Eliminación de bacteriófagos de cultivos infectados de Salmonella

Resumen

Los bacteriófagos, ubicuos y diversos en la Tierra, infectan y se replican dentro de los huéspedes bacterianos, desempeñando un papel crucial en los ecosistemas microbianos. A pesar de su importancia, su presencia puede perturbar los procesos industriales. Hemos desarrollado un método que utiliza lipopolisacáridos bacterianos para eliminar bacteriófagos de cultivos de Salmonella .

Resumen

Los bacteriófagos, o simplemente fagos, desempeñan un papel vital en los entornos microbianos, ya que afectan a las poblaciones bacterianas y dan forma a su evolución e interacciones. Estos organismos son virus que infectan y se replican dentro de los huéspedes bacterianos. Los fagos son omnipresentes en la Tierra, muy diversos y muy abundantes. Si bien los bacteriófagos tienen funciones valiosas en diferentes entornos y son un área clave de investigación en microbiología y ecología, su presencia puede ser indeseable en ciertos procesos o productos industriales. Teniendo en cuenta la abundancia y ubicuidad de bacteriófagos en la Tierra, el diseño de procedimientos para la eliminación de bacteriófagos de cultivos bacterianos es crucial en diversas aplicaciones industriales y de laboratorio para preservar la integridad de los cultivos y garantizar resultados experimentales precisos o la calidad del producto. En este trabajo, hemos afinado un protocolo para eliminar los bacteriófagos de los cultivos infectados de Salmonella enterica , utilizando una estrategia basada en el uso de lipopolisacáridos (LPS) localizados en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. El LPS bacteriano juega un papel importante en el reconocimiento del huésped por parte de los fagos, y hacemos uso de esta propiedad para diseñar un procedimiento eficaz para la eliminación de fagos, que utilizan LPS como receptor, en cultivos de bacterias de Salmonella .

Introducción

Las poblaciones microbianas se enfrentan a múltiples desafíos en los entornos naturales, y una amenaza especialmente grave es la posibilidad de infección por bacteriófagos, los virus que infectan a las^bacterias. Estos virus están muy extendidos en el planeta, exhibiendo una gran diversidad y abundancia 2,3,4,5. Aunque los bacteriófagos son diversos en tamaño, morfología y organización genómica, todos comparten la misma estructura: un genoma de ADN o ARN envuelto por una cápside formada por proteínas codificadas por fagos⁶. Las bacterias han desarrollado una amplia gama de mecanismos de defensa contra ellas⁷. Un aspecto clave de la infección por bacteriófagos, que es relevante para la caracterización y para la detección, son los dominios de unión al receptor presentes en las fibras de la cola. Los bacteriófagos tienen proteínas en su superficie llamadas proteínas de unión a receptores o fibras de cola para reconocer y unirse a sitios receptores específicos en la superficie de la célula bacteriana. En el caso de las bacterias Gram-negativas, el reconocimiento de estructuras superficiales, como lipopolisacáridos (LPS), proteínas de la membrana externa, pili y/o flagelos, están involucrados en la interacción fago-bacteria⁸. Esta interacción entre bacteriófagos y bacterias es muy específica y depende principalmente de su capacidad para adherirse a las superficies del huésped. El antígeno O del lipopolisacárido es^{un receptor 9} de uso común.

