilizando el software vinculado al sistema FPLC

1. Vaya a la pestaña Inicio y seleccione Nuevo método.
2. Seleccione la pestaña Configuración de método en la columna de la izquierda, vaya al menú desplegable Tipo de columna y seleccione Personalizado (Figura 5).
3. Introduzca el volumen de la columna (5 ml).
4. Introduzca el caudal necesario para el ciclo (1 mL/min).
5. Vaya a Selección de unidades y seleccione CV (volúmenes de columnas) como unidad base del método.
6. Asegúrese de que la entrada A esté establecida en el búfer A y la entrada B esté establecida en el búfer B (la configuración predeterminada).
7. Seleccione la pestaña Esquema de método en el menú del lado izquierdo. Agregue los pasos de la purificación en el siguiente orden: equilibrio, aplicación de muestras, lavado de columnas y elución.
   1. En equilibrio, ajuste el volumen de equilibrio a 10 CV. Asegúrese de que la configuración del búfer se mantenga en 0% B.
   2. En la pestaña Aplicación de muestra , establezca el volumen de muestra observando el bucle de muestra. La posición del sello deslizante indica el volumen de la muestra.
   3. En el lavado en columna, ajuste el volumen de lavado a 5 CV. Deshabilite la recolección de fracciones para este paso; Recoja el lavado como un todo en un vaso de precipitados durante la carrera, en lugar de recolectarlo como fracciones.
   4. Para la elución, ajuste el volumen del gradiente a 14 CV comenzando desde el 0% del tampón B hasta el 100% del tampón B.
8. Guarde el método e inicie la ejecución.
9. Asegúrese de que el colector de fracciones comience en la posición de la primera fracción.
10. Introduzca el nombre de la ejecución y haga clic en Iniciar.
11. Durante la fase de equilibrio, controle la curva UV en tiempo real. Asegúrese de que todas las conexiones estén seguras y sin fugas; Confirme un circuito completo buscando el tampón que fluye hacia el contenedor de residuos. Si la curva UV no se ha estabilizado durante los últimos minutos de equilibrio, extienda el paso de equilibrio hasta que se logre la estabilización (Figura 6).
12. En el momento de la aplicación de la muestra, cambie los tubos que van al contenedor de residuos por un vaso de precipitados limpio. Durante este paso, recoja las proteínas no unidas que fluyen fuera de los tubos de desecho como flujo (etiqueta como FT).
13. Busque un aumento brusco en la curva UV que probablemente alcance la lectura máxima posible de 3,000 maU (Figura 6).
    NOTA: Una curva típica se estabiliza a 3.000 maU a través de la mayor parte del paso de aplicación de la muestra.
14. Durante el lavado de la columna, a medida que las proteínas residuales no unidas se lavan y solo quedan proteínas unidas en la resina, busque una caída brusca en la curva UV (Figura 6). Si la curva UV no ha disminuido al final del paso de lavado, extienda el paso haciendo clic en mantener paso hasta que los UV hayan disminuido lo suficiente. Al comienzo de este paso, transfiera los tubos de desecho del vaso de precipitados FT a otro vaso de precipitados limpio etiquetado como Wash.
15. Cuando comience la etapa de elución, asegúrese de que el colector de fracciones se mueva a su posición y comience a recolectar fracciones. Visualice la elución de la proteína buscando picos en la curva UV (Figura 6).
16. Una vez finalizada la ejecución, vaya a la pestaña Inicio y seleccione Abrir ejecución. Abra la carrera para ver el cromatograma y seleccione integración de picos en el menú superior para marcar los picos obtenidos durante la ejecución.
17. Seleccione la pestaña Fracciones para visualizar las fracciones que contienen proteína eluida.

7. Análisis de SDS PAGE

1. Mezclar 15 μL de cada fracción que contenga proteína con 5 μL de tampón de carga de muestra SDS (Tabla 1). Calentar las muestras a 95 °C durante 5 min.
2. Cargue las muestras en geles prefabricados y hágalos funcionar a 160 V durante 45 minutos junto con el marcador de proteínas preteñido.
3. Teñir los geles en la solución de tinción azul brillante de Coomassie durante 30 min (Tabla 1).
4. Lavar el gel en ddH₂O (repetir 3 veces).
5. Decolorar el gel en solución decolorante durante 1 h (Tabla 1).
6. Observar las bandas de proteínas; detectar FEN1 en la marca de 42 kDa.
7. Agrupar fracciones que contengan FEN1 y concentrar la piscina mediante un filtro centrífugo de 10 kDa. Alícuota y almacenar en el congelador a -80° C.

Resultados

Los lisados celulares BL21 (DE3) que expresan hFEN1 se hicieron pasar a través de resinas equilibradas de Ni-NTA y TALON. La resina Ni-NTA está cargada con iones Ni²⁺ y tiene una alta capacidad de unión. Los resultados muestran que la resina Ni-NTA produce una mayor cantidad de FEN1 en comparación con la resina TALON (Figura 7). También se sabe que la resina Ni-NTA se une de forma no específica a otras proteínas expresadas cromosómicamente...

Discusión

La cromatografía de afinidad es una técnica ampliamente utilizada para purificar las proteínas de unión al ADN. La cromatografía de afinidad de metales inmovilizada (IMAC) es un tipo específico de cromatografía de afinidad que utiliza iones metálicos para capturar los residuos de histidina de una secuencia peptídica. Esta es la razón por la que la "etiqueta 6X-His" o "etiqueta poli-His" se adjunta al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de las proteínas que se van a puri...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040