Produzione di un sistema di particelle simile al virus SARS-CoV-2 per studiare i cicli di vita virali in vitro

Riepilogo

Presentiamo un protocollo in vitro ottimizzato per la produzione di particelle simili al virus SARS-CoV-2 che imitano da vicino il virus autentico. Questo approccio consente lo studio dell'infezione virale, dell'assemblaggio e dei meccanismi di uscita senza i vincoli di richiedere un laboratorio di biosicurezza di livello 3.

Abstract

Il metodo della particella simile al virus (SC2-VLP) della sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) offre uno strumento potente e accessibile per studiare il ciclo di vita del SARS-CoV-2 senza la necessità di laboratori di biosicurezza di livello 3 (BSL-3). Questo sistema imita efficacemente le fasi critiche del ciclo di vita virale, tra cui l'assemblaggio, l'impacchettamento del genoma e l'uscita, utilizzando un reporter di luciferasi fuso con il segnale T20 per un rilevamento sensibile e preciso della produzione di particelle virali. Le SC2-VLP sono generate co-esprimendo proteine strutturali di SARS-CoV-2, tra cui membrana (M), nucleocapside (N), inviluppo (E) e spike (S), insieme al segnale di impacchettamento dell'RNA nelle cellule HEK-293T. A differenza dei tradizionali sistemi di particelle simili a virus, il metodo SC2-VLP garantisce una quantificazione accurata e una maggiore fedeltà al ciclo di vita virale naturale. Inoltre, rispetto ai metodi di pseudotipizzazione lentivirale, che si limitano allo studio dell'ingresso virale attraverso l'incorporazione della proteina S nelle particelle lentivirali basate sull'HIV, il sistema SC2-VLP fornisce una piattaforma più completa per esplorare più fasi della biologia del SARS-CoV-2. Mentre questo metodo aggira i rischi della gestione del virus vivo e amplia l'accessibilità. Il metodo SC2-VLP rappresenta un progresso significativo nella ricerca antivirale e nello sviluppo di strategie terapeutiche contro SARS-CoV-2.

Introduzione

La pandemia di COVID-19 è emersa come una delle crisi sanitarie globali più devastanti della storia moderna, con conseguenti milioni di morti in tutto il mondo¹. Il virus responsabile, SARS-CoV-2, segue un ciclo di vita complesso che include fasi chiave come l'infezione, la replicazione del genoma, l'assemblaggio e l'uscita. Il processo di infezione inizia quando la proteina spike virale (S) si lega al recettore della cellula ospite, l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), facilitando il rilascio del genoma virale nella cellula ospite ^2,3. L'RNA polimerasi virale RNA-dipendente (RdRp) catalizza quindi la replicazione dell'RNA genomico. Questo RNA, in complesso con la proteina nucleocapside (N), forma una struttura stabile che viene riconosciuta dalla proteina di membrana (M). La proteina M svolge un ruolo centrale nell'assemblaggio virale reclutando il complesso RNA-N, S, e la proteina dell'involucro (E)^4,5. Dopo l'assemblaggio, il virione completa la sua uscita attraverso una via di traffico 6 mediata dal lisosoma non^canonica.

In risposta alla pandemia, sono state mobilitate ingenti risorse globali per sviluppare vaccini, anticorpi neutralizzanti e farmaci antivirali. La valutazione di questi interventi è stata essenziale per far progredire la ricerca sul SARS-CoV-2⁷. Tuttavia, lo studio del virus vivo presenta notevoli sfide logistiche, poiché gli esperimenti che coinvolgono il virus devono essere condotti in laboratori di biosicurezza di livello 3 (BSL-3). La disponibilità limitata di strutture BSL-3 ha limitato il ritmo della ricerca volta a comprendere e combattere il SARS-CoV-2.

Per affrontare queste sfide, due sistemi principali - la particella simile al virus (VLP) e la pseudotipizzazione lentivirale - sono stati ampiamente adottati nella ricerca sul SARS-CoV-2, entrambi i quali non richiedono il contenimento di BSL-3⁸. Il sistema VLP prevede la co-trasfezione di cellule con geni che codificano per proteine strutturali virali, tra cui M, S, E e N, che insieme generano particelle simili a virus. Queste particelle imitano le proprietà strutturali e funzionali del virus, rendendole uno strumento prezioso per studiare i processi chiave nel ciclo di vita del SARS-CoV-2 e persino un antigene efficace per lo sviluppo di vaccini ^9,10,11.

Al contrario, il sistema di pseudotipizzazione lentivirale prevede la sostituzione della proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV) nel lentivirus con la proteina SARS-CoV-2 S, consentendo la produzione di particelle lentivirali che possono incorporare geni reporter come la luciferasi o la GFP. Questo sistema è particolarmente utile per studiare gli anticorpi neutralizzanti che bloccano l'interazione S-ACE2¹². Tuttavia, la pseudotipizzazione lentivirale non rispecchia l'assemblaggio o l'uscita virale di SARS-CoV-2 a causa dell'uso di proteine strutturali dell'HIV, che mediano il rilascio di particelle sulla membrana plasmatica.

Per superare queste limitazioni, Syed et al. hanno recentemente identificato il segnale di impacchettamento di SARS-CoV-2 all'interno del suo genoma di RNA, che dimostra la specificità della proteina N verso il riconoscimento del genoma virale¹³. Fondendo questo segnale di imballaggio con i geni reporter, è possibile incorporare in modo efficiente questi geni in particelle simili al virus SARS-CoV-2 (SC2-VLPs)¹³. Questa strategia non solo replica i processi di assemblaggio e uscita del SARS-CoV-2, ma consente anche la misurazione sensibile delle fasi di infezione. In questo studio, introduciamo la metodologia sperimentale per l'utilizzo del sistema SC2-VLP ed evidenziamo le considerazioni chiave per condurre questo approccio.

Protocollo

1. Generazione di SC2-VLP

1. Seme ~3,0 × 10⁶ cellule HEK-293T in una piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro con terreno completo DMEM, integrato con il 10% v/v di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
   NOTA: Per garantire un'elevata efficienza di trasfezione e una produzione ottimale di SC2-VLP, le celle HEK-293T devono essere mantenute a bassi numeri di passaggio ~10.
2. Coltivare la cellula HEK-293T a 37 °C, 5% CO₂ per circa 24 ore e controllare la confluenza cellulare al microscopio. Procedere se ~70% confluente.
3. Diluire 60 μL di PEI da 1 mg/mL a 200 μL con terreno privo di siero.
4. Aggiungere 6,7 μg di plasmide N, 10 μg di plasmide Luc-T20, 0,016 μg di plasmide S e 3,3 μg di plasmide M-IRES-E in 200 μL di terreno privo di siero (vedere File supplementare 1).
5. Aggiungere delicatamente il PEI diluito del passaggio 1.3 nella soluzione contenente plasmidi che codificano per le proteine della struttura virale del passaggio 1.4 e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Questa è la soluzione di trasfezione.
6. Far cadere con cautela la soluzione di trasfezione dalla fase 1.5 sulle cellule HEK-293T e agitare delicatamente la piastra di coltura tissutale per una miscelazione accurata.
7. Sostituire il terreno di coltura cellulare 6 ore dopo l'infezione con il terreno completo DMEM e incubare le cellule HEK-293T trasfettate a 37 °C, 5% CO₂ per 48 ore.
8. Raccogliere il surnatante delle cellule HEK-293T infette, che contiene le SC2-VLP, quindi filtrare il surnatante attraverso un filtro per siringa da 0,45 μm per rimuovere i detriti cellulari. Questo è il mezzo SC2-VLP.
   NOTA: Abbiamo tentato di produrre SC2-VLP in linee cellulari HeLa, Vero E6 e Caco2, ma non è stato ottenuto alcun titolo virale misurabile, indicando la specificità del protocollo per le cellule HEK-293T.

2. Esame dell'efficacia di SC2-VLP

NOTA: La linea cellulare HEK-293T che esprime stabilmente ACE2 e TMPRSS2 è stata stabilita utilizzando un approccio di trasduzione lentivirale^14,15. L'espressione proteica sia di ACE2 che di TMPRSS2 è stata confermata dall'analisi western blot, seguendo un protocollo simile a quello descritto nella Fase 3 (analisi della composizione SC2-VLP).

1. Seminare 4.0 × 10⁴ cellule HEK-293T con espressione stabile di ACE2 e TMPRSS2 in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 50 μL di terreno SC2-VLP dal passaggio 1.8.
2. Incubare la piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti a 37 °C con CO₂ al 5% per 24 ore.
3. Rimuovere il terreno dalla piastra a 96 pozzetti e lavare una volta con 100 μL di tampone PBS a 37 °C, contenente 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ e 1,8 mM KH₂PO₄.
4. Lisi le celle HEK-293T ACE2/TMPRSS2 con 20 μL di tampone di lisi passiva, facendo oscillare delicatamente il campione per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente.
   NOTA: Il tampone di lisi contiene 25 mM di Tris-fosfato (pH 7,8), 2 mM di DTT, 2 mM di acido 1,2-diaminocicloesano-N,N,N',N'-tetraacetico, 1,25 mg/mL di lisozima, 2,5 mg/mL di BSA, 10% di glicerolo e 1% di Triton X-100).
5. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 4.000 × g per 15 minuti a 4 °C in una centrifuga per micropiastre refrigerata, quindi trasferire immediatamente la piastra in un bagno di ghiaccio.
6. Prelevare 100 μl di tampone per il saggio della luciferasi ricostituita su una piastra bianca opaca a 96 pozzetti e aggiungere 20 μl di lisato dal passaggio 2.5. Mescolarli brevemente pipettandoli su e giù 2-3 volte.
7. Misurare la luminescenza utilizzando un lettore di piastre con i seguenti parametri: Modalità di rilevamento: Luminescenza; Gamma di lunghezze d'onda: spettro completo; Formato della piastra: piastra opaca standard a 96 pozzetti; Tempo di integrazione: 200 ms.

3. Esame della composizione SC2-VLP

1. Aggiungere 1,36 mL di soluzione PEG 8000, contenente il 50% di PEG 8000 e il 2,2% di NaCl, a 10 mL di terreno SC2-VLP dal passaggio 1.8.
2. Conservare la miscela su un agitatore orbitale e mescolare lentamente la soluzione a 4 °C per una notte.
3. Centrifugare la soluzione a 4 °C, 2.000 × g per 30 minuti e raccogliere il pellet SC2-VLP per l'analisi del western blotting¹⁶.
   NOTA: Per l'analisi del western blotting, tutte le informazioni relative agli anticorpi sono fornite nella Tabella dei materiali.