La investigación de las interacciones bacteriófago-bacteria no solo es fascinante desde un punto de vista biológico, sino que también tiene aplicaciones prácticas en áreas como la terapia con fagos y la biotecnología. Si bien los bacteriófagos tienen un papel valioso en diversos contextos, por ejemplo, alterando las poblaciones microbianas¹⁰, su presencia puede ser indeseable en ciertos procesos industriales. En la industria farmacéutica, la biotecnología y la producción de alimentos, la presencia de bacteriófagos puede afectar la calidad y la seguridad de los productos finales, por lo que su eliminación es esencial para cumplir con los estándares de calidad. En el bioprocesamiento y la biofabricación, donde los cultivos bacterianos se utilizan para producir diversos compuestos (por ejemplo, proteínas, enzimas o antibióticos), la presencia de bacteriófagos puede provocar la interrupción de los procesos de producción debido a su capacidad para equilibrar la población bacteriana en todos los entornos compartidos. En ocasiones, los fagos pueden convertir la vida profesional del microbiólogo industrial en una pesadilla¹¹. El diseño de procedimientos eficaces para eliminar los fagos es fundamental para garantizar una producción coherente y fiable, mejorando la eficiencia del proceso. Aparte de estos aspectos industriales, en un laboratorio de investigación, donde la precisión y la reproducibilidad son cruciales, la eliminación de bacteriófagos es esencial para obtener resultados precisos y fiables. Además, la eliminación de fagos también se puede utilizar para simular diferentes entornos para probar diferentes hipótesis¹². La eliminación de fagos también puede ser muy útil en el entorno de investigación, ya que muchos estudios basados en fagos, como la enumeración de bacterias después de la aplicación de fagos, se beneficiarían de un paso para eliminar fagos con el fin de producir recuentos viables mucho más fiables.

La eliminación de fagos basada en el aislamiento de colonias llevaría varios días para garantizar que las colonias estén libres de fagos, mientras que el procedimiento descrito aquí permite la generación de cultivos libres de fagos en horas. Este protocolo nos permite seguir la evolución de los cultivos bacterianos sin impedir que aíslen las colonias. En este sentido, es posible simular entornos fluctuantes (presencia y/o ausencia de fagos) para probar diferentes hipótesis. Además, este protocolo permite el análisis cualitativo y cuantitativo de la presencia de fagos en un cultivo bacteriano.

En resumen, el diseño de procedimientos rentables para la eliminación de bacteriófagos es crucial para mantener la calidad del producto, la seguridad y la eficiencia de los procesos en diversas industrias y para los avances en la investigación básica y aplicada. En este trabajo se describe un protocolo altamente eficaz basado en el uso de LPS para la eliminación de bacteriófagos, que utilizan LPS como receptor, de cultivos de Salmonella infectados, que es eficiente en el tiempo y requiere un equipamiento mínimo.

Protocolo

NOTA: Antes de realizar el procedimiento de eliminación de fagos, describimos la preparación de un cultivo de Salmonella infectado con bacteriófagos 9NA. En la Figura 1, se ilustra una representación general del procedimiento completo para la eliminación de bacteriófagos en cultivos bacterianos.

