Análisis de Expresión Oncogénica con Alteraciones en el pH en una Línea Celular Ductal Pancreática

Resumen

Este estudio describe un protocolo para explorar los efectos del pH alterado en la expresión de oncogenes a través del análisis de RNA-seq de una línea celular ductal pancreática.

Resumen

La cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer, el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC), tiene una tasa de supervivencia a cinco años del 12%. Esta enfermedad tiene un mal pronóstico y se caracteriza por un microambiente estromal rígido, lo que representa un desafío tangible en su tratamiento. Los pacientes con pancreatitis crónica tienen un riesgo 10 veces mayor de desarrollar PDAC; en estos pacientes, el pH ductal disminuye de pH 8,0 a pH 6,0 debido a la insuficiencia de bicarbonato y al medio inflamatorio. Nuestro objetivo fue comprender el papel del ambiente ácido observado en la pancreatitis crónica sobre la expresión oncogénica en una línea celular ductal pancreática.

Por lo tanto, el 80% de las células epiteliales ductales pancreáticas humanas confluentes se incubaron a pH 6,0 a pH 7,2 durante 6 h. El ARN total de las células se procesó para enriquecer el ARNm total de las muestras. La expresión génica se evaluó mediante secuenciación de nueva generación (NGS) de réplicas biológicas. El análisis de RNA-seq se llevó a cabo con la ayuda de una herramienta en línea y se identificaron los genes expresados diferencialmente (FCs < ± 2.0); había 90, 148 y 109 genes regulados al alza y 20, 14 y 23 genes regulados a la baja a pH 6.0, 6.5 y 7.0, respectivamente. Cuatro oncogenes se regularon al alza a pH 6.0, siete a pH 6.5 y siete a pH 7.0. Los genes comunes que se regularon al alza a pH 6.0, pH 6.5 y pH 7.0 fueron la proteína tirosina quinasa específica de células linfocitarias (LCK) [pH 6.0, FC: 2.93; pH 6.5, FC: 2.93; pH 7.0, FC: 3.32], FGR protooncogén, tirosina quinasa de la familia Src (FGR) [pH 6.0, FC: 4.17; pH 6.5, FC: 5.25; pH 7.0, FC: 5.09] y ArfGAP con dominio SH3, repetición de anquirina y dominio de PH 3 (ASAP3) [pH 6,0, FC: 2,37; pH 6,5, FC: 3,84; pH 7,0, FC: 2,51]. El ambiente ácido desencadena la activación de protooncogenes, que pueden desencadenar la iniciación del tumor en la pancreatitis crónica.

Introducción

El adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) es uno de los principales cánceres y ocupa el cuarto lugar entre los cánceres en términos de número de muertes relacionadas¹. Una tasa de mortalidad más alta es evidente entre los pacientes con PDAC y, según estudios recientes, la tasa de supervivencia a cinco años es solo del 12%. Los pacientes con pancreatitis crónica documentada, una enfermedad que provoca la inflamación del páncreas², tienen más probabilidades (aproximadamente 15-16 veces) de desarrollar PDAC³. Existen varios tipos de parálisis cerebral con diferentes etiologías, como la parálisis cerebral relacionada con el alcohol, hereditaria e idiopática⁴. Se sabe que las condiciones que existen durante la parálisis cerebral conducen a la formación de cálculos calcificados, el desarrollo de células cancerosas e incluso la diabetes. La prevalencia de PDAC es alta en pacientes con pancreatitis crónica hereditaria⁵.

Algunas condiciones fisiológicas dentro del páncreas de los pacientes con PC podrían ser beneficiosas para el inicio de otras dolencias; estos incluyen el medio inflamatorio, las enzimas digestivas activas y el pH ácido del jugo pancreático⁶. Se están llevando a cabo una amplia gama de estudios en el área de la inflamación, ya que la inflamación crea un caos en el funcionamiento normal del órgano ^7,8,9. Sin embargo, un desequilibrio en la regulación del pH es otro fenómeno que podría desencadenar el inicio del crecimiento descontrolado de las células¹⁰. El jugo pancreático de las personas sanas es alcalino, lo que ayuda a neutralizar el quimo ácido producido por el estómago. Por el contrario, el jugo pancreático permanece ácido en los pacientes con PC debido a la secreción insuficiente de bicarbonato. Los niveles bajos de bicarbonato no pueden neutralizar completamente el jugo, lo que da como resultado un ambiente ligeramente ácido dentro del conducto¹¹.