4. Analisi della localizzazione subcellulare di S e dei suoi mutanti in cellule produttrici di SC2-VLP

1. Seminare ~3,0 × 10⁶ cellule HEK-293T in modo uniforme nel piatto di coltura con fondo di vetro con diametro di 15 mm, quindi lasciare che le cellule aderiscano e crescano fino a ~70% di confluenza prima della trasfezione.
2. Ripetere la procedura di trasfezione come descritto nei passaggi da 1.3 a 1.7 e modificare solo le quantità di plasmidi come segue: plasmide N: 1,3 μg, plasmide Luc-T20: 2 μg, plasmide S: 0,0032 μg e plasmide M-IRES-E: 0,66 μg.
3. Lavare delicatamente la piastra di coltura due volte con 1 mL di PBS ghiacciato, quindi aggiungere 1 mL di soluzione di fissazione con paraformaldeide (PFA) al 4% a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
4. Lavare le cellule per 2 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT, quindi permeabilizzare le cellule aggiungendo 1 mL di Triton X-100 allo 0,25% a RT per 10 min.
5. Lavare le cellule per 2 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT, quindi aggiungere 1 mL di albumina sierica bovina (BSA) al 5% a RT per 1 ora per bloccare le interazioni anticorpali aspecifiche.
6. Aggiungere ~200 μL di soluzione di anticorpi primari (sufficiente a coprire il fondo del vetro) e incubare a 4 °C per una notte.
   NOTA: Le soluzioni anticorpali primarie sono preparate diluendo il 5% di BSA disciolto in PBS ai seguenti rapporti di diluizione: l'anticorpo anti-S di topo a 1:200, l'anticorpo anti-Sec61β di coniglio a 1:200, l'anticorpo anti-GM130 di coniglio a 1:200 e l'anticorpo anti-ERGIC53 di coniglio a 1:200. La soluzione BSA/PBS al 5% è servita sia come diluente che come tampone bloccante per ridurre al minimo il legame aspecifico durante le successive procedure di colorazione in immunofluorescenza.
7. Rimuovere la soluzione di anticorpi primari, quindi lavare le cellule per 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT.
8. Aggiungere una soluzione di anticorpi secondari coniugati a fluorescenza a RT per 1 ora, quindi lavare le cellule per 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT.
   NOTA Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti al buio o con un'esposizione minima alla luce per prevenire il fotosbiancamento dei coniugati fluorescenti e preservare l'integrità del segnale. Due tipi di anticorpi secondari coniugati a fluorescenza, derivati da topo o coniglio, sono impiegati per colorare la proteina S o le proteine marcatrici degli organelli cellulari.
9. Colorare i nuclei con 2,5 μg/mL di soluzione di Hoechst a RT per 5 minuti, quindi lavare le cellule per 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT.
10. Osservare la colorazione della proteina S o degli organelli e acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale con i seguenti parametri: Modalità PMT impostata su VBF (senza media, scansione sequenziale della linea) con apertura autoconfocale. Per il canale 1 (FITC), utilizzare il laser a 488 nm al 25% di potenza con emissione da 500 a 548 nm, HV 525 V, guadagno 1x e offset 5%. Per il canale 2 (Alexa Fluor 594), utilizzare il laser a 594 nm al 25% di potenza con emissione da 610 a 670 nm, HV 500 V, guadagno 1x e offset 5%. Per il canale 3 (DAPI), utilizzare il laser a 405 nm al 25% di potenza con emissione da 430 a 470 nm, HV 490 V, guadagno 1x e offset 5%.

Risultati

Le fasi di uscita e di assemblaggio del ciclo di vita del SARS-CoV-2 sono state meno studiate rispetto alle fasi di infezione e replicazione^17,18. Prima che il metodo SC2-VLP fosse sviluppato, questi processi potevano essere studiati solo utilizzando SARS-CoV-2 vivo, limitando la ricerca ai laboratori BSL-3¹³. Il flusso di lavoro SC2-VLP, mostrato nella Figura 1, delinea il protocollo sperimentale e illustra i processi coinvolti in queste fasi del ciclo di vita del SARS-CoV-2. In questo approccio, i plasmidi che codificano per le proteine strutturali di SARS-CoV-2 (M, E, S e N) e il segnale di impacchettamento dell'RNA (T20) sono co-trasfettati in cellule HEK-293T. Un reporter di luciferasi fuso con il segnale T20 consente il rilevamento sensibile delle SC2-VLP rilasciate, che possono quindi infettare le cellule riceventi che esprimono i recettori SARS-CoV-2 ACE2 e TMPRSS2, come illustrato nella Figura 1.