1. Preparación de cultivos de Salmonella infectados con bacteriófagos

1. Preparación de cultivos bacterianos
   NOTA: En este estudio se utilizó Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium cepa ATCC 14028 opvAB::lacZ (SV8011)¹³ .
   1. Descongele lentamente el vial recuperado a -80 °C que contiene la cepa de S. enterica de interés colocándolo sobre hielo.
   2. Extienda la cepa de S. enterica del caldo de dimetilsulfóxido descongelado y colóquela en una placa de caldo Lennox (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 15 g/L de agar, consulte la Tabla de materiales). Incubar la placa a 37 °C durante 24 h.
   3. Con una aguja de inoculación, transfiera una colonia de la placa de S. enterica e inpole 5 mL de LB líquido en un tubo de vidrio. Incubar a 37 °C durante 24 h con aireación agitando a 200 rpm.
2. Preparación de bacteriófagos
   NOTA: En este protocolo se utilizó el bacteriófago 9NA, perteneciente a la familia Siphoviridae (orden Caudovirales)¹⁴. En particular, se pueden utilizar otros bacteriófagos de Salmonella enterica que utilizan el antígeno O del lipopolisacárido como receptor.
   1. Prepare el caldo de bacteriófagos añadiendo 0,1 mL de lisado de bacteriófago concentrado a una mezcla de 100 mL de caldo de nutrientes (NB; 5 g/L de peptona y 3 g/L de extracto de levadura), 2 mL de sales 50x E (38,78 mM MgSO₄7 H₂O, 520,5 mM de ácido cítricoH₂O, 2,87 M K₂HPO₄ anhidro y 829 mM NaNH₄HPO₄4 H₂O) y 0,4 mL de 50% glucosa. Mezclar bien por inversión.
      1. Un ejemplo representativo de concentración de bacteriófagos podría ser 10⁹ PFU/mL (Unidades Formadoras de Placa/mL), pero se pueden utilizar concentraciones más bajas con resultados similares (ver Tabla de Materiales). Estime la concentración de bacteriófagos siguiendo el paso 1.2.3.
   2. Prepare el lisado siguiendo los pasos que se describen a continuación.
      1. Prepare el inóculo de S. enterica en 5 mL de LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl y 5 g/L de extracto de levadura). Incubar a 37 °C y 200 rpm durante 24 h.
      2. Mezcle 4 mL de caldo de bacteriófagos con 1 mL de cultivo nocturno de S. enterica. Incubar la mezcla a 37 °C y 200 rpm durante 8 h.
      3. Para discriminar entre bacterias y bacteriófagos, centrifugar la mezcla a 2.377 x g durante 20 min. Recuperar el sobrenadante en un tubo de vidrio, añadir 800 μL de cloroformo (ver Tabla de Materiales) y vórtice. Asegúrese de transferir solo la fase superior cuando se use una mezcla con cloroformo.
         NOTA: Es importante prevenir la transferencia de cloroformo residual, lo que podría afectar la eficiencia del procedimiento. El paso del cloroformo es común tanto en los protocolos de aislamiento como en los de propagación como una forma de maximizar los fagos liberados. Sin embargo, el cloroformo puede inactivar algunos fagos o destruir su infectividad¹⁵. Por lo tanto, este paso solo es aplicable a fagos resistentes al cloroformo.
      4. Mantener los lisados a temperatura ambiente durante 2 h y luego almacenarlos a 4 °C.
   3. Valorar el lisado para cuantificar el número de bacteriófagos/número de PFU por ml presentes en el lisado preparado. Para ello, realice la técnica de superposición que se describe a continuación.
      1. Prepare 5 mL de LB de inóculo para S. enterica. Incubar a 37 °C durante 24 h con aireación agitando a 200 rpm.
      2. Realice diluciones seriadas del lisado en LB para alcanzar un número contable de PFU/mL. Para determinar los factores de dilución necesarios, identifique el lisado de bacteriófago inicial concentrado. Para un ejemplo representativo de concentración de bacteriófagos en alrededor de 10⁹ UFP/mL, los factores de dilución que dan lugar a un número contable de placas están entre 10 6-10¹⁰.
      3. Añadir 100 μL de la dilución de lisado apropiada y 60 μL del cultivo nocturno de S. enterica preparado el día anterior a 5 mL de agar blando LB, preparado mezclando LB líquido y agar LB en una proporción 1:1 y manteniéndolo a 56 °C para evitar la solidificación. Mezclar con cuidado, evitando que queden burbujas.
      4. Vierta cada mezcla en la parte superior de un plato de LB y manténgalo en el banco hasta que el medio se solidifique.
      5. Incubar las placas durante 24 h a 37 °C. Cuente el número de placas en cada plato. Para determinar el número de UFP/mL, multiplique el número de placas de cada placa por el factor de dilución (FD). Para garantizar una infección eficiente de los fagos, son necesarios 10 9-10¹² PFU/mL.
         UFP/mL= No. placas en la placa x FD
3. Infección de cultivos de Salmonella con bacteriófagos
   1. Diluir un cultivo nocturno de S. enterica a 1:100 en un volumen final de 5 mL de LB y añadir 0,1 mL de lisado (concentrado a 10 9-10¹² PFU/mL). Incubar a 37 °C y 200 rpm durante 24 h.
4. Determinación del título de fagos como PFU en el ensayo en placa
   1. Para cuantificar el número de bacteriófagos en el cultivo infectado, realice ensayos en placa para determinar el título del fago como PFU/mL, como se describe a continuación.
      1. Transfiera 1 mL del cultivo a un tubo. Centrifugar a 17.115 x g durante 2 min y verter el sobrenadante en un nuevo vial etiquetado.
      2. Agregue 100 μL de cloroformo al vial y al vórtice para eliminar los desechos bacterianos de la solución. Siga el paso 1.2.3.