Estudios anteriores indican que las células cancerosas se adaptan y prosperan en ambientes ácidos¹². En estos casos, las condiciones que existen durante el proceso de pancreatitis crónica sugieren un ambiente favorable para la proliferación y metástasis de estas células¹³. Por lo tanto, nuestro estudio tuvo como objetivo evaluar los cambios morfológicos en las células ductales pancreáticas humanas y evaluar la expresión del oncogén en condiciones ligeramente ácidas.

Protocolo

1. Reactivación de la línea celular

1. Obtenga la línea celular ductal pancreática normal humana (HPDEC / H6C7) y reviva las células en medio fresco.
   1. Descongele las células a 37 °C en un baño de agua.
   2. Prepare el medio completo recién preparado y fíltrelo con un filtro de jeringa.
      NOTA: El medio completo contiene el medio Eagle's modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS).
   3. Agregue 6 mL del medio completo a un tubo cónico fresco de 15 mL, agregue la suspensión celular descongelada y mezcle bien.
   4. Centrifugar la suspensión a 1.800 × g durante 6 min. Deseche el sobrenadante, agregue 1 mL de medio de cultivo al pellet y mezcle suavemente.
      NOTA: El medio de cultivo contiene DMEM con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibióticos pen/estreptococos.
   5. Añadir las células gota a gota a un matraz T-25 que contenga 4 mL de medio de cultivo e incubar a 37 °C, 5% de CO₂.

2. Cambiar el pH del medio de cultivo

1. Prepare 100 mL de soluciones tampón de fosfato de sodio 0,5 M con valores de pH de 6,0, 6,5 y 7,0 como se menciona en la Tabla 1.
2. Verifique el pH con un medidor de pH y ajústelo usando 1 N HCl/1 M NaOH.
3. Filtre-esterilice los tampones en una campana de flujo de aire laminar con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
   NOTA: El tampón puede almacenarse a 4 °C hasta su uso posterior.
4. Prepare los medios de cultivo con valores de pH de 6,0, 6,5 y 7,0 añadiendo 20 mL de tampón de fosfato sódico estéril de 0,5 M con el pH respectivo a 80 mL de medio de cultivo.
5. Agregue el medio con el pH alterado a células ductales pancreáticas humanas confluentes al 85-90% y verifique los cambios morfológicos bajo un microscopio de campo claro a intervalos de 1 h durante 6 h.

3. Aislamiento de ARN

NOTA: Se deben usar guantes estériles para el aislamiento del ARN de las células y la superficie debe descontaminarse con etanol al 100%.

1. Retire el medio de cultivo y enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Coloque el plato en hielo, agregue PBS al pozo y luego raspe las celdas con un raspador de celdas.
   NOTA: La cantidad de PBS agregada debe ser suficiente para cubrir las celdas para el raspado. No es necesario agregar un gran volumen de PBS.
3. Recoja la suspensión en un tubo nuevo y centrifugue a 8.000 ×g durante 10 min. Deseche el sobrenadante.
4. Añada tampón de lisis que contenga β-mercaptoetanol al pellet y pipetelo hacia arriba y hacia abajo durante 5-10 minutos en hielo.
5. Agregue un volumen igual de etanol al 70% al lisado y mezcle bien. No haga vórtice.
6. Agregue la solución a la columna de membrana de sílice, centrifugue a >8,000 ×g durante 30 s y deseche el flujo.
7. Añada tampón de lavado a la muestra y centrifugue a >8.000 ×g durante 30 s. Centrifugar el tubo vacío durante 1 min a >8.000 ×g.
8. Añadir 30-50 μL de agua sin nucleasas a la columna y dejar actuar durante 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar la columna a >8.000 ×g durante 5 min.
   NOTA: Las muestras de ARN pueden almacenarse a -20 °C hasta su uso posterior.

