Analyse de l’expression oncogène avec altérations du pH dans une lignée cellulaire canalaire pancréatique

Résumé

Cette étude décrit un protocole pour explorer les effets de la modification du pH sur l’expression de l’oncogène via l’analyse par séquençage de l’ARN d’une lignée cellulaire canalaire pancréatique.

Résumé

La quatrième cause de décès lié au cancer, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), a un taux de survie à cinq ans de 12 %. Cette maladie a un mauvais pronostic et se caractérise par un microenvironnement stromal rigide, ce qui représente un défi tangible dans son traitement. Les patients atteints de pancréatite chronique ont un risque 10 fois plus élevé de développer un PDAC ; chez ces patients, le pH canalaire diminue de pH 8,0 à pH 6,0 en raison de l’insuffisance en bicarbonate et du milieu inflammatoire. Notre objectif était de comprendre le rôle de l’environnement acide observé dans la pancréatite chronique sur l’expression de l’oncogène dans une lignée cellulaire canalaire pancréatique.

Par conséquent, 80 % des cellules épithéliales canalaires pancréatiques humaines confluentes ont été incubées à un pH de 6,0 à un pH de 7,2 pendant 6 h. L’ARN total des cellules a été traité pour enrichir l’ARNm total dans les échantillons. L’expression génique a été évaluée par séquençage de nouvelle génération (NGS) de réplicats biologiques. L’analyse RNA-seq a été réalisée à l’aide d’un outil en ligne, et les gènes exprimés différentiellement (FC < ± 2.0) ont été identifiés ; il y avait 90, 148 et 109 gènes régulés à la hausse et 20, 14 et 23 gènes régulés à la baisse à pH 6,0, 6,5 et 7,0, respectivement. Quatre oncogènes ont été régulés à la hausse à pH 6,0, sept ont été régulés à la hausse à pH 6,5 et sept ont été régulés à la hausse à pH 7,0. Les gènes communs qui ont été régulés à la hausse à pH 6,0, pH 6,5 et pH 7,0 étaient la protéine tyrosine kinase (LCK) spécifique des cellules lymphocytaires [pH 6,0, FC : 2,93 ; pH 6,5, FC : 2,93 ; pH 7,0, FC : 3,32], le proto-oncogène FGR, la tyrosine kinase de la famille Src (FGR) [pH 6,0, FC : 4,17 ; pH 6,5, FC : 5,25 ; pH 7,0, FC : 5,09] et ArfGAP avec le domaine SH3, répétition d’ankyrine et domaine de PH 3 (ASAP3) [pH 6,0, FC : 2,37 ; pH 6,5, FC : 3,84 ; pH 7,0, FC : 2,51]. L’environnement acide déclenche l’activation des proto-oncogènes, ce qui peut déclencher l’initiation de la tumeur dans la pancréatite chronique.

Introduction

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’un des principaux cancers et se classe au quatrième rang des cancers en termes de nombre de décès liés¹. Un taux de mortalité plus élevé est évident chez les patients atteints de PDAC et, selon des études récentes, le taux de survie à cinq ans n’est que de 12 %. Les patients atteints de pancréatite chronique documentée, une maladie entraînant une inflammation du pancréas², sont plus susceptibles (environ 15 à 16 fois) de développer un PDAC³. Il existe différents types de PC avec des étiologies différentes, telles que la PC⁴ liée à l’alcool, héréditaire et idiopathique. Les conditions qui existent pendant la PC sont connues pour conduire à la formation de calculs calcifiés, au développement de cellules cancéreuses et même au diabète. La prévalence de la PDAC est élevée chez les patients atteints de pancréatite chronique héréditaire⁵.

Certaines conditions physiologiques du pancréas des patients atteints de PC pourraient être bénéfiques pour l’initiation d’autres affections ; Il s’agit notamment du milieu inflammatoire, des enzymes digestives actives et du pH acide du suc pancréatique⁶. Un large éventail d’études sont menées dans le domaine de l’inflammation, car l’inflammation crée le chaos dans le fonctionnement normal de l’organe ^7,8,9. Cependant, un déséquilibre dans la régulation du pH est un autre phénomène qui pourrait déclencher le déclenchement de la croissance incontrôlée des cellules¹⁰. Le suc pancréatique des individus en bonne santé est alcalin, ce qui aide à neutraliser le chyme acide produit par l’estomac. En revanche, le suc pancréatique reste acide chez les patients atteints de PC en raison d’une sécrétion insuffisante de bicarbonate. De faibles niveaux de bicarbonate ne peuvent pas neutraliser complètement le jus, ce qui entraîne un environnement légèrement acide dans le canal¹¹.

