Producción de un sistema de partículas similar al virus SARS-CoV-2 para investigar los ciclos de vida virales in vitro

Resumen

Presentamos un protocolo in vitro optimizado para producir partículas similares al virus SARS-CoV-2 que imitan de cerca al virus auténtico. Este enfoque permite la investigación de los mecanismos de infección, ensamblaje y salida virales sin las limitaciones de requerir un laboratorio de nivel de bioseguridad 3.

Resumen

El método de partículas similares al virus del síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) ofrece una herramienta potente y accesible para estudiar el ciclo de vida del SARS-CoV-2 sin necesidad de laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3). Este sistema imita eficazmente las etapas críticas del ciclo de vida viral, incluido el ensamblaje, el empaquetamiento del genoma y la salida, utilizando un reportero de luciferasa fusionado con la señal T20 para una detección sensible y precisa de la producción de partículas virales. Las SC2-VLP se generan mediante la coexpresión de proteínas estructurales del SARS-CoV-2, incluidas la membrana (M), la nucleocápside (N), la envoltura (E) y la espícula (S), junto con la señal de empaquetamiento de ARN en las células HEK-293T. A diferencia de los sistemas tradicionales de partículas similares a virus, el método SC2-VLP garantiza una cuantificación precisa y una mayor fidelidad al ciclo de vida viral natural. Además, en comparación con los métodos de pseudotipado lentiviral, que se limitan a estudiar la entrada viral a través de la incorporación de la proteína S en partículas lentivirales basadas en el VIH, el sistema SC2-VLP proporciona una plataforma más completa para explorar múltiples etapas de la biología del SARS-CoV-2. Mientras tanto, este método evita los riesgos de manejar virus en vivo y amplía la accesibilidad. El método SC2-VLP representa un avance significativo en la investigación antiviral y el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el SARS-CoV-2.

Introducción

La pandemia de COVID-19 se ha convertido en una de las crisis sanitarias mundiales más devastadoras de la historia moderna, que ha provocado millones de muertes en todo el mundo¹. El virus responsable, el SARS-CoV-2, sigue un ciclo de vida complejo que incluye etapas clave como la infección, la replicación del genoma, el ensamblaje y la salida. El proceso de infección comienza cuando la proteína de la espícula viral (S) se une al receptor de la célula huésped, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), lo que facilita la liberación del genoma viral en la célula huésped ^2,3. La ARN polimerasa dependiente de ARN viral (RdRp) cataliza entonces la replicación del ARN genómico. Este ARN, en complejo con la proteína nucleocápside (N), forma una estructura estable que es reconocida por la proteína de membrana (M). La proteína M desempeña un papel central en el ensamblaje viral mediante el reclutamiento del complejo ARN-N, S, y la proteína de envoltura (E)^4,5. Después del ensamblaje, el virión completa su salida a través de una vía de tráfico no canónica mediada por lisosomas⁶.

En respuesta a la pandemia, se han movilizado importantes recursos mundiales para desarrollar vacunas, anticuerpos neutralizantes y medicamentos antivirales. La evaluación de estas intervenciones ha sido esencial para avanzar en la investigación sobre el SARS-CoV-2⁷. Sin embargo, el estudio del virus vivo presenta importantes desafíos logísticos, ya que los experimentos con el virus deben realizarse en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3). La disponibilidad limitada de instalaciones BSL-3 ha limitado el ritmo de la investigación destinada a comprender y combatir el SARS-CoV-2.

Para hacer frente a estos desafíos, dos sistemas principales, la partícula similar a un virus (VLP) y la pseudotipificación lentiviral, se han adoptado ampliamente en la investigación del SARS-CoV-2, los cuales no requieren la contención de BSL-3⁸. El sistema VLP implica la co-transfección de células con genes que codifican proteínas estructurales virales, incluidas M, S, E y N, que juntas generan partículas similares a los virus. Estas partículas imitan las propiedades estructurales y funcionales del virus, lo que las convierte en una herramienta valiosa para estudiar procesos clave en el ciclo de vida del SARS-CoV-2, e incluso en un antígeno eficaz para el desarrollo de vacunas ^9,10,11.