4. RNA-seq/Transcriptoma

1. Evaluación de la integridad del ARN
   1. Compruebe la integridad del ARN en un bioanalizador tomando 1 μL (25-500 ng) y mezclándolo con 5 μL de tampón de colorante.
   2. Agite la solución a 500 ×g durante 1 minuto y gire brevemente.
   3. Ejecute una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de un solo paso para cada muestra a 72 °C durante 3 minutos y, a continuación, tome los tubos e ínguelos en hielo durante 2 minutos antes de analizarlos con un bioanalizador.
2. ARN total deplecionado por ARNr
   1. Agregue 5 μg de ARN total, 50 μL de tampón de hibridación y 1-3 μL de mezcla de sonda a un tubo de PCR nuevo.
   2. Realice los siguientes pasos: primer paso, desnaturalización a 70 °C durante 10 min; segundo paso, hibridación a 37 °C durante 20 min; e incubación a 37 °C hasta su uso.
   3. En un tubo nuevo, agregue 500 μL de perlas magnéticas y la muestra; Coloque la mezcla en un soporte magnético durante 1 minuto hasta que la solución se vuelva clara.
   4. Deseche con cuidado el sobrenadante. Retire el tubo, lave las perlas añadiendo 500 μL de agua sin nucleasas y vuelva a colocar la mezcla en el soporte magnético durante 1 min. Retire el sobrenadante una vez que la solución se aclare.
   5. Repita el proceso 5-7 veces. Añadir 200 μL de tampón de hibridación y mezclar bien. Mantenga los tubos a 37 °C durante 5 min.
   6. Añadir 100 μL de sonda de ARN a la mezcla anterior, mezclar suavemente e incubar la mezcla a 37 °C durante 15 min.
   7. Gire brevemente el tubo antes de colocarlo en el soporte magnético durante 1 minuto.
   8. Recoja el sobrenadante transparente que contiene el ARN agotado en ARNr en un tubo nuevo.
3. Fragmentación del ARN
   1. En un tubo de PCR nuevo, agregue 8-10 μL de ARN total deplecionado en ARNr (500 ng/g), 1 μL de tampón 10x y 1 μL de ARNasa III.
   2. Mezcle la solución dando golpecitos y girando brevemente.
   3. Coloque los tubos en un termociclador durante 10 minutos a 37 °C.
   4. En un tubo nuevo, agregue 5 μL de perlas de unión a ácidos nucleicos y luego agregue 90 μL de concentrado de solución de unión.
   5. Agregue 30 μL de los fragmentos de ARN y 150 μL de etanol al 100% a la mezcla anterior. Mezcle la muestra pipeteando 10x y cogélela durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   6. Coloque los tubos en el soporte magnético hasta que la solución se aclare. Retire y deseche el sobrenadante.
   7. Lave las perlas con 150 μL de etanol mientras los tubos están en un soporte magnético; Deje reposar la mezcla durante 30 segundos y luego retire el sobrenadante.
   8. Deje los tubos en un soporte magnético durante 1-2 minutos para permitir que el etanol restante se evapore.
   9. Agregue 12 μL de agua precalentada sin nucleasas a las perlas y mezcle la muestra pipeteando 10 veces.
   10. Incubar la muestra durante 1 min a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un soporte magnético y recoja el sobrenadante una vez que esté claro.
4. Preparación de bibliotecas y preparación de ADNc
   1. Agregue 3 μL de la muestra de ARN fragmentado a un tubo de PCR y luego agregue 5 μL de mezcla de hibridación. Mezcle la muestra pipeteándola varias veces y, a continuación, centrifuga brevemente la muestra.
   2. Mantenga los tubos en un termociclador durante 10 minutos a 65 °C, seguidos de 5 minutos a 30 °C.
   3. Agregue 10 μL de tampón de ligadura y 2 μL de mezcla de enzimas de ligadura a la solución anterior. Incubar la reacción en un termociclador durante 1 h a 30 °C.
   4. Añadir la mezcla maestra de transcriptasa inversa a la mezcla de ligadura e incubar a 70 °C durante 10 min, seguido de la incubación en hielo.
5. Amplificación de ADNc
   1. Agregue 6 μL de ADNc (500 ng) a un tubo de PCR nuevo y luego agregue 46 μL de mezcla de PCR con código de barras de un tubo que contenga 46 μL de enzima polimerasa de alta fidelidad y 1 μL de cebadores de códigos de barras 3'.
   2. Configure las condiciones de PCR de la siguiente manera: primera etapa, mantener a 94 °C durante 2 minutos; segunda etapa, ciclos a 94 °C durante 30 s y a 50 °C durante 30 s; tercera etapa, 16 ciclos a 94 °C durante 30 s, 62 °C durante 30 s y 68 °C durante 30 s. Mantenga la reacción a 68 °C durante 5 min.
   3. Purifique el ADNc amplificado repitiendo los pasos 4.3.5 a 4.3.10 y reemplace la muestra de ARN fragmentado con el producto de PCR obtenido en el paso anterior.
   4. Analice la muestra de ARN purificada en un secuenciador (NGS) para generar datos en forma de archivos FASTq.