Per ottimizzare la quantità di plasmide che codifica per le proteine strutturali di SARS-CoV-2 e il segnale di impacchettamento, in particolare il plasmide S, abbiamo trasfettato le cellule HEK-293T con concentrazioni variabili del plasmide S. I risultati hanno rivelato che un rapporto plasmide S con altri plasmidi di 1:10 fornisce le condizioni ottimali per la produzione di SC2-VLP (Figura 2). Questa scoperta è in linea con un precedente rapporto di Syed et al. e spiega ragionevolmente perché, nonostante sia uno dei componenti più abbondanti nei virioni SARS-CoV-2, il livello di espressione della proteina S è relativamente più basso rispetto alle proteine M, N ed E.

Il sistema SC2-VLP funge da potente modello per lo studio del processo di assemblaggio del SARS-CoV-2, ricapitolando fedelmente sia la formazione dell'involucro virale che l'impacchettamento del genoma. Le prove attuali evidenziano il ruolo centrale della proteina M nell'assemblaggio, facilitando il reclutamento di altre proteine strutturali, tra cui N, S ed E. L'immunocolorazione di queste proteine rivela la loro localizzazione all'interno di organelli subcellulari, probabilmente il complesso ERGIC o cis-Golgi, i siti primari dell'assemblaggio di SARS-CoV-2^19,20. Ciò sottolinea il potenziale del sistema SC2-VLP come strumento prezioso per sezionare i meccanismi di assemblaggio virale. Per sondare ulteriormente il ruolo di S nell'assemblaggio, abbiamo introdotto la mutazione H1271E, che interrompe l'ordinamento di S mediato da COPI, compromettendo così l'incorporazione di S nei virioni^21,22. Nelle cellule riceventi, questa mutazione ha ridotto significativamente l'attività della luciferasi, confermando che il sistema SC2-VLP non solo ricapitola fedelmente l'infezione virale, ma funge anche da potente strumento per studiare l'assemblaggio di SARS-CoV-2, un processo inaccessibile ai sistemi convenzionali di pseudotipizzazione lentivirale (Figura 3). Abbiamo inoltre impiegato un approccio completo di scansione mutazionale, mirando a singoli residui (1.255-1.273) nella coda S C-terminale per identificare ulteriori mutazioni che, come H1271E, potrebbero attenuare l'assemblaggio del virione e ridurre i titoli virali. La Figura 3 dimostra che la mutazione E1262H riduce significativamente la produzione di SC2-VLP, mentre il doppio mutante H1271E/E1262H la abolisce completamente. Questi risultati implicano E1262 in potenziali interazioni con fattori dell'ospite non identificati. Un'ulteriore caratterizzazione delle proteine ospiti che si legano a questa regione, in particolare quelle dipendenti da E1261, potrebbe rivelare nuovi meccanismi che regolano l'assemblaggio di SARS-CoV-2. Nel complesso, questi risultati stabiliscono che le SC2-VLP sono una piattaforma versatile e fisiologicamente rilevante per lo studio dell'assemblaggio virale nei sistemi di coltura cellulare.

Per valutare la localizzazione subcellulare della proteina S nelle cellule produttrici di SC2-VLP, abbiamo eseguito l'analisi di immunocolorazione sia della proteina S wild-type che del suo mutante H1271E. I risultati dimostrano che la proteina S colocalizza prevalentemente con il marcatore cis-Golgi GM130, mentre mostra una minima sovrapposizione con il marcatore ER Sec61β o il marcatore ERGIC ERGIC-53. Questi risultati sono in linea con le precedenti osservazioni della localizzazione subcellulare S nell'autentica infezione da SARS-CoV-2²³. Al contrario, il mutante H1271E ha mostrato un pattern di distribuzione diffuso e non ha mostrato alcuna colocalizzazione con il marcatore cis-Golgi GM130. Ciò suggerisce che la mutazione interrompe la corretta localizzazione nel sito di assemblaggio virale, spiegando potenzialmente la sua ridotta capacità di facilitare l'assemblaggio del virione SARS-CoV-2 (Figura 4). Questi risultati stabiliscono ulteriormente che le SC2-VLP sono uno strumento prezioso per lo studio delle funzioni biologiche di S e di altre proteine strutturali virali.