2. Eliminación de bacteriófagos de cultivos infectados de Salmonella enterica (ver Figura 2)

NOTA: Para controlar el proceso de eliminación de bacteriófagos, se toman diferentes alícuotas a lo largo del protocolo de limpieza para la valoración. En total, hay ocho alícuotas para confirmar que el número de PFU/mL va disminuyendo a lo largo del proceso de limpieza hasta la eliminación completa.

1. Eliminación de bacteriófagos en suspensión
   1. Diluir el cultivo bacteriano que contiene fagos a 1:100 en 5 mL de LB filtrado de 0,22 μm en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Punto de valoración 1: Esta es la primera alícuota para la valoración (el cultivo inicial de Salmonella infectada).
   2. Centrifugar la suspensión durante 10 min a 2.377 x g. Retire con cuidado el sobrenadante. No utilice una pipeta; Vierte el tubo. Trate de dejar algo de volumen en la parte inferior del tubo cónico de la centrífuga para asegurar la presencia de células.
   3. Lave las células bacterianas con 10 ml de medio LB filtrado de 0,22 μm. Repita los pasos de centrifugación y lavado 3 veces. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de LB filtrado de 0,22 μm. Punto de valoración 2: Esta es la segunda alícuota para la valoración.
   4. Transfiera 50 μL de la suspensión bacteriana anterior a través de un filtro estéril de 0,45 μm (consulte la Tabla de materiales) utilizando un sistema de filtración al vacío. Enjuague el filtro con 100 mL de LB filtrado de 0,22 μm.
      NOTA: El tamaño de la cabeza del bacteriófago 9NA es de 0,067 μm. Por el contrario, la Salmonella mide entre 2 y 5 μm de largo y entre 0,5 y 1,5 μm de ancho. Por lo tanto, si se utilizan membranas de 0,45 μm, la mayoría de las bacterias no pasarán porque son mayores de 0,45 μm, mientras que la mayoría de los fagos pasarán a través de los poros del filtro de 0,45 μm.
2. Eliminación de bacteriófagos contenidos en el interior de las células de Salmonella
   1. Para facilitar la liberación de fagos de las células bacterianas, incube el filtro de 0,45 μm que contiene células durante 2 h a 37 °C dentro de la incubadora sin desmontar el sistema.
      NOTA: Este paso de incubación es necesario para promover la lisis de las bacterias infectadas y la liberación de fagos intracelulares en el filtro.
   2. Lave el filtro de 0,45 μm utilizando un sistema de filtración al vacío, enjuagando el filtro con 100 mL de LB filtrado de 0,22 μm.
   3. Recupere las células bacterianas del filtro en 2 mL de 2x LB (20 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 10 g/L de extracto de levadura; ver Tabla de Materiales). Para ello, transfiera el filtro de 0,45 μm a un matraz con pinzas estériles. A continuación, añada 2 ml de 2x LB sobre el filtro y pipetee varias veces para liberar las células del filtro.
   4. Centrifugar 1 mL de esta suspensión durante 2 min a 10.354 x g. Deseche el sobrenadante y lave las células bacterianas 3 veces con 1 mL de medio LB filtrado. Vuelva a suspender las células en 1 mL de 2x lb. Punto de valoración 3: Esta es la tercera alícuota para la valoración.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente el uso de un LB más concentrado (2x LB) porque, como se describe a continuación, se agregará lipopolisacárido comercial (LPS) y este LPS se disuelve en agua, diluyendo así el medio.
3. Evite la reinfección engañando a los bacteriófagos liberados por las células bacterianas con lipopolisacáridos comerciales como se describe a continuación.
   1. Incubar 20 μL de la suspensión bacteriana en presencia de un lipopolisacárido comercial de S. enterica (LPS; ver Tabla de Materiales) hasta una concentración final de 3,75 mg/mL en 1 mL de LB filtrado de 0,22 μm durante 2 h a 37 °C con agitación a 200 rpm.
      NOTA: Los fagos liberados por las células en el medio pueden unirse al LPS comercial de S. enterica en lugar de al LPS bacteriano.
   2. Después de 2 h de incubación, transfiera 1 mL de cultivo a un tubo de microcentrífuga y centrifugue la suspensión durante 2 min a 10,354 x g. Punto de valoración 4: Utilice el sobrenadante como cuarta alícuota para la valoración.
   3. Lave el pellet 3 veces con 1 mL de medio LB filtrado.
   4. Después del lavado, vuelva a suspender el pellet en 1 mL de 2x LB. Incube 20 μL de esta mezcla en 1 mL de LB filtrado de 0,22 μm con 0,8 mg/mL de LPS comercial durante 2 h a 37 °C con agitación a 200 rpm. Punto de valoración 5: Utilice el resto de la suspensión bacteriana para la quinta valoración.
   5. Después de 2 h de incubación, transfiera 1 mL de cultivo a un tubo de microcentrífuga y pellet por centrifugación durante 2 min a 10,354 x g. Punto de valoración 6: Utilice el sobrenadante como sexta alícuota para la valoración vertiendo el sobrenadante en un nuevo vial.
   6. Lave las células bacterianas 3 veces con LB filtrado. Después del lavado, vuelva a suspender las células recogidas en 1 ml de LB filtrado de 0,22 μm.
   7. Pase 1 mL de suspensión bacteriana a través de un filtro estéril de 0,45 μm utilizando un sistema de filtración al vacío. Enjuague el filtro con 100 ml de LB filtrado de 0,22 μm.
   8. Recupere las células del filtro de 0,45 μm en 2 mL de medio 2x LB. Para ello, transfiera el filtro de 0,45 μm a un matraz con pinzas estériles. A continuación, añada 2 ml de 2x LB sobre el filtro y pipetee varias veces para intentar liberar las células del filtro.
   9. Pellet de 1 mL de células por centrifugación durante 2 min a 10.354 x g. Lavar 3 veces con LB filtrado de 0,22 μm. Después del lavado, vuelva a suspender las células recolectadas en 1 mL de 2x LB. Punto de valoración 7: Esta es la séptima alícuota para la valoración. Esta alícuota informará sobre la eficiencia de la eliminación de fagos en cultivos bacterianos.