Por el contrario, el sistema de pseudotipado lentiviral consiste en reemplazar la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en el lentivirus por la proteína S del SARS-CoV-2, lo que permite la producción de partículas lentivirales que pueden incorporar genes reporteros como la luciferasa o la GFP. Este sistema es particularmente útil para investigar anticuerpos neutralizantes que bloquean la interacción S-ACE2¹². Sin embargo, el pseudotipado lentiviral no refleja el ensamblaje o la salida viral del SARS-CoV-2 debido al uso de proteínas estructurales del VIH, que median la liberación de partículas en la membrana plasmática.

Para superar estas limitaciones, Syed et al. identificaron recientemente la señal de empaquetamiento del SARS-CoV-2 dentro de su genoma de ARN, lo que demuestra la especificidad de la proteína N hacia el reconocimiento del genoma viral¹³. Al fusionar esta señal de empaquetamiento con genes reporteros, es posible incorporar de manera eficiente estos genes en partículas similares al virus SARS-CoV-2 (SC2-VLP)¹³. Esta estrategia no solo replica los procesos de ensamblaje y salida del SARS-CoV-2, sino que también permite la medición sensible de los pasos de infección. En este estudio, presentamos la metodología experimental para el uso del sistema SC2-VLP y destacamos las consideraciones clave para llevar a cabo este enfoque.

Protocolo

1. Generación de SC2-VLPs

1. Siembra ~3.0 × 10⁶ células HEK-293T en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro con medio completo DMEM, suplementada con 10% v/v FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
   NOTA: Para garantizar una alta eficiencia de transfección y una producción óptima de SC2-VLP, las células HEK-293T deben mantenerse en números de paso bajos ~ 10.
2. Cultive la célula HEK-293T a 37 °C, 5% de CO₂ durante unas 24 h y compruebe la confluencia celular bajo el microscopio. Proceda si ~70% confluente.
3. Diluir 60 μL de PEI de 1 mg/mL de caldo a 200 μL con medio sin suero.
4. Agregue 6,7 μg de plásmido N, 10 μg de plásmido Luc-T20, 0,016 μg de plásmido S y 3,3 μg de plásmido M-IRES-E en 200 μL de medio libre de suero (ver Archivo Suplementario 1).
5. Agregue suavemente el PEI diluido del paso 1.3 en la solución que contiene plásmidos que codifican las proteínas de la estructura viral del paso 1.4 e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Esta es la solución de transfección.
6. Deje caer con cuidado la solución de transfección del paso 1.5 sobre las células HEK-293T y agite suavemente la placa de cultivo de tejidos para mezclarla completamente.
7. Intercambie el medio de cultivo celular 6 h después de la infección con el medio completo DMEM e incube las células HEK-293T transfectadas a 37 °C, 5% CO₂ durante 48 h.
8. Recoja el sobrenadante de las células HEK-293T infectadas, que contiene las SC2-VLP, y luego filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos celulares. Este es el medio SC2-VLP.
   NOTA: Intentamos producir SC2-VLP en las líneas celulares HeLa, Vero E6 y Caco2, pero no se obtuvo ningún título viral medible, lo que indica la especificidad del protocolo para las células HEK-293T.

2. Examen de la eficacia de SC2-VLP

NOTA: La línea celular HEK-293T que expresa de manera estable ACE2 y TMPRSS2 se estableció utilizando un enfoque de transducción lentiviral^14,15. La expresión proteica de ACE2 y TMPRSS2 se confirmó mediante análisis de Western blot, siguiendo un protocolo similar al descrito en el Paso 3 (análisis de composición SC2-VLP).

1. Siembre 4.0 × 10^{4 células} HEK-293T con expresión estable de ACE2 y TMPRSS2 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 μL de medio SC2-VLP desde el paso 1.8.
2. Incubar la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 h.
3. Retire el medio de la placa de 96 pocillos y lave una vez con 100 μL de tampón PBS a 37 °C, que contenga 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄ y 1,8 mM de KH₂PO₄.
4. Lisar las células HEK-293T ACE2/TMPRSS2 con 20 μL de tampón de lisis pasiva, meciendo suavemente la muestra durante 15 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente.
   NOTA: El tampón de lisis contiene 25 mM de tris-fosfato (pH 7,8), 2 mM de DTT, 2 mM de ácido 1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético, 1,25 mg/mL de lisozima, 2,5 mg/mL de BSA, 10% de glicerol y 1% de Triton X-100).
5. Haga girar la placa de 96 pocillos a 4.000 × g durante 15 minutos a 4 °C en una centrífuga de microplacas refrigerada y, a continuación, transfiera inmediatamente la placa a un baño de hielo.
6. Tome 100 μL de tampón de ensayo de luciferasa reconstituido en una placa blanca opaca de 96 pocillos y agregue 20 μL de lisado del paso 2.5. Mézclalos brevemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
7. Mida la luminiscencia utilizando un lector de placas con los siguientes parámetros: Modo de detección: Luminiscencia; Rango de longitud de onda: espectro completo; Formato de placa: placa opaca estándar de 96 pocillos; Tiempo de integración: 200 ms.