Figura 1: Rappresentazione schematica della produzione di SC2-VLP e delle sue applicazioni. Il segnale di impacchettamento dell'RNA genomico SARS-CoV-2, T20, è evidenziato in ciano, mentre la proteina S è mostrata in verde scuro. I plasmidi codificano per le proteine strutturali di SARS-CoV-2, tra cui M, E, N e S, con M ed E co-espresse da un singolo vettore. Vengono illustrate le fasi chiave del ciclo di vita virale, tra cui l'assemblaggio (verde chiaro), l'uscita (azzurro) e l'infezione (arancione), come indicato dalle frecce. Abbreviazioni: SARS-CoV-2 = sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2; SC2-VLP = particella simile al virus SARS-CoV-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sensibilità del titolo SC2-VLP alla quantità trasfettata del plasmide codificante S. (A) Tabella che mostra le quantità di trasfezione dei plasmidi codificanti le proteine strutturali di SARS-CoV-2 e il segnale di impacchettamento del gRNA. (B) Il titolo SC2-VLP varia in risposta alla quantità trasfettata del plasmide codificante S. Abbreviazioni: SARS-CoV-2 = sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2; SC2-VLP = particella simile al virus SARS-CoV-2; gRNA= RNA guida; RLU = unità di luminescenza relativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Sistema SC2-VLP utilizzato per studiare l'assemblaggio di S nei virioni. (A) I mutanti S che influenzano il traffico di COPI portano ad una riduzione del titolo di SC2-VLP. (B) Analisi Western blot dell'abbondanza delle proteine S e N di SARS-CoV-2 nelle SC2-VLP. (C) Efficienza di confezionamento S calcolata da (B), con abbondanza di SC2-VLP normalizzata ai livelli di proteina N. (D) Quantificazione dell'abbondanza di SC2-VLP da (B). Abbreviazioni: SARS-CoV-2 = sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2; SC2-VLP = particella simile al virus SARS-CoV-2; RLU = unità di luminescenza relativa; Ctr = controllo; WT = tipo selvatico; mut = mutante; NS = non significativo. La banda corrispondente alla proteina spike (S) di SARS-CoV-2 a lunghezza intera è etichettata come S, mentre il frammento S2 (residui 816-1.273) rappresenta la porzione C-terminale della proteina S, e una banda non specifica tra S e S2 è indicata come NS²⁴. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sistema SC2-VLP utilizzato per studiare la localizzazione subcellulare S. (A-I) Immagine immunocolorante rappresentativa di WT S in cellule HEK-293T produttrici di SC2-VLP con co-colorazione dei marcatori degli organelli cellulari. (A-C) Marcatore ER: (D-F) Sec61β, (G-I) marcatore ERGICO: ERGIC-53; il marcatore del complesso cis-Golgi: GM130. (J-L) La colocalizzazione del mutante S E1262H con il marcatore cis-Golgi GM130. S è mostrato in verde, i marcatori degli organelli cellulari sono visualizzati in rosso e il nucleo cellulare è colorato in blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Sequenze di DNA di plasmidi N, Luc-T20, plasmidi S e plasmidi M-IRES-E. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Un metodo semplice ed efficace per modellare il ciclo di vita del SARS-CoV-2 nei sistemi di coltura cellulare, senza i vincoli dei laboratori BSL-3, rappresenta un progresso fondamentale per la ricerca anti-SARS-CoV-2. Il metodo SC2-VLP soddisfa questa esigenza, offrendo una piattaforma robusta e accessibile. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato per il metodo SC2-VLP, delineando le fasi sperimentali critiche per la produzione di SC2-VLP. Inoltre, ne evidenziamo la versatilità e le potenziali applicazioni nel far progredire la nostra comprensione della biologia del SARS-CoV-2 e nel facilitare lo sviluppo di strategie antivirali.