Des études antérieures indiquent que les cellules cancéreuses s’adaptent et prospèrent dans des environnements acides¹². Dans de tels cas, les conditions qui existent au cours du processus de pancréatite chronique suggèrent un environnement favorable à la prolifération et aux métastases de ces cellules¹³. Par conséquent, notre étude visait à évaluer les changements morphologiques dans les cellules canalaires pancréatiques humaines et à évaluer l’expression de l’oncogène dans des conditions légèrement acides.

Protocole

1. Renaissance de la lignée cellulaire

1. Procurez-vous la lignée cellulaire canalaire pancréatique normale humaine (HPDEC / H6C7) et faites revivre les cellules dans un milieu frais.
   1. Décongelez les cellules à 37 °C dans un bain-marie.
   2. Préparez fraîchement un milieu complet et filtrez-le à l’aide d’un filtre à seringue.
      REMARQUE : Le milieu complet contient le milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS).
   3. Ajoutez 6 ml du milieu complet dans un tube conique frais de 15 ml, ajoutez la suspension cellulaire décongelée et mélangez soigneusement.
   4. Centrifuger la suspension à 1 800 × g pendant 6 min. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de milieu de culture à la pastille et mélanger délicatement.
      REMARQUE : Le milieu de culture contient du DMEM avec 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotiques pen/streptocoque.
   5. Ajouter les cellules goutte à goutte dans une fiole T-25 contenant 4 mL de milieu de culture et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂.

2. Modification du pH du milieu de culture

1. Préparez 100 mL de solutions mères de phosphate de sodium 0,5 M avec des valeurs de pH de 6,0, 6,5 et 7,0 comme indiqué dans le tableau 1.
2. Vérifiez le pH à l’aide d’un pH-mètre et ajustez-le à l’aide de 1 N HCl/1 M NaOH.
3. Stérilisez les tampons dans une hotte à flux d’air laminaire avec un filtre à seringue de 0,45 μm.
   REMARQUE : Le tampon peut être stocké à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
4. Préparez un milieu de culture avec des pH de 6,0, 6,5 et 7,0 en ajoutant 20 ml de tampon de phosphate de sodium stérile de 0,5 M avec le pH correspondant à 80 ml de milieu de culture.
5. Ajoutez le milieu avec le pH modifié à 85-90 % de cellules canalaires pancréatiques humaines confluentes, et vérifiez les changements morphologiques sous un microscope à fond clair à 1 h d’intervalle pendant 6 h.

3. Isolement de l’ARN

REMARQUE : Des gants stériles doivent être utilisés pour l’isolement de l’ARN des cellules et la surface doit être décontaminée avec de l’éthanol à 100 %.

1. Retirez le milieu de culture et rincez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Placez la plaque sur de la glace, ajoutez du PBS dans le puits, puis grattez les cellules avec un grattoir cellulaire.
   REMARQUE : La quantité de PBS ajoutée doit être suffisante pour couvrir les cellules pour le grattage. Il n’est pas nécessaire d’ajouter un volume élevé de PBS.
3. Recueillir la suspension dans un tube frais et la centrifuger à 8 000 ×g pendant 10 min. Jetez le surnageant.
4. Ajoutez un tampon de lyse contenant du β-mercaptoéthanol à la pastille et pipetez-la de haut en bas pendant 5 à 10 minutes sur de la glace.
5. Ajoutez un volume égal d’éthanol à 70 % au lysat et mélangez soigneusement. Ne faites pas de vortex.
6. Ajouter la solution dans la colonne à membrane de silice, centrifuger à >8 000 ×g pendant 30 s et jeter l’écoulement.
7. Ajouter le tampon de lavage à l’échantillon et centrifuger à >8 000 ×g pendant 30 s. Centrifugez le tube vide pendant 1 min à 8 000 × >.
8. Ajoutez 30 à 50 μL d’eau sans nucléase dans la colonne et laissez-la pendant 5 min à température ambiante. Centrifugez la colonne à 8 000 > ×g pendant 5 min.
   REMARQUE : Les échantillons d’ARN peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