3. Examen de la composición de SC2-VLP

1. Añada 1,36 mL de solución de PEG 8000, que contiene 50% de PEG 8000 y 2,2% de NaCl, a 10 mL de medio SC2-VLP del paso 1.8.
2. Mantenga la mezcla en un agitador orbital y mezcle lentamente la solución a 4 °C durante la noche.
3. Centrifugar la solución a 4 °C, 2.000 × g durante 30 min, y recoger el pellet SC2-VLP para el análisis de Western blot¹⁶.
   NOTA: Para el análisis de Western blot, toda la información relativa a los anticuerpos se proporciona en la Tabla de Materiales.

4. Análisis de localización subcelular de S y sus mutantes en células productoras de SC2-VLP

1. Siembre ~ 3.0 × 10^{6 células} HEK-293T de manera uniforme en la placa de cultivo con fondo de vidrio con 15 mm de diámetro, y luego permita que las células se adhieran y crezcan hasta ~ 70% de confluencia antes de la transfección.
2. Repita el procedimiento de transfección como se describe en los pasos 1.3 a 1.7 y modifique solo las cantidades de plásmido de la siguiente manera: plásmido N: 1,3 μg, plásmido Luc-T20: 2 μg, plásmido S: 0,0032 μg y plásmido M-IRES-E: 0,66 μg.
3. Lave suavemente la placa de cultivo dos veces con 1 mL de PBS helado y luego agregue 1 mL de solución de fijación de paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
4. Lave las células durante 2 x 5 min con 1 mL de PBS en RT, y luego permeabilice las células añadiendo 1 mL de Triton X-100 al 0,25% en RT durante 10 min.
5. Lave las células durante 2 x 5 min con 1 mL de PBS en RT, y luego agregue 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en RT durante 1 h para bloquear las interacciones de anticuerpos inespecíficos.
6. Agregue ~ 200 μL de solución de anticuerpo primario (suficiente para cubrir el fondo de vidrio) e incube a 4 °C durante la noche.
   NOTA: Las soluciones de anticuerpos primarios se preparan diluyendo en BSA al 5% disuelto en PBS a las siguientes proporciones de dilución: el anticuerpo anti-S de ratón a 1:200, el anticuerpo anti-Sec61β de conejo a 1:200, el anticuerpo anti-GM130 de conejo a 1:200 y el anticuerpo anti-ERGIC53 conejo a 1:200. La solución de BSA/PBS al 5% sirvió como diluyente y tampón de bloqueo para minimizar la unión inespecífica durante los procedimientos posteriores de tinción con inmunofluorescencia.
7. Retire la solución de anticuerpos primarios y luego lave las células durante 3 x 5 minutos con 1 mL de PBS en RT.
8. Agregue la solución de anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia en RT durante 1 h y luego lave las células durante 3 x 5 min con 1 mL de PBS en RT.
   NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en la oscuridad o bajo una exposición mínima a la luz para evitar el fotoblanqueo de los conjugados fluorescentes y preservar la integridad de la señal. Se emplean dos tipos de anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia, que se derivan del ratón o del conejo, para teñir la proteína S o las proteínas marcadoras de orgánulos celulares.
9. Teñir los núcleos con 2,5 μg/mL de solución de Hoechst en RT durante 5 min, y luego lavar las células durante 3 x 5 min con 1 mL de PBS en RT.
10. Observe la tinción de proteínas S u orgánulos y adquiera imágenes utilizando un microscopio confocal con los siguientes parámetros: Modo PMT configurado en VBF (sin promedio, escaneo secuencial en línea) con apertura autoconfocal. Para el canal 1 (FITC), utilice el láser de 488 nm al 25 % de potencia con una emisión de 500 a 548 nm, HV 525 V, ganancia 1x y compensación del 5 %. Para el canal 2 (Alexa Fluor 594), use el láser de 594 nm al 25% de potencia con emisión de 610 a 670 nm, HV 500 V, ganancia 1x y compensación del 5%. Para el canal 3 (DAPI), utilice el láser de 405 nm al 25% de potencia con emisión de 430 a 470 nm, HV 490 V, ganancia 1x y compensación del 5%.