3. Preparación de cultivo de Salmonella libre de bacteriófagos después de la eliminación de bacteriófagos

1. Prepara el inóculo libre de fagos. Añadir 100 μL de células de la suspensión bacteriana a 900 μL de LB que contienen 0,45 mg/mL de LPS. Incubar a 37 °C durante 24 h con agitación a 200 rpm.
2. Punto de valoración 8: Preparar la octava alícuota para la valoración (el cultivo final potencial no infectado). Este punto es para confirmar la ausencia de reinfección por fagos.

Resultados

Salmonella enterica y otras bacterias gramnegativas tienen una membrana externa que contiene LPS. El antígeno O de LPS es un receptor comúnmente utilizado por los bacteriófagos 9NA para infectar cultivos de Salmonella ^16,17.

Dada la afinidad específica de los bacteriófagos por el antígeno O las regiones polisacáridas centrales del LPS, queríamos examinar si el LPS comercial de Salmonella enterica podría usarse como señuelo para excluir los bacteriófagos 9NA. Para ello, mezclamos concentraciones conocidas del LPS comercial y del lisado de 9NA, seguido de una valoración. Los bacteriófagos comerciales LPS y 9NA se mezclaron en un volumen total de 200 μL y se incubaron durante 2 h a 37 °C sin agitar. Para la valoración, se añadieron 100 μL de la mezcla de LPS-9NA y 60 μL de un cultivo nocturno a 5 mL de agar blando LB y se vertieron en la parte superior de una placa LB. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C. Como se muestra en la Figura 3, el título de lisado disminuye proporcionalmente cuando aumenta la concentración de LPS comercial de S. enterica . Estos resultados indican que el LPS comercial funciona correctamente como señuelo para los bacteriófagos 9NA.