4. Séquençage de l’ARN/transcriptome

1. Évaluation de l’intégrité de l’ARN
   1. Vérifiez l’intégrité de l’ARN dans un bioanalyseur en prélevant 1 μL (25-500 ng) et en le mélangeant avec 5 μL de tampon de colorant.
   2. Agitez la solution à 500 ×g pendant 1 min et tournez brièvement.
   3. Exécutez une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en une étape pour chaque échantillon à 72 °C pendant 3 min, puis prenez les tubes et incuberez-les sur de la glace pendant 2 min avant de les analyser avec un bioanalyseur.
2. ARN total appauvri en ARNr
   1. Ajoutez 5 μg d’ARN total, 50 μL de tampon d’hybridation et 1 à 3 μL de mélange de sonde dans un tube PCR frais.
   2. Effectuez les étapes suivantes : première étape, dénaturation à 70 °C pendant 10 min ; deuxième étape, hybridation à 37 °C pendant 20 min ; et incubation à 37 °C jusqu’à l’utilisation.
   3. Dans un tube frais, ajoutez 500 μL de billes magnétiques et l’échantillon ; Placez le mélange sur un support magnétique pendant 1 min jusqu’à ce que la solution devienne claire.
   4. Jetez soigneusement le surnageant. Retirez le tube, lavez les billes en ajoutant 500 μL d’eau sans nucléases et replacez le mélange sur le support magnétique pendant 1 min. Retirez le surnageant une fois que la solution devient claire.
   5. Répétez le processus 5 à 7 fois. Ajouter 200 μL de tampon d’hybridation et bien mélanger. Maintenez les tubes à 37 °C pendant 5 min.
   6. Ajouter 100 μL de sonde d’ARN au mélange ci-dessus, mélanger doucement et incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min.
   7. Faites tourner brièvement le tube avant de le placer sur le support magnétique pendant 1 min.
   8. Prélevez le surnageant clair contenant l’ARN appauvri en ARNr dans un tube frais.
3. Fragmentation de l’ARN
   1. Dans un tube PCR frais, ajoutez 8 à 10 μL d’ARN total appauvri en ARNr (500 ng/g), 1 μL de tampon 10x et 1 μL de RNase III.
   2. Mélangez la solution en tapotant et en tournant brièvement.
   3. Placez les tubes dans un thermocycleur pendant 10 min à 37 °C.
   4. Dans un tube frais, ajoutez 5 μL de billes de liaison d’acide nucléique, puis 90 μL de concentré de solution de liaison.
   5. Ajoutez 30 μL de fragments d’ARN et 150 μL d’éthanol à 100 % au mélange ci-dessus. Mélangez l’échantillon en pipetant 10 fois et incubez-le pendant 5 min à température ambiante.
   6. Placez les tubes sur le support magnétique jusqu’à ce que la solution devienne claire. Retirez et jetez le surnageant.
   7. Lavez les billes avec 150 μL d’éthanol pendant que les tubes sont sur un support magnétique ; Laissez reposer le mélange pendant 30 secondes, puis retirez le surnageant.
   8. Laissez les tubes sur un support magnétique pendant 1 à 2 minutes pour permettre à l’éthanol restant de s’évaporer.
   9. Ajoutez 12 μL d’eau préchauffée sans nucléase dans les billes et mélangez l’échantillon en pipetant 10 fois.
   10. Incuber l’échantillon pendant 1 min à température ambiante. Placez les tubes sur un support magnétique et récupérez le surnageant une fois qu’il est clair.
4. Préparation de banques et préparation d’ADNc
   1. Ajoutez 3 μL de l’échantillon d’ARN fragmenté dans un tube PCR, puis ajoutez 5 μL de mélange d’hybridation. Mélangez l’échantillon en le pipetant plusieurs fois, puis faites-le tourner brièvement.
   2. Conservez les tubes dans un thermocycleur pendant 10 min à 65 °C, puis 5 min à 30 °C.
   3. Ajoutez 10 μL de tampon de ligature et 2 μL de mélange d’enzymes de ligature à la solution ci-dessus. Incuber la réaction dans un thermocycleur pendant 1 h à 30 °C.
   4. Ajouter le mélange maître de transcriptase inverse au mélange de ligature et incuber à 70 °C pendant 10 min, suivi d’une incubation sur glace.
5. Amplification de l’ADNc
   1. Ajoutez 6 μL d’ADNc (500 ng) dans un tube de PCR frais, puis ajoutez 46 μL de mélange de PCR à code-barres à partir d’un tube contenant 46 μL d’enzyme polymérase haute fidélité et 1 μL d’amorces de code-barres 3'.
   2. Réglez les conditions de PCR comme suit : première étape, maintenir à 94 °C pendant 2 min ; deuxième étage, cycles à 94 °C pendant 30 s et à 50 °C pendant 30 s ; troisième étage, 16 cycles à 94 °C pendant 30 s, 62 °C pendant 30 s et 68 °C pendant 30 s. Maintenez la réaction à 68 °C pendant 5 min.
   3. Purifiez l’ADNc amplifié en répétant les étapes 4.3.5 à 4.3.10 et remplacez l’échantillon d’ARN fragmenté par le produit de PCR obtenu à l’étape précédente.
   4. Analysez l’échantillon d’ARN purifié sur un séquenceur (NGS) pour générer des données sous forme de fichiers FASTq.