Resultados

Las etapas de salida y ensamblaje del ciclo de vida del SARS-CoV-2 han sido menos estudiadas que las etapas de infección y replicación^17,18. Antes de que se desarrollara el método SC2-VLP, estos procesos solo podían investigarse utilizando SARS-CoV-2 vivo, limitando la investigación a los laboratorios BSL-3¹³. El flujo de trabajo SC2-VLP, que se muestra en la Figura 1, describe el protocolo experimental e ilustra los procesos involucrados en estos pasos del ciclo de vida del SARS-CoV-2. En este enfoque, los plásmidos que codifican las proteínas estructurales del SARS-CoV-2 (M, E, S y N) y la señal de empaquetamiento del ARN (T20) se transfectan conjuntamente en las células HEK-293T. Un reportero de luciferasa fusionado a la señal T20 permite la detección sensible de las SC2-VLP liberadas, que luego pueden infectar las células receptoras que expresan los receptores ACE2 y TMPRSS2 del SARS-CoV-2, como se muestra en la Figura 1.

Para optimizar la cantidad de plásmido que codifica las proteínas estructurales del SARS-CoV-2 y la señal de empaquetamiento, en particular el plásmido S, transfectamos células HEK-293T con concentraciones variables del plásmido S. Los resultados revelaron que una proporción de plásmido S a otro plásmido de 1:10 proporciona las condiciones óptimas para la producción de SC2-VLP (Figura 2). Este hallazgo se alinea con un informe anterior de Syed et al. y explica razonablemente por qué, a pesar de ser uno de los componentes más abundantes en los viriones del SARS-CoV-2, el nivel de expresión de la proteína S es relativamente más bajo en comparación con las proteínas M, N y E.

El sistema SC2-VLP sirve como un poderoso modelo para estudiar el proceso de ensamblaje del SARS-CoV-2, recapitulando fielmente tanto la formación de la envoltura viral como el empaquetamiento del genoma. La evidencia actual destaca el papel central de la proteína M en el ensamblaje, facilitando el reclutamiento de otras proteínas estructurales, incluidas N, S y E. La inmunotinción de estas proteínas revela su localización dentro de los orgánulos subcelulares, probablemente el complejo ERGIC o cis-Golgi, los sitios primarios de ensamblaje del SARS-CoV-2^19,20. Esto subraya el potencial del sistema SC2-VLP como una herramienta valiosa para diseccionar los mecanismos de ensamblaje viral. Para investigar aún más el papel del S en el ensamblaje, introdujimos la mutación H1271E, que interrumpe la clasificación del S mediada por COPI, perjudicando así la incorporación del S en los viriones^21,22. En las células receptoras, esta mutación redujo significativamente la actividad de la luciferasa, lo que confirma que el sistema SC2-VLP no solo recapitula fielmente la infección viral, sino que también sirve como una poderosa herramienta para investigar el ensamblaje del SARS-CoV-2, un proceso inaccesible para los sistemas convencionales de pseudotipado lentiviral (Figura 3). Además, empleamos un enfoque de escaneo mutacional integral, dirigido a residuos individuales (1.255-1.273) en la cola S C-terminal para identificar mutaciones adicionales que, como H1271E, podrían atenuar el ensamblaje de viriones y reducir los títulos virales. La figura 3 demuestra que la mutación E1262H disminuye significativamente la producción de SC2-VLP, mientras que la doble mutación H1271E/E1262H la suprime por completo. Estos resultados implican a E1262 en posibles interacciones con factores de huésped no identificados. Una mayor caracterización de las proteínas del huésped que se unen a esta región, en particular las que dependen de E1261, puede revelar nuevos mecanismos que rigen el ensamblaje del SARS-CoV-2. En conjunto, estos hallazgos establecen a las SC2-VLP como una plataforma versátil y fisiológicamente relevante para estudiar el ensamblaje viral en sistemas de cultivo celular.