Curiosamente, el tiempo necesario para que el fago 9NA lise las células de Salmonella y libere fagos se ve facilitado por el número de bacterias y fagos (Figura 4). Con el fin de estudiar cómo este aspecto podría afectar al protocolo de eliminación de fagos, probamos diferentes bacterias: proporciones de fagos (1:1, 1:10, 1:100 y 1:1000). Como se ve en la Figura 4, hay una caída en OD_{600 nm} del cultivo a 1,5-2,5 h después de la adición del fago 9NA. Los valores de_{OD 600 nm} cercanos a cero son indicativos de que el cultivo bacteriano está siendo lisado¹⁸. Por esta razón, los tiempos de incubación en este protocolo se definieron como 2 h para garantizar el tiempo suficiente para que los fagos contenidos en el interior de las células de Salmonella lisen las bacterias y sean liberados. Este tiempo debe estimarse para cada sistema de fagos huésped antes de realizar este protocolo.

Una vez que determinamos que el LPS comercial funciona como señuelo y el tiempo de lisis para las bacterias infectadas con 9NA, realizamos el protocolo descrito para la limpieza de cultivos de Salmonella infectados de los bacteriófagos (Figura 1 y Figura 2). Con el fin de monitorizar la presencia de bacteriófagos a lo largo de cada paso del protocolo, se realizaron ensayos de placa para calcular la infectividad de los cultivos resultantes en 100 μL de la mezcla resultante en diferentes puntos (Figura 5). Podemos observar que el lavado y el filtrado repetidos no son suficientes para la eliminación de bacteriófagos de los cultivos (puntos de valoración 1-3); sin embargo, el número de fagos disminuye tan pronto como empleamos una etapa de incubación con LPS comercial (punto de valoración 4). El paso crucial para la eliminación completa de bacteriófagos en un cultivo bacteriano es la segunda incubación con LPS comercial (punto de valoración 6). Este paso es esencial para la eliminación exitosa del bacteriófago 9NA en cultivos de Salmonella .

Un aspecto interesante de este protocolo sería conocer el nivel de resistencia de los fagos después de las etapas de eliminación de fagos. Un procedimiento que separa los fagos de las bacterias resistentes a los fagos no tiene ninguna utilidad. Por esta razón, es crucial revelar que las bacterias que permanecen en el cultivo son susceptibles a los fagos. Para demostrar que las células de fagos susceptibles permanecen en los cultivos después del procedimiento, utilizamos el ensayo en placa de Evans Blue Uranine (EBU) para detectar la contaminación por fagos¹⁹. Las placas de la UBE se fabricaron con medio LB suplementado con 10 mL/L K₂HPO₄ 25%, 5 mL/L de glucosa 50%, 2,5 mL/L de fluoresceína 1%, 1,25 mL/L de Evans Blue 1% y 15 g/L de agar. Se utilizaron rayas cruzadas en placas de EBU con fagos 9NA para discriminar los aislados resistentes y sensibles a los fagos (Figura 6). Los cultivos bacterianos obtenidos al final del protocolo de limpieza se utilizaron para obtener colonias aisladas, las cuales fueron revisadas para detectar contaminación por fagos (Figura 6B). Podemos observar la existencia de células tanto resistentes como sensibles. Este protocolo no favorece la selección de células resistentes a los fagos; solo elimina los bacteriófagos.

