Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce

Riepilogo

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Abstract

La caratterizzazione funzionale delle proteine richiede che esse siano espresse e purificate in quantità sostanziali con elevata purezza per eseguire saggi biochimici. Il sistema di cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) consente la separazione ad alta risoluzione di miscele proteiche complesse. Regolando vari parametri in FPLC, come la selezione della matrice di purificazione appropriata, la regolazione della temperatura del campione proteico e la gestione della velocità di flusso del campione sulla matrice e della velocità di eluizione, è possibile garantire la stabilità e la funzionalità della proteina. In questo protocollo, dimostreremo la versatilità del sistema FPLC per purificare la proteina endonucleasi 1 (FEN1) del lembo marcata 6X-His, prodotta in colture batteriche. Per migliorare l'efficienza della purificazione delle proteine, ci concentreremo su molteplici considerazioni, tra cui il corretto imballaggio e preparazione della colonna, l'iniezione del campione utilizzando un circuito di campionamento, la velocità di flusso dell'applicazione del campione alla colonna e i parametri di eluizione del campione. Infine, il cromatogramma sarà analizzato per identificare le frazioni contenenti alte rese di proteine e considerazioni per una corretta conservazione a lungo termine delle proteine ricombinanti. L'ottimizzazione dei metodi di purificazione delle proteine è fondamentale per migliorare la precisione e l'affidabilità dell'analisi delle proteine.

Introduzione

Sono disponibili numerose strategie per comprendere la biologia cellulare. Un approccio prevede una strategia top-down, in cui le mutazioni genetiche vengono introdotte in un gene, seguite dalla valutazione dei cambiamenti fenotipici risultanti in un organismo modello. Al contrario, un approccio riduzionista comporta la delucidazione iniziale dei meccanismi molecolari e delle funzioni enzimatiche di una particolare proteina, accompagnata dalla caratterizzazione delle sue interazioni con altri componenti cellulari. Successivamente, viene valutato l'impatto di questa proteina su un percorso biologico. Sebbene ogni approccio di ricerca possieda i suoi vantaggi e limiti intrinseci, il raggiungimento di una comprensione completa di un percorso biologico richiede indagini interdisciplinari.

Poiché il DNA è il modello genetico della vita, la comprensione dei meccanismi di duplicazione del DNA e del mantenimento del genoma è stata un'area di interesse attivo per oltre sette decenni. Gli studi nel campo della replicazione del DNA hanno prodotto numerosi dati riguardanti le singole strutture e funzioni di numerose proteine di replicazione. Queste indagini, che comprendono aspetti meccanicistici e saggi di attività biochimica, sono state rese possibili attraverso la purificazione di queste proteine, consentendo il loro esame meticoloso in un ambiente in vitro . Di conseguenza, la purificazione delle proteine emerge come una tecnica indispensabile e onnipresente nella maggior parte degli sforzi di ricerca volti a svelare intuizioni meccanicistiche sulla replicazione del DNA.

Questo articolo presenta una metodologia per isolare una proteina di replicazione del DNA marcata con 6X-istidina, che è stata sovraespressa nelle cellule batteriche. La proteina di interesse è l'endonucleasi 1 del lembo umano (FEN1), una nucleasi struttura-specifica che svolge un ruolo fondamentale nella replicazione del filamento ritardato ed è anche un partecipante critico nei percorsi di riparazione del DNA come la riparazione per escissione di basi (BER)^1,2,3. La funzione principale di FEN1 è quella di scindere alla base di una struttura di lembo spostata di 5', un intermedio che si verifica durante la replicazione del DNA o BER. Inizialmente, le indagini biochimiche che valutavano l'attività enzimatica di FEN1 suggerivano un meccanismo di "tracciamento", in cui la nucleasi riconosceva l'estremità libera del 5'-fosfato di una struttura di lembo e poi seguiva lungo il lembo fino alla sua base prima di scinderlo⁴. Ricerche successive hanno rivelato che FEN1 funziona tramite un meccanismo di "filettatura", in cui prima si lega alla base del lembo e poi infila l'estremità libera 5' attraverso il suo sito attivo prima della scissione (Figura 1)⁵. La capacità di sovraesprimere e isolare FEN1 ricombinante ha facilitato queste scoperte, consentendo ai ricercatori di impiegarlo in indagini biochimiche e strutturali.

La cromatografia di affinità è un metodo di separazione comunemente usato per purificare il DNA. Questa tecnica utilizza l'affinità di legame reversibile delle proteine bersaglio verso i ligandi immobilizzati su una resina per intrappolare specificamente la proteina di interesse. Una delle bio-affinità più utilizzate è la robusta interazione tra l'amminoacido, l'istidina e gli ioni metallici come il nichel e il cobalto e, quindi, può essere catturata su una resina caricata con Ni²⁺ o Co²⁺.

La sequenza di DNA che codifica una stringa di 6-9 residui di istidina (His) è spesso incorporata nel costrutto plasmidico che codifica la proteina di interesse (sia all'N-terminale che al C-terminale), marcando la proteina con un tag 6X-His-S o un tag poly-His. La proteina marcata con His-taged può quindi essere facilmente purificata mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC), un sottotipo di cromatografia di affinità in cui gli ioni metallici sulla resina catturano le proteine con un tag di affinità, che possono essere successivamente eluite utilizzando agenti di eluizione appropriati. Gli ioni dei metalli di transizione come Ni²⁺ e Co²⁺ possono essere immobilizzati su matrici di agarosio o gel di silice derivate dai gruppi⁶ di N,N,N,N'-tris-(carbossimetil)-etilendiammina o acido nitrilotriacetico (NTA).

I leganti metallici sono noti per essere robusti contro la degradazione da fattori fisici, chimici e biologici e mantengono questo vantaggio rispetto ad altri tipi di leganti ^6,7. Inoltre, l'His-tag è un tag relativamente piccolo e non influisce in modo significativo sulla struttura o sulla funzione delle proteine⁷. Tuttavia, in un sistema di espressione batterica, molte proteine espresse cromosomicamente hanno un'affinità verso gli ioni metallici e possono co-purificarsi con la proteina bersaglio. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metallici tipici utilizzati nelle matrici IMAC. La resina Ni-NTA e la resina a base di cobalto TALON sono comunemente utilizzate per la purificazione delle proteine marcate con His.

Ni-NTA contro TALON
I rispettivi ioni metallici di Ni-NTA e TALON sono immobilizzati sulla resina attraverso leganti NTA. Si ritiene che il Ni-NTA abbia una maggiore capacità di legame, legando fino a 100 mg/mL di proteine. Ciò può comportare una maggiore resa proteica, con l'avvertenza che le proteine contaminanti possono essere co-purificate. Al contrario, la resina ha una maggiore specificità di legame verso le proteine marcate con His-taged e potrebbe essere in grado di produrre frazioni di purezza superiore. In questo studio, miriamo a confrontare l'efficienza di purificazione di entrambe le resine utilizzando il sistema automatizzato di cromatografia liquida di proteine veloci di riferimento, il sistema NGC (vedi la Tabella dei materiali).

Buffer e compatibilità
I tamponi sono necessari durante la purificazione delle proteine per la lisi cellulare, la preparazione del campione, l'equilibrio della resina e l'eluizione della proteina catturata dalla resina. I tamponi Tris, MOPS e HEPES fino a una concentrazione di 100 mM sono i tamponi compatibili noti per la resina Ni-NTA. I tamponi spesso includono agenti riducenti per prevenire l'ossidazione delle proteine e l'aggregazione proteica. Tuttavia, al di sopra di un limite di soglia, gli agenti riducenti potrebbero privare la resina degli ioni metallici. La concentrazione raccomandata di agenti riducenti come il beta-mercaptoetanolo (BME) o il ditiotreitolo (DTT) è inferiore a 1 mM per le resine a base di nichel e cobalto sopra menzionate.

I tamponi per la purificazione di hFEN1 sono tamponi Tris contenenti NaCl, BME, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), EDTA e glicerolo. NaCl mantiene la proteina in forma solubile e interrompe le interazioni molecolari come il legame con il DNA. Il BME riduce le proteine ossidate e quindi previene l'aggregazione proteica. PMSF) è un inibitore della proteasi che previene la degradazione mediata dalla proteasi della proteina bersaglio. L'EDTA elimina i cationi bivalenti dal campione, impedendone l'accesso a nucleasi e proteasi. Il glicerolo migliora la stabilità della proteina in forma acquosa. Inoltre, il tampone di lisi contiene compresse complete di inibitori della proteasi per garantire la massima protezione della proteina bersaglio dalla degradazione delle proteasi durante la lisi cellulare. I tamponi di equilibratura ed eluizione contengono imidazolo, mentre il tampone di eluizione contiene quantità maggiori per l'imidazolo per spostare la proteina legata dalla resina durante l'eluizione.