Para evaluar la localización subcelular de la proteína S en células productoras de SC2-VLP, realizamos un análisis de inmunotinción tanto de la proteína S de tipo salvaje como de su mutante H1271E. Los resultados demuestran que la proteína S se colocaliza predominantemente con el marcador cis-Golgi GM130, mientras que muestra un solapamiento mínimo con el marcador ER Sec61β o el marcador ERGIC ERGIC-53. Estos hallazgos se alinean con observaciones previas de la localización subcelular S en la infección auténtica por SARS-CoV-2²³. Por el contrario, el mutante H1271E mostró un patrón de distribución difuso y no mostró colocalización con el marcador cis-Golgi GM130. Esto sugiere que la mutación interrumpe la localización adecuada en el sitio de ensamblaje viral, lo que podría explicar su capacidad deteriorada para facilitar el ensamblaje del virión del SARS-CoV-2 (Figura 4). Estos resultados establecen aún más a las SC2-VLP como una herramienta valiosa para estudiar las funciones biológicas de la S y otras proteínas estructurales virales.

Figura 1: Representación esquemática de la producción de SC2-VLP y sus aplicaciones. La señal de empaquetamiento del ARN genómico del SARS-CoV-2, T20, se resalta en cian, mientras que la proteína S se muestra en verde oscuro. Los plásmidos codifican proteínas estructurales del SARS-CoV-2, incluidas M, E, N y S, con M y E coexpresadas a partir de un solo vector. Se ilustran las etapas clave del ciclo de vida viral, incluido el ensamblaje (verde claro), la salida (azul claro) y la infección (naranja), como lo indican las flechas. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2; SC2-VLP = partícula similar al virus SARS-CoV-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sensibilidad del título SC2-VLP a la cantidad transfectada del plásmido que codifica S. (A) Tabla que muestra las cantidades de transfección de plásmidos que codifican proteínas estructurales del SARS-CoV-2 y la señal de empaquetamiento del ARNg. (B) El título de SC2-VLP varía en respuesta a la cantidad transfectada del plásmido que codifica S. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2; SC2-VLP = partícula similar al virus SARS-CoV-2; ARNg = ARN guía; RLU = unidades de luminiscencia relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Sistema SC2-VLP utilizado para investigar el ensamblaje de S en viriones. (A) Los mutantes S que afectan el tráfico de COPI conducen a una reducción en el título de SC2-VLP. (B) Análisis de Western blot de la abundancia de proteínas S y N del SARS-CoV-2 en SC2-VLP. (C) Eficiencia de empaquetamiento de S calculada a partir de (B), con abundancia de SC2-VLP normalizada a niveles de proteínas N. (D) Cuantificación de la abundancia de SC2-VLP a partir de (B). Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2; SC2-VLP = partícula similar al virus SARS-CoV-2; RLU = unidades de luminiscencia relativa; Ctr = control; WT = tipo salvaje; mut = mutante; NS = no significativo. La banda correspondiente a la proteína de la espícula (S) del SARS-CoV-2 de longitud completa se marca como S, mientras que el fragmento S2 (residuos 816-1.273) representa la porción C-terminal de la proteína S, y una banda inespecífica entre S y S2 se indica como NS²⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Sistema SC2-VLP utilizado para investigar la localización subcelular S. (A-I) Imagen representativa de inmunotinción de WT S en células HEK-293T productoras de SC2-VLP con co-tinción de marcadores de orgánulos celulares. (A-C) Marcador ER: (D-F) Sec61β, (G-I) Marcador ERGIC: ERGIC-53; el marcador del complejo cis-Golgi: GM130. (J-L) La colocalización del mutante S E1262H con el marcador cis-Golgi GM130. S se muestra en verde, los marcadores de orgánulos celulares se muestran en rojo y el núcleo celular se tiñe en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Secuencias de ADN de los plásmidos N, Luc-T20, S y M-IRES-E. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Un método sencillo y eficaz para modelar el ciclo de vida del SARS-CoV-2 en sistemas de cultivo celular, sin las limitaciones de los laboratorios BSL-3, representa un avance fundamental para la investigación contra el SARS-CoV-2. El método SC2-VLP satisface esta necesidad, ofreciendo una plataforma robusta y accesible. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el método SC2-VLP, describiendo los pasos experimentales críticos para la producción de SC2-VLP. Además, destacamos su versatilidad y aplicaciones potenciales para avanzar en nuestra comprensión de la biología del SARS-CoV-2 y facilitar el desarrollo de estrategias antivirales.