Figura 1: Breve esquema del procedimiento para la eliminación de bacteriófagos en cultivos de Salmonella . El flujo de trabajo se divide en diferentes etapas: preparación del cultivo bacteriano y lisado, infección del cultivo bacteriano con bacteriófagos, eliminación de bacteriófagos de cultivos bacterianos infectados y preparación de un inóculo bacteriano libre de fagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Procedimiento para la eliminación de bacteriófagos de los cultivos infectados de Salmonella que ingresan alos cultivos ica. El proceso consta de tres fases: 1) Eliminación de bacteriófagos en suspensión, 2) Eliminación de fagos contenidos en el interior de las células bacterianas y 3) Evitación de la reinfección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ensayo de señuelo de LPS para medir la eficiencia del LPS comercial de Salmonella enterica para unirse a bacteriófagos. Titulación de un lisado de 9NA (PFU/mL) a concentraciones crecientes de LPS comercial de Salmonella enterica . El experimento se llevó a cabo por triplicado. Se presentan la media y la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Tiempo de lisis del bacteriófago 9NA en cultivos de Salmonella . Curvas de crecimiento de los cultivos de Salmonella enterica en presencia de bacteriófago 9NA en proporciones bacteria:fago de 1:1, 1:10, 1:100 y 1:1000. El experimento se llevó a cabo por triplicado. Se presentan la media y la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ensayo de placa para pruebas de infectividad durante la eliminación de bacteriófagos en cultivos de Salmonella . (A) Se tomó la valoración de ocho alícuotas en diferentes puntos del protocolo (los puntos de valoración 1-7 están marcados en la Figura 2). Para este experimento se utilizaron Salmonella enterica serovir, cepa de Typhimurium ATCC 14028 opvAB::lacZ (SV8011) y bacteriófago 9NA. Los experimentos se realizaron por triplicado y se muestran la media y las desviaciones estándar. (B) Las placas de agar blando con Salmonella enterica se obtuvieron siguiendo la técnica de superposición utilizando alícuotas de ocho puntos de valoración. Las placas corresponden de izquierda a derecha con los puntos de valoración 1-8. (C) Densidad óptica a 600 nm de cultivo bacteriano en diferentes momentos del protocolo de eliminación de fagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Pruebas de bacterias resistentes a los fagos después del procedimiento de eliminación de bacteriófagos. (A) Diagrama esquemático de una placa de agar típica de la EBU utilizada para el ensayo de agar de rayas cruzadas: la región oscura vertical en el centro representa la zona de lisado de 9NA. El punto representa la ubicación donde se inoculan las células analizadas a una distancia segura de la zona de lisado, y las líneas continuas horizontales representan las células resistentes a los fagos que crecen en la zona de lisado o las células sensibles a los fagos que no crecen más allá de la zona de lisado. (B) Al final del protocolo de remoción, se obtuvieron ensayos en placa EBU para analizar 11 colonias. Control R y S son ejemplos de aislados resistentes a fagos y sensibles a fagos, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los bacteriófagos emplean diversas estrategias para reconocer e infectar a los huéspedes bacterianos. Diferentes estructuras moleculares en la superficie de las bacterias pueden actuar como receptores de fagos: proteínas, polisacáridos, lipopolisacáridos (LPS) y restos de carbohidratos²⁰. En las bacterias gramnegativas, el LPS es un receptor común para los fagos. Además, otros receptores son las proteínas de la membrana externa, pili y los flagelos²¹.

La interacción específica entre bacteriófagos y bacterias basada en el reconocimiento de LPS⁸ ha sido explotada en este trabajo para el desarrollo de un protocolo altamente eficiente para la eliminación de bacteriófagos en cultivos bacterianos infectados (Figura 1 y Figura 2). Nuestro protocolo no favorece la selección de células resistentes a fagos; solo elimina los bacteriófagos (Figura 6). Tanto las células susceptibles como las resistentes a los fagos permanecen en cultivo bacteriano después de realizar este protocolo de eliminación de fagos.

La práctica estándar tradicional cuando se produce una infección por fagos es intentar eliminar todo el material contaminado, seguido de una limpieza y esterilización²². El procedimiento de descontaminación consiste en exponer el cultivo bacteriano a condiciones estresantes, como altas temperaturas, con el fin de eliminar parcial o completamente las células bacterianas. Como se describe en los resultados representativos, el paso crucial en este protocolo es la incubación de cultivos bacterianos infectados con fagos con LPS comercial, una sustancia no dañina para los cultivos bacterianos. Esto ayuda a preservar la viabilidad de los cultivos bacterianos y ofrece ventajas significativas para aplicaciones industriales en fermentadores y biorreactores.