5. Bioinformatique

1. Ouvrez l’outil galaxy disponible en ligne en copiant-collant le lien : https://usegalaxy.org dans l’onglet de recherche du navigateur.
2. Lors de la première visite sur ce site, inscrivez-vous pour obtenir un profil en cliquant sur l’option de connexion ou d’inscription dans le coin supérieur droit.
3. Après avoir créé un compte, connectez-vous au compte en remplissant le nom public/nom d’utilisateur et le mot de passe.
4. Téléchargez les fichiers FASTq obtenus après l’analyse RNA-seq en cliquant sur l’option de téléchargement dans le panneau latéral gauche.
5. Sélectionnez l’outil cutadapt dans la section des outils du panneau latéral gauche. Cet outil permet de couper les séquences de mauvaise qualité.
   REMARQUE : Ce fichier peut maintenant être utilisé pour la cartographie.
6. Cliquez sur le bouton de l’outil sur le panneau latéral gauche et recherchez l’outil ARN étoile. Remplissez les détails comme suit : utilisez le fichier de sortie de cutadapt, sélectionnez le génome de référence comme génome de référence humain (hg38) et modifiez la longueur de la séquence génomique autour des jonctions annotées à 36. Sélectionnez la sortie sous forme de nombre de gènes et cliquez sur l’option Exécuter l’outil dans le coin supérieur droit.
   REMARQUE : Cet outil génère un fichier BAM.
7. Sélectionnez l’outil featurecounts dans les options de l’outil et téléchargez les fichiers BAM obtenus après l’analyse des étoiles d’ARN. Définissez la qualité de mappage minimale par lecture dans les options de filtrage de lecture sur 10, puis cliquez sur l’option Exécuter l’outil dans le coin supérieur droit.
8. Ouvrez le fichier de sortie featurecount à partir du panneau de droite et copiez les données dans une feuille de calcul. Calculez le changement de pliage par rapport au contrôle en divisant le nombre de comptes de lecture obtenus dans le test par le nombre de comptes de lecture obtenus dans le contrôle avec la commande =log (changement de pli, 2).
   REMARQUE : Un changement de pli <-2.0 est considéré comme une régulation descendante et un changement de pli > 2.0 est considéré comme une régulation ascendante.

Résultats

Changements morphologiques
L’incubation de cellules canalaires pancréatiques humaines dans un milieu acide a modifié la morphologie des cellules. Un modèle cellulaire confluent et serré a entraîné la dispersion des cellules dans des conditions acides, et la mort cellulaire devient importante avec le temps. Par rapport aux cellules normales contenant du milieu, les cellules canalaires ont rétréci et diminué de taille. Un changement drastique du taux de morta...

Discussion

Cette méthode a été développée pour déterminer les effets des conditions acides sur les cellules épithéliales canalaires pancréatiques humaines non cancéreuses dans des répétitions biologiques. Un changement dans le pH du milieu a provoqué un état de stress chez les cellules et un changement dans la morphologie a été observé. Les cellules ont été cultivées à un pH de 6,0, 6,5 ou 7,0 pendant 24 h et surveillées toutes les heures afin d’optimiser la période d’inc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL graduated centrifuge tubes (Falcon)	Tarsons	500031	used for sample preparation
50 mL graduated centrifuge tubes (Falcon)	Tarsons	500041	used for sample preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument	Agilent	Agilent G2938A	Instrment for RNA quality assessment
Antibiotic Antimycotic Solution 100x liquid	Himedia	A002-100 mL	Used to prevent contamination
Cell Scraper with rotatable blade	Himedia	TCP223	Scraping and collecting the cells
CO2 incubator	New Brunswick	Galaxy 170 S	Used for incubating the culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	Himedia	AL007S-500 mL	Medium used for culturing the cells
Dulbecco's Phosphate Buffered saline 1x	Himedia	TL1006-500mL	cell washing
Galaxy	(https://usegalaxy.org)		Online tool for processing NSG Data
HI FBS (origin: Australia)	Gibco	10100-147	Used for the growth of cells
Human Pancreatic Ductal Epithelial Cell Line (HPDEC/ H6C7)	Addex Bio	T0018001	Pancreatic ductal cell line
Ion Total RNA-Seq Kit v2	Thermo fisher scientific	4475936	RNA sample preparation kit
Laminar Air Flow
Na2HPO4 Diabasic	Sigma Aldrich	S3264-250G	Sodium phosphate buffer preparation
NaH2PO4 Monobasic	Sigma Aldrich	S3139-250G	Sodium phosphate buffer preparation
NovaSeq 6000	Illumina	3376672	Sequencer
Nunclon Delta Surface (6-well plate)	Thermo Scientific	140675	Culturing the cells
Refrigerated benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8R	Used for centrifugation
RiboMinus Eukaryote System v2	Thermo fisher scientific	A15026	rRNA depletion kit
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	Kit for isolating Total RNA from cells
Thermal cycler	Eppendorf	E950040025	PCR reaction
Water Bath	Equitron	#8406M	Thawing of sample