Sistema di cromatografia di nuova generazione (NGC)
Questo sistema automatizzato di cromatografia a media pressione progettato per la cromatografia liquida di proteine a flusso rapido (FPLC) utilizza due pompe per pompare contemporaneamente due diversi tamponi ed è in grado di iniettare un'ampia gamma di volumi di campione da 250 μl a 100 mL. Il sample loop (noto come Dynaloop in questo sistema), consente di iniettare volumi di campione maggiori. Il sistema può essere utilizzato utilizzando il software Chromlab, che facilita la creazione di metodi personalizzati, la manipolazione di cicli di purificazione e l'analisi dei picchi UV e delle frazioni proteiche.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Per purificare il FEN1 ricombinante, esprimere il costrutto (pET-FCH-FEN1) nelle cellule BL21(DE3) come precedentemente descritto da Ononye et ^al.8.
   1. Inoculare il terreno LB (Tabella 1) con l'1% di coltura notturna e far crescere le cellule a 37 °C fino a quando l'OD raggiunge 0,6.
   2. Indurre con 0,4 M di isopropil-beta-D-tiogalattoside (IPTG) e far crescere la coltura per altre 3 ore.
   3. Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 5.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Conservare il pellet in un congelatore a -80°C.
   4. Il giorno della purificazione, rimuovere il pellet di cella dal congelatore a -80 °C, lasciarlo scongelare con ghiaccio e risospendere il pellet in 100 mL di tampone di lisi (Tabella 1).
      NOTA: Il lisato cellulare deve essere sempre posto su ghiaccio durante la manipolazione per prevenire la proteolisi. Una volta scongelato, l'intero processo di purificazione deve essere completato lo stesso giorno. Il lisato cellulare non deve essere conservato in frigorifero durante la notte.
2. Trasferire la sospensione in un becher da 250 mL e sonicare sul ghiaccio con 30 s ON e 30 s OFF al 35% di ampiezza per 15 min.
   NOTA: Consultare le impostazioni del produttore per identificare l'ampiezza.
3. Trasferire il campione sonicato in una provetta da centrifuga e centrifugare a 27.000 × g per 30 minuti a 4 °C per ottenere un lisato limpido. Mettere il lisato cellulare sul ghiaccio in frigorifero a 4 °C fino all'iniezione del campione.

2. Preparazione delle colonne di affinità

1. Montare le colonne (una per la resina Ni-NTA e una per la resina a base di cobalto) su un supporto di bloccaggio in modo che le colonne siano tenute il più dritte possibile, evitando qualsiasi inclinazione delle colonne. Assicurarsi che il fondo delle colonne sia collegato con un tappo e aggiungere 1-2 ml di tampone iniziale sul fondo di ciascuna colonna per evitare la formazione di bolle d'aria durante l'impaccamento della colonna.
2. Agita delicatamente i flaconi di resina fino a quando la resina non è completamente risospesa. Aprire la parte superiore delle colonne e versare 10 mL di ogni impasto in modo continuo per evitare l'inclusione di bolle d'aria. Versare la resina contro una spatola di metallo o un'asta di vetro tenuta sul bordo della colonna per evitare bolle d'aria nella colonna.

3. Impaccamento della colonna utilizzando un adattatore di flusso

1. Scollegare il tappo dalla colonna e collegare la parte inferiore a un'estremità del tubo. Collegare l'altra estremità del tubo alla porta UV del sistema FPLC.
2. Assicurarsi che l'alloggiamento del supporto del letto sia stato inserito nel corpo dell'adattatore di flusso e far scorrere il corpo dell'adattatore di flusso sulla parte superiore della colonna (Figura 2A). Con il fermo a camma in posizione 1, abbassare l'adattatore di flusso facendo attenzione a non inserirlo nel buffer (Figura 2B). Portare il fermo della camma in posizione 2 (Figura 2B). Collegare il tubo al sistema e avviare il flusso del buffer di avviamento per 1-2 minuti per liberare il tubo dall'aria ed evitare bolle d'aria durante l'imballaggio.
3. Riportare il fermo in posizione 1 e abbassare l'adattatore di flusso nel buffer con un movimento fluido, evitando l'inclusione di bolle d'aria, e riportare il fermo in posizione 2. In questo modo è possibile inserire un po' di buffer nell'adattatore di flusso e rimuovere eventuali bolle rimanenti.
4. Portare il fermo in posizione 3 e serrare la base della camma e l'anello di bloccaggio (Figura 2B).
5. Avviare il flusso di tampone a 10 mL/min per impacchettare la colonna. Continua questo passaggio per 3 minuti o fino a quando la resina non è stata ben imballata.