I metodi tradizionali di pseudotipizzazione lentivirale e VLP di SARS-CoV-2 sono ampiamente utilizzati nella ricerca anti-SARS-CoV-2 ^8,25. Nel metodo VLP tradizionale, le proteine strutturali M, N, E e S di SARS-CoV-2 sono co-espresse per generare particelle virali²⁶, con la loro abbondanza tipicamente monitorata dall'analisi WB. Tuttavia, le proteine strutturali virali sono incorporate anche in altre strutture di membrana, come gli esosomi, complicando l'analisi WB delle particelle virali²⁷. Al contrario, il metodo SC2-VLP incorpora un gene reporter fuso con il segnale T20, consentendo un efficiente impacchettamento del reporter in particelle virali. Ciò consente un rilevamento sensibile e specifico dell'abbondanza di particelle senza fare affidamento esclusivamente sull'analisi WB. Inoltre, il metodo SC2-VLP imita più fedelmente l'intero ciclo di vita del SARS-CoV-2 vivo rispetto al metodo VLP tradizionale.

Il metodo SC2-VLP supera l'approccio di pseudotipizzazione lentivirale in diversi aspetti critici. Il sistema di pseudotipizzazione lentivirale si basa sulla struttura del virus HIV-1, in cui i virioni vengono assemblati e gemmati dalla membrana plasmatica. Al contrario, i virioni SARS-CoV-2 sono assemblati all'interno del complesso ERGIC o cis-Golgi, evidenziando una differenza fondamentale nei loro cicli vitali. Questa discrepanza rende il metodo di pseudotipizzazione lentivirale inadatto allo studio delle fasi chiave del ciclo di vita del SARS-CoV-2, come la replicazione, l'assemblaggio e l'uscita, limitandone l'applicabilità all'indagine dell'ingresso e dell'infezione virale.

Il metodo SC2-VLP è uno strumento semplice e potente per studiare il ciclo di vita del SARS-CoV-2. Non coinvolgendo il virus autentico, questo metodo può essere adottato da molti laboratori senza richiedere l'accesso alle strutture BSL-3. Tuttavia, rimane fondamentale convalidare i risultati derivati dal sistema SC2-VLP utilizzando SARS-CoV-2 vivo per garantirne l'accuratezza e la rilevanza biologica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998S
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV3000
DMEM	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	A5670402
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) antibody	Invitrogen	A11001	dilution ratio: IF 1:1000
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 594) antibody	Abcam	ab150080	dilution ratio: IF 1:1000
HEK-293T cell line	National Infrastructure of Cell Line Resource (NICR)	NICR-293T-001	To ensure high transfection efficiency and optimal SC2-VLP production, HEK-293T cells should be maintained at low passage numbers (≤ P10).
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Working concentration: 2.5 μg/mL
Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1500
Luc-T20	Addgene	177941
Mouse monoclonal anti-GAPDH	Proteintech	60004-1-Ig	dilution ratio: WB 1:20,000
Mouse monoclonal anti-S RBD	Abclonal	A23771	dilution ratio: IF 1:200
OptiMEM	Thermofisher	31985070	serum-free medium for transfection
PEG3350	Sigma-Aldrich	P3635
PEG8000	Sigma-Aldrich	P2139
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Polyethyleneimine (PEI)	Thermofisher	43896.01
Promega passive lysis buffer	Promega	E1941
Rabbit polyclonal anti-ACE2	Proteintech	21115-1-AP	dilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-ERGIC53	Proteintech	13364-1-AP	dilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-GM130	Proteintech	11308-1-AP	dilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-S	Abcam	ab272504	dilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-Sec61β	Proteintech	15087-1-AP	dilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-TMPRSS2	Abcam	ab109131	dilution ratio: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E plasmid	Addgene	177938
SARS-CoV-2 N plasmid	Addgene	177959
SARS-CoV-2 Nucleoprotein Rabbit mAb	Abclonal	A21042	dilution ratio: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S plasmid	Addgene	177960
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	31460	dilution ratio: WB 1:5000
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	31430	dilution ratio: WB 1:5000
SpectraMax i3x plate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x