El tiempo de incubación en este protocolo es de 2 h para garantizar el tiempo suficiente para la lisis de fagos de las células bacterianas. Si se van a utilizar diferentes cepas bacterianas y bacteriófagos, este parámetro debe ser considerado y definido por el usuario. En este caso, se debe realizar un ensayo similar al descrito en la Figura 4 antes del experimento.

Curiosamente, la eficacia de este protocolo de limpieza también podría analizarse mediante el empleo de un ensayo que controle el contenido de fagos de una muestra determinada. En este sentido, los biosensores epigenéticos son una herramienta novedosa para la detección de bacteriófagos²³. Un conocido biosensor de fagos capaz de detectar colifagos, que utilizan LPS como receptor, es el sistema opvAB::gfp 13,18,23,24. Este biosensor de fagos detecta un aumento de la subpoblación de OpvAB^ON en presencia de fagos que utilizan el antígeno O como receptor. En este sentido, podríamos utilizar una fusión opvAB::gfp para monitorizar fagos de unión a LPS en varios pasos de este protocolo y/o en diversos medios y condiciones. Estos enfoques podrían ser valiosos para determinar el momento y los lugares en los que puede ser necesario un protocolo eficaz.

Si bien el reconocimiento de LPS es común, los fagos también pueden utilizar una variedad de otros receptores de superficie en las células bacterianas para la unión y la infección. En este caso, hemos utilizado la Salmonella Gram-negativa como enterobacteria representativa y el bacteriófago 9NA que utiliza el LPS como receptor y desencadenante de la eyección del genoma. Otros fagos de enterobacterias (por ejemplo, Escherichia coli T5) se unen libremente a LPS y requieren una proteína de membrana externa para la inyección del genoma. El protocolo descrito es aplicable para bacteriófagos que reconocen y necesitan el antígeno O de LPS para una infección exitosa, como 9NA, Det7 y P22 13,25,26,27. En consecuencia, la implementación exitosa de este protocolo para la descontaminación de fagos de cultivos bacterianos implica determinar si la fuente de la infección por fagos requiere reconocer LPS en el huésped.

En conclusión, y a pesar de las posibles limitaciones del protocolo, nuestros resultados representativos demuestran claramente que este método es una poderosa herramienta para limpiar los cultivos bacterianos de Salmonella de bacteriófagos que utilizan LPS como receptor y desencadenante de eyección del genoma.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mL syringe	BD Discardit II	300296	No special requirements
50 mL conical tubes	Avantor	525-0610	No special requirements
90 x 14 mm Petri dishes	Deltalab	200209	No special requirements
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	No special requirements
Bacteriophage lysate			Minimal concentration: 109 PFU/mL
Centrifuge	Eppendorf		No special requirements
Chloroform	Panreac	131252	No special requirements
Citric acid · H2O	Merck	1.00247
Colony counter			No special requirements
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E-2129
Flasks			No special requirements
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F-6377
Forceps			No special requirements
Glass tubes			No special requirements
Glass tubes for lysate			No special requirements
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
K2HPO4	Merck	1.05104.1000
K2HPO4 anhydrous	Merck	1.05104
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype Typhimurium	Sigma-Aldrich	L6511-25 mg	Dissolved in sterile water
Membrane 0.45 µm	MF-Millipore	HAWP02500	No special requirements
MgSO4 · 7 H2O	Merck	1.05886
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	No special requirements
NaNH4HPO4 · 4 H2O	Sigma-Aldrich	S9506
Peptone	iNtRON	Ba2001	No special requirements
Syringe Filter 0.22 µm	Millex	SLGSR33SB	No special requirements
Toothpicks			No special requirements
Tryptone	Panreac	403682.1210	No special requirements
Vacuum pump	Thermo Scientific		No special requirements
Yeast extract	iNtRON	48045	No special requirements