4. Adescamento del circuito di campionamento del sistema FPLC

1. Collegare il tubo dalla parte superiore del loop di campionamento al loop E del sistema FPLC (Figura 3).
2. Collegare il tubo dalla parte inferiore del circuito di campionamento al rifiuto 2 del sistema FPLC.
3. Inserire un'estremità del tubo nella porta della colonna del sistema FPLC e posizionare l'altra estremità nel flacone di scarico.
4. Inserire il tubo della pompa A in acqua distillata doppia filtrata (ddH₂O).
5. Fare doppio clic sulle impostazioni della pompa utilizzando il software (Figura 4A, etichettato 2) e selezionare il circuito di iniezione della pompa del sistema (Figura 4C).
6. Fare clic sulle impostazioni della velocità di flusso (Figura 4A, etichettata 1) e modificare la velocità di flusso a 10 ml/min. Immettere 0% nella casella %B (Figura 4B).
7. Avviare il flusso per lavare il circuito del campione con acqua, che spingerà la guarnizione scorrevole verso il basso.
8. Una volta che la guarnizione scorrevole raggiunge la parte inferiore del circuito del campione, arrestare il flusso. Commutare la pompa A da ddH₂O al buffer di avviamento. Collegare il tubo dalla parte superiore del circuito del campione al rifiuto 2 e quello dal basso al circuito E. Lasciare il tubo dalla porta della colonna nel reperto.
9. Avviare il flusso a 10 ml/min. Una volta che la guarnizione scorrevole spinta verso l'alto dal buffer di partenza in ingresso raggiunge la parte superiore del circuito del campione, arrestare il flusso. Il circuito di campionamento è ora pronto per l'iniezione del campione.

5. Iniezione del campione

1. Fare doppio clic sulle impostazioni della pompa e selezionare Ciclo di carico manuale (Figura 4C).
2. Svitare il tubo dall'anello E e riporlo nel contenitore dei rifiuti.
3. Collegare il tubo dalla porta della colonna al tubo sulla parte superiore dell'adattatore di flusso.
4. Prelevare il campione utilizzando una siringa da 30 mL; Quindi, collegare la siringa all'adattatore della porta di iniezione.
5. Avvitare la siringa nella porta di iniezione e iniettare il campione, assicurandosi che sia visibilmente iniettato nel circuito del campione. Conservare 100 μl del campione ( lisato di input dell'etichetta) in una provetta da microcentrifuga a -20 °C per l'analisi SDS-PAGE
   NOTA: A seconda del volume totale del campione, potrebbero essere necessarie 2-3 iniezioni.
6. Tappare la porta di iniezione con il tappo della colonna.
7. Ricollegare il tubo dalla parte inferiore del sample loop alla porta Loop E.
8. Posizionare il tubo della pompa B nel tampone di eluizione.