Los métodos tradicionales de VLP y pseudotipado lentiviral del SARS-CoV-2 son ampliamente utilizados en la investigación contra el SARS-CoV-2 ^8,25. En el método VLP tradicional, las proteínas estructurales M, N, E y S del SARS-CoV-2 se coexpresan para generar partículas virales²⁶, y su abundancia suele controlarse mediante análisis WB. Sin embargo, las proteínas estructurales virales también se incorporan a otras estructuras de membrana, como los exosomas, lo que complica el análisis WB de las partículas virales²⁷. Por el contrario, el método SC2-VLP incorpora un gen reportero fusionado a la señal T20, lo que permite un empaquetamiento eficiente del indicador en partículas virales. Esto permite una detección sensible y específica de la abundancia de partículas sin depender únicamente del análisis WB. Además, el método SC2-VLP imita más fielmente el ciclo de vida completo del SARS-CoV-2 vivo en comparación con el método VLP tradicional.

El método SC2-VLP supera al enfoque de pseudotipado lentiviral en varios aspectos críticos. El sistema de pseudotipado lentiviral se basa en el marco del virus VIH-1, en el que los viriones se ensamblan y brotan de la membrana plasmática. Por el contrario, los viriones del SARS-CoV-2 se ensamblan dentro del complejo ERGIC o cis-Golgi, lo que pone de manifiesto una diferencia fundamental en sus ciclos de vida. Esta discrepancia hace que el método de pseudotipificación lentiviral no sea adecuado para estudiar etapas clave del ciclo de vida del SARS-CoV-2, como la replicación, el ensamblaje y la salida, lo que limita su aplicabilidad a la investigación de la entrada e infección viral.

El método SC2-VLP es una herramienta sencilla y potente para estudiar el ciclo de vida del SARS-CoV-2. Al no involucrar el virus auténtico, este método puede ser adoptado por muchos laboratorios sin necesidad de acceder a las instalaciones de BSL-3. Sin embargo, sigue siendo crucial validar los hallazgos derivados del sistema SC2-VLP utilizando SARS-CoV-2 vivo para garantizar su precisión y relevancia biológica.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998S
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV3000
DMEM	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	A5670402
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) antibody	Invitrogen	A11001	dilution ratio: IF 1:1000
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 594) antibody	Abcam	ab150080	dilution ratio: IF 1:1000
HEK-293T cell line	National Infrastructure of Cell Line Resource (NICR)	NICR-293T-001	To ensure high transfection efficiency and optimal SC2-VLP production, HEK-293T cells should be maintained at low passage numbers (≤ P10).
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Working concentration: 2.5 μg/mL
Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1500
Luc-T20	Addgene	177941
Mouse monoclonal anti-GAPDH	Proteintech	60004-1-Ig	dilution ratio: WB 1:20,000
Mouse monoclonal anti-S RBD	Abclonal	A23771	dilution ratio: IF 1:200
OptiMEM	Thermofisher	31985070	serum-free medium for transfection
PEG3350	Sigma-Aldrich	P3635
PEG8000	Sigma-Aldrich	P2139
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Polyethyleneimine (PEI)	Thermofisher	43896.01
Promega passive lysis buffer	Promega	E1941
Rabbit polyclonal anti-ACE2	Proteintech	21115-1-AP	dilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-ERGIC53	Proteintech	13364-1-AP	dilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-GM130	Proteintech	11308-1-AP	dilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-S	Abcam	ab272504	dilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-Sec61β	Proteintech	15087-1-AP	dilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-TMPRSS2	Abcam	ab109131	dilution ratio: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E plasmid	Addgene	177938
SARS-CoV-2 N plasmid	Addgene	177959
SARS-CoV-2 Nucleoprotein Rabbit mAb	Abclonal	A21042	dilution ratio: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S plasmid	Addgene	177960
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	31460	dilution ratio: WB 1:5000
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	31430	dilution ratio: WB 1:5000
SpectraMax i3x plate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x