5. Bioinformática

1. Abra la herramienta de la galaxia disponible en línea copiando y pegando el enlace: https://usegalaxy.org en la pestaña de búsqueda del navegador.
2. En la primera visita a este sitio, regístrese para obtener un perfil haciendo clic en iniciar sesión o en la opción de registro en la esquina superior derecha.
3. Después de crear una cuenta, inicie sesión en la cuenta completando el nombre público/nombre de usuario y la contraseña.
4. Cargue los archivos FASTq obtenidos después del análisis de RNA-seq haciendo clic en la opción de carga en el panel lateral izquierdo.
5. Seleccione la herramienta cutadapt de la sección de herramientas en el panel lateral izquierdo. Esta herramienta recortará secuencias de baja calidad.
   NOTA: Este archivo ahora se puede utilizar para la asignación.
6. Haga clic en el botón de la herramienta en el panel lateral izquierdo y busque la herramienta estrella de ARN. Rellene los detalles de la siguiente manera: Utilice el archivo de salida de cutadapt, seleccione el genoma de referencia como genoma de referencia humano (hg38) y cambie la longitud de la secuencia genómica alrededor de las uniones anotadas a 36. Seleccione la salida como recuento de genes y haga clic en la opción de ejecutar herramienta en la esquina superior derecha.
   NOTA: Esta herramienta generará un archivo BAM.
7. Seleccione la herramienta featurecounts de las opciones de la herramienta y cargue los archivos BAM obtenidos después del análisis de estrellas de ARN. Establezca la opción de calidad de asignación mínima por lectura en las opciones de filtrado de lectura en 10 y haga clic en la opción de herramienta de ejecución en la esquina superior derecha.
8. Abra el archivo de salida featurecount desde el panel derecho y copie los datos en una hoja de cálculo. Calcule el cambio de plegamiento en relación con el control dividiendo el número de recuentos de lectura obtenidos en la prueba por el número de recuentos de leídas obtenidos en el control con el comando =log (cambio de plegamiento, 2).
   NOTA: Se considera que un cambio de plegamiento <-2.0 indica una regulación a la baja y un cambio de plegado > 2.0 se considera una regulación al alza.

Resultados

Cambios morfológicos
La incubación de células ductales pancreáticas humanas en un medio ácido alteró la morfología de las células. Un patrón celular confluente y muy apretado dio como resultado células dispersas en condiciones ácidas, y la muerte celular se vuelve prominente con el tiempo. En comparación con las células normales que contienen medio, las células ductales se encogieron y disminuyeron de tamaño. Se observó un cambio drástico en la tasa d...

Discusión

Este método se desarrolló para determinar los efectos de las condiciones ácidas en las células epiteliales ductales pancreáticas humanas no cancerosas en repeticiones biológicas. Un cambio en el pH del medio provocó que las células se encontraran en un estado de estrés, y se observó un cambio en la morfología. Las células se cultivaron a pH 6,0, 6,5 o 7,0 durante 24 horas y se monitorearon cada hora para optimizar el período de incubación para experimentos posteriores. Obse...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL graduated centrifuge tubes (Falcon)	Tarsons	500031	used for sample preparation
50 mL graduated centrifuge tubes (Falcon)	Tarsons	500041	used for sample preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument	Agilent	Agilent G2938A	Instrment for RNA quality assessment
Antibiotic Antimycotic Solution 100x liquid	Himedia	A002-100 mL	Used to prevent contamination
Cell Scraper with rotatable blade	Himedia	TCP223	Scraping and collecting the cells
CO2 incubator	New Brunswick	Galaxy 170 S	Used for incubating the culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	Himedia	AL007S-500 mL	Medium used for culturing the cells
Dulbecco's Phosphate Buffered saline 1x	Himedia	TL1006-500mL	cell washing
Galaxy	(https://usegalaxy.org)		Online tool for processing NSG Data
HI FBS (origin: Australia)	Gibco	10100-147	Used for the growth of cells
Human Pancreatic Ductal Epithelial Cell Line (HPDEC/ H6C7)	Addex Bio	T0018001	Pancreatic ductal cell line
Ion Total RNA-Seq Kit v2	Thermo fisher scientific	4475936	RNA sample preparation kit
Laminar Air Flow
Na2HPO4 Diabasic	Sigma Aldrich	S3264-250G	Sodium phosphate buffer preparation
NaH2PO4 Monobasic	Sigma Aldrich	S3139-250G	Sodium phosphate buffer preparation
NovaSeq 6000	Illumina	3376672	Sequencer
Nunclon Delta Surface (6-well plate)	Thermo Scientific	140675	Culturing the cells
Refrigerated benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8R	Used for centrifugation
RiboMinus Eukaryote System v2	Thermo fisher scientific	A15026	rRNA depletion kit
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	Kit for isolating Total RNA from cells
Thermal cycler	Eppendorf	E950040025	PCR reaction
Water Bath	Equitron	#8406M	Thawing of sample