6. Creazione e analisi del metodo utilizzando il software FPLC system-linked

1. Passare alla scheda Home e selezionare Nuovo metodo.
2. Selezionare la scheda Impostazioni metodo nella colonna di sinistra, passare al menu a discesa Tipo di colonna e selezionare Personalizzato (Figura 5).
3. Inserire il volume della colonna (5 mL).
4. Immettere la velocità di flusso richiesta per la seduta (1 mL/min).
5. Passare a Selezione unità e selezionare CV (volumi colonna) come unità di base del metodo.
6. Assicurarsi che l'ingresso A sia impostato su Buffer A e che l'ingresso B sia impostato su Buffer B (impostazione predefinita).
7. Seleziona la scheda Struttura metodo nel menu a sinistra. Aggiungere le fasi della purificazione nel seguente ordine: equilibratura, applicazione del campione, lavaggio della colonna ed eluizione.
   1. In condizioni di equilibratura, impostare il volume di equilibratura su 10 CV. Assicurarsi che l'impostazione del buffer sia mantenuta allo 0% B.
   2. Nella scheda dell'applicazione del campione , impostare il volume del campione osservando il ciclo del campione. La posizione della guarnizione scorrevole indica il volume del campione.
   3. Sotto il lavaggio a colonna, impostare il volume di lavaggio su 5 CV. Disabilitare la raccolta delle frazioni per questo passaggio; Raccogli il bucato nel suo insieme in un bicchiere durante la corsa, piuttosto che raccoglierlo in frazioni.
   4. Per l'eluizione, impostare il volume del gradiente su 14 CV a partire dallo 0% del buffer B al 100% del buffer B.
8. Salvare il metodo e avviare l'esecuzione.
9. Assicurarsi che il raccoglitore di frazioni inizi dalla posizione della prima frazione.
10. Immettere il nome dell'esecuzione e fare clic su Avvia.
11. Durante la fase di equilibratura, monitorare la curva UV in tempo reale. Assicurarsi che tutti i collegamenti siano sicuri e privi di perdite; Confermare un circuito completo cercando il tampone che scorre nel contenitore dei rifiuti. Se la curva UV non si è stabilizzata durante gli ultimi minuti di equilibrio, estendere la fase di equilibratura fino a raggiungere la stabilizzazione (Figura 6) .
12. Al momento dell'applicazione del campione, trasferire le provette che vanno nel contenitore dei rifiuti in un becher pulito. Durante questa fase, raccogliere le proteine non legate che fuoriescono dalle provette di scarto durante il flusso (etichettare come FT).
13. Aspettatevi un forte aumento della curva UV che probabilmente raggiunga la lettura massima possibile di 3.000 mU (Figura 6).
    NOTA: Una curva tipica si stabilizza a 3.000 mU durante la maggior parte della fase di applicazione del campione.
14. Durante il lavaggio della colonna, poiché le proteine residue non legate vengono lavate via con solo le proteine legate rimaste sulla resina, cercare un forte calo della curva UV (Figura 6). Se la curva UV non è diminuita entro la fine della fase di lavaggio, estendere la fase facendo clic su Mantieni passaggio fino a quando l'UV non è sceso a sufficienza. All'inizio di questa fase, trasferire i tubi di scarico dal becher FT a un altro becher pulito etichettato Wash.
15. Quando inizia la fase di eluizione, assicurarsi che il collettore di frazioni si muova in posizione e inizi a raccogliere le frazioni. Visualizzare l'eluizione delle proteine cercando i picchi nella curva UV (Figura 6).
16. Al termine dell'esecuzione, passare alla scheda Home e selezionare Apri esecuzione. Aprire la seduta per visualizzare il cromatogramma e selezionare Integrazione picchi nel menu in alto per contrassegnare i picchi ottenuti durante la seduta.
17. Selezionare la scheda Frazioni per visualizzare le frazioni contenenti proteine eluite.

7. Analisi SDS PAGE

1. Mescolare 15 μl di ciascuna frazione contenente proteine con 5 μl di tampone di caricamento del campione SDS (Tabella 1). Riscaldare i campioni a 95 °C per 5 minuti.
2. Caricare i campioni in gel prefabbricati e farli funzionare a 160 V per 45 minuti insieme al marcatore proteico prestainato.
3. Colorare i gel nella soluzione colorante blu brillante Coomassie per 30 minuti (Tabella 1).
4. Lavare il gel in gg₂O (ripetere 3 volte).
5. Sfumare il gel nella soluzione decolorante per 1 ora (Tabella 1).
6. Osservare le bande proteiche; rilevare FEN1 alla soglia dei 42 kDa.
7. Frazioni della piscina contenenti FEN1 e concentrare la piscina utilizzando un filtro centrifugo da 10 kDa. Aliquotare e conservare in congelatore a -80° °C.

Risultati

I lisati cellulari BL21 (DE3) che esprimono hFEN1 sono stati fatti passare attraverso resine Ni-NTA e TALON equilibrate. La resina Ni-NTA è caricata con ioni Ni²⁺ e ha un'elevata capacità legante. I risultati mostrano che la resina Ni-NTA produce una quantità maggiore di FEN1 rispetto alla resina TALON (Figura 7). La resina Ni-NTA è anche nota per legarsi in modo non specifico ad altre proteine espresse cromosomicamente. Il lisato cellulare pa...

Discussione

La cromatografia di affinità è una tecnica ampiamente utilizzata per purificare le proteine leganti il DNA. La cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) è un tipo specifico di cromatografia di affinità che utilizza ioni metallici per catturare i residui di istidina di una sequenza peptidica. Questo è il motivo per cui il "tag 6X-Hi" o "tag poly-Hi" è attaccato all'N-terminale o al C-terminale delle proteine da purificare. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metal...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040