Pruebas para alimentos modificados genéticamente

1. extracción de ADN de muestras de alimentos

1. Añadir 500 μl de la matriz de mezcla PCR comprado a cada uno de los 2 tubos de tapón de rosca con una pipeta de transferencia o micropipeta de volumen ajustable de 200-1.000 μl. Pipetee hacia arriba y hacia abajo con la pipeta entre cada alícuota para mezclar uniformemente la matriz de la polimerización en cadena.
2. Etiquetar un tubo de tapón de rosca "sin transgénicos" y otra "prueba".
3. Pesar 0,5 g de alimentos no-GMO certificados y poner en el mortero.
4. Añadir 2,5 mL de agua destilada y moler con mortero por 2 min formar una mezcla.
5. Añadir otros 2,5 mL de agua destilada y continuar la molienda con mortero hasta que la mezcla se convierte en lo suficientemente suave para pipeta.
6. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de suelo al tubo de tapón de rosca conteniendo 500 μl de premezcla de PCR con la etiqueta "no-OGM" usando la marca de 50-μL en una pipeta graduada. Tapar el tubo.
7. Repita los pasos 1.3 – 1.6 para preparar la muestra de alimento.
8. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de alimentos de prueba de suelo al tubo de tapón de rosca etiquetado como "prueba". Tapar el tubo.
9. Vortex no-GMO alimentos y prueba PCR tubos para tubos de 1 min y coloque en baño de agua de 95 ° C durante 5 minutos. Si no se dispone de ningún vórtice, flick el tubo varias veces para mezclar antes de colocar en baño de agua.
10. Colocar tubos en una centrífuga durante 5 minutos. Debe formar una pelotilla sólida en la parte inferior del tubo. Si el pellet no está formado después de 5 min, centrifugar nuevamente por intervalos de 2 min hasta que se forme de la pelotilla.
11. Tubos pueden ser utilizados inmediatamente para PCR o almacenados en el refrigerador hasta por 1 semana.

2. Ajuste de reacciones de PCR

1. Número de tubos de PCR 1 – 6 y les inicial. El número debe corresponder a los siguientes contenidos del tubo aparece en la tabla 1.
2. Coloque cada tubo PCR marcado en un porta de microtubo con las tapas abiertas.
3. Usando una punta nueva para cada adición, agregar 20 μl de la cartilla que se indica en la tabla 1 para cada tubo PCR. Tubos con tapón.
4. Usando una punta nueva para cada tubo, agregar 20 μl de la muestra de ADN indicada en la tabla 1 para cada tubo de PCR, asegurándose de que la pipeta solo partir del sobrenadante y evitando el sedimento sólido en la parte inferior de los tubos.
5. Después de cada muestra de ADN se pipetea en el tubo correspondiente de polimerización en cadena, utilice la pipeta para mezclar ADN y cartilla pipeteando suavemente de arriba abajo; volver a tapar los tubos.
6. Colocar tubos PCR en termociclador y programa al cycler para:
   Desnaturalizar inicial: 1 ciclo a 94 ° C por 2 min.
   Amplificación: 40 ciclos a 94 ° C por 1 min (desnaturalizar), 59 ° C por 1 min (recocido) y 72 ° C por 2 min (extensión).
   Extensión final: 1 ciclo a 72 ° C durante 10 minutos.
   Hold: 4 ° C indefinidamente.

3 Preparación del Gel de agarosa al 3%

1. Con laboratorio o cinta adhesiva, cinta firmemente de los extremos abiertos de la bandeja de gel. Asegúrese de cinta está sellada en los bordes de la bandeja para evitar que la agarosa fundida escaparse hacia fuera.
2. Pesar 3 g de agarosa en un erlenmeyer de 250 mL o más grande.
3. Añadir 100 mL de tampón de x TAE 1 (comprado o preparado de concentrado).
4. Usando una placa magnética con una barra de agitación, calentar el vaso de precipitados hasta que la agarosa se disuelva completamente en el búfer y la solución hierve y se vuelve claro. Alternativamente, puede utilizarse un horno de microondas por colocar la taza en el horno y calefacción para intervalos de 30 s, usando una varilla de agitación para mezclar cada 10 s, repitiendo hasta que la mezcla está hirviendo y vueltas claro.
5. Invertir un matraz Erlenmeyer de 50 mL dentro de la abertura del frasco de 250 mL para actuar como un reflujo, impidiendo la evaporación de solución de agarosa.
6. Deje que la solución de agarosa enfriar a 60 ° C y verter 30-50 mL en cada bandeja de gel con cinta.
7. Coloque un peine de gel en el primer par de muescas para crear pozos de gel.
8. Deje el gel se enfríe completamente antes de retirar la cinta y peine. Gel se solidifique y vuelta de claro a turbio cuando listo, aproximadamente 10-20 minutos.

4. electroforesis de los productos PCR

1. Un gel de agarosa 3% hecha de antemano sobre una bandeja de gel o utilice una bandeja de gel que se ha utilizado para lanzar un gel de agarosa 3% vertido.
2. Deslice la bandeja de gel en la cámara de electroforesis con los pozos más cercanos al extremo del cátodo (negro).
3. Vierta 1 buffer de x TAE en la cámara, lo suficiente para tener 2 mm de tampón sobre la parte superior de la bandeja de gel.
4. Obtener tubos PCR de Termociclador y lugar en soporte para microtubo.
5. Utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, añadir 10 μl de compra anaranjado G carga del tinte (LD) para cada muestra y mezclar bien.
6. Carga 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel en el orden indican (tabla 2).
7. Electroforesis del gel del funcionamiento durante 30 min a 100 V.
8. Retire la bandeja de gel de gel cámara y deslice para quitar de la bandeja. Coloque el gel en una bandeja de tinción.
9. Sumergir el gel en la mancha de gel ADN adquirida durante 5 min., agitando cuidadosamente la bandeja para ayudar a distribuir la tinción en el gel.
10. Transferir el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua corriente (40-55 ° C) para aproximadamente 10 s.
11. Desmanchar por 3 x el lavado en agua caliente del grifo durante 6 min con suave agitación para obtener mejores resultados. Si es necesario, continuar la extracción en agua caliente hasta que se alcanza el contraste deseado.

Tabla 1. Lista de los números de tubo adecuado, imprimaciones y muestras de ADN.

Tabla 2. El orden adecuado para cargar 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel.