Este trabajo fue apoyado por el NIH / NINDS subvenciones NS26380 y NS55976, la Fundación Christopher y Dana Reeve y el Fondo de Daniel Heumann para la Investigación de la Médula Espinal. La Drexel University College de Medicina de la columna vertebral Centro de Investigación de cable proporciona apoyo a las estructuras básicas utilizadas para completar este trabajo.

1) Preparación para una cirugía microscópica <ol><li> La estación de cirugía tiene que ser limpios y desinfectados con una solución diluida de lejía antes de la creación de instrumentos y materiales accesorios. Instrumentos en autoclave un día antes de la cirugía y se almacena en un recipiente estéril. A su vez en la lista Hot esterilizador de cuentas (Herramientas Artes Ciencia) que se utiliza para eliminar los agentes patógenos y contaminantes microbianos de instrumentos entre los procedimientos en los diferentes animales. </li><li> Conecte la barrera térmica utilizada para mantener la temperatura corporal durante el procedimiento quirúrgico. Establecidos hisopos de algodón y gasas utilizadas para controlar el sangrado. Prepare pequeños (&lt;2 mm 3) piezas de espuma de gel que se utiliza para micro-hemostasia y se sumergen en una solución salina estéril. </li><li> Rata a cabo en una cámara de inducción y anestesia con isoflurano (5% vaporizado en oxígeno, caudal 2,0 l / min). Eliminar los animales de la cámara a la mesa de preparación y afeitarse una amplia zona de la piel desde el campo de su cirugía. Limpie con alcohol a partir isopropílico al 70% en el centro del campo y se irradia hacia el exterior, seguido de lavado con la solución de Polyhydroxidine (Xenodine) de la misma manera. Repita esta secuencia de lavados 3 veces. </li><li> Animales en lugar de la barrera térmica, la nariz y la boca cubierta con un cono de inhalación, reducir isoflurano al 3% y el caudal a 0,2 l / min. Administrar la dosis adecuada de antibióticos (ampicilina) por inyección subcutánea y analgésicos (Buprenorfina 0,05 mg / kg) por inyección intramuscular. </li><li> El cirujano le frote sus manos con una solución de Xenodine y enjuague con agua. Una bata quirúrgica estéril se coloca en los cirujanos, las manos se secó con una toalla estéril y cubierto con guantes estériles. Este procedimiento se sigue para cada procedimiento quirúrgico se describe en este texto. </li><li> La tapa que cubre los instrumentos estériles serán removidos por un asistente y de los instrumentos será expuesto en una cubierta estéril por el cirujano. </li></ol> 2) la sección transversal del PN para promover la degeneración <ol><li> Con el animal tumbado sobre un lado hacer una incisión en línea recta desde la cabeza del fémur hacia la rodilla, manteniendo en paralelo y de aproximadamente 3 mm en el fémur. Corte a través de los músculos bíceps femoral superficial a lo largo de la misma línea que la incisión de la piel, para exponer el músculo vasto lateral subyacente. </li><li> Usando tijeras hacer un pequeño corte en el vasto lateral cerca de la rodilla y extender esta hacia la cabeza del fémur. Una vez más con las tijeras con cuidado separar el músculo vasto lateral hasta que las ramas del nervio tibial y peroneo unidos en el nervio ciático se visualizan (que corre paralela al fémur). </li><li> Rastrear estas ramas hacia la cabeza del fémur hasta el tronco principal del nervio ciático se identifica. Justo debajo de la bifurcación del nervio ciático, el uso de fórceps fino para separar con cuidado el tejido conectivo (epineuro) que rodea a la rama del nervio tibial (esta es la rama más grande). </li><li> Una vez aislado escapar una ligadura de seda 6-0 alrededor del nervio tibial y apriete. Use las tijeras micro para seccionar el nervio rostral a la ligadura. Pasar la línea de sutura a través del músculo vasto lateral y atar con un nudo. Esto proporcionará una línea para su fácil localización del extremo cortado del nervio tibial cuando el nervio se va a cosechar los 7-10 días después. </li><li> La degeneración del nervio tibial antes de injerto proporciona un entorno más adecuado para el crecimiento axonal que hace una preparación nervio fresco. </li><li> Cierre el músculo vasto lateral con 6-0 suturas de seda. Cierre el músculo bíceps femoral con 6-0 suturas de seda. Cerca de la piel con pinzas de la herida Michel. Cierre el flujo de isoflurano, quitar el cono de la nariz y la inhalación de los animales a cabo en la celebración de la jaula en la barrera térmica y volver a la jaula una vez que esté alerta y activo. </li></ol> 3) Eliminación del segmento PN <ol><li> Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar el campo quirúrgico destinado como se describió anteriormente (1,3). Colocar el animal en la barrera térmica. </li><li> Quítese los ganchos de la herida y la incisión de piel anterior. Corte a través de la sutura del músculo superficial para exponer el vasto externo y corte a través de sutura en este músculo. </li><li> Trazar la línea de sutura para cortar final del nervio tibial y retirar la sutura de los nervios. Use unas pinzas finas para diseccionar epineuro de una longitud de 15 mm del nervio tibial y el corte a través de este extremo distal. Cortar un segmento de nervio y sumergirse en solución salina estéril Hanks equilibrada. </li><li> Si se trata de un experimento de injerto heterólogo sacrificar al animal por inyección intraperitoneal de Euthasol. Si se trata de un experimento injerto autólogo, el músculo de la pierna y la piel se cierra como se describe en 2.6) y los preparados para animales de lesión cervical de la médula espinal, como se describe a continuación. </li></ol> 4) lesiones cervicales hemisección y el trasplante Día 1 <ol><li> Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar la intenciónded campo quirúrgico como se describió anteriormente (1,3). Colocar el animal en la barrera térmica. Administrar antibióticos y analgésicos que el anterior (1,4). </li><li> Localice la muesca occipital y el destacado T2 proceso vertebral dorsal y hacer una incisión de la longitud total entre estos puntos de referencia externos. Corte a través de la línea media del músculo trapecio superficial y se separan los músculos subyacentes rhomboideus cervical. Mantenga los músculos, aparte de la inserción de un separador. </li><li> Los músculos profundos supraespinal se deben cortar de los procesos vertebral dorsal C4, C5 y C6. Pinzas para el uso realizar una laminectomía parcial de C5 para exponer todo el lado derecho y la parte medial de la parte izquierda de la médula espinal. El uso de la vena dorsal prominente como un punto de referencia para la línea media de la médula espinal. </li><li> Utilice una hoja de bisturí micro o una aguja de calibre 30 para perforar la duramadre y extender la incisión con el cable C5 espinal. Haga una pequeña incisión en la subaracnoidea subyacente y la piamadre. </li><li> Con una copa sacó micro-cánula de comenzar a aspirar la parte dorsal, a la derecha de la médula espinal, con una presión suave y pinzas de micro-para separar los tejidos y facilitar su eliminación. Continúe a través de porciones intermedias y ventral de la médula espinal para crear una cavidad de 2 mm de largo que se ha completado de dorsal a ventral y de la línea media de las meninges lateral. </li><li> Lugar empapada en solución salina de espuma de gel en la cavidad para lograr la hemostasia. </li><li> Cortar un segmento de nervio periférico de la solución de Hanks. Con cuidado, vaya el epineuro de los 3 mm proximal del segmento de nervio y aproximar este fin a la pared rostral de la cavidad de la lesión de hemisección. Asegurar el segmento con 10-0 sutura por el epineuro a la duramadre, se sutura la duramadre se cerró sobre el final de la prótesis implantada. </li><li> Sandwich del injerto entre dos piezas de la membrana de silastic (Biobrane) para la protección y el aislamiento fácil en un momento posterior. Lugar junto a la C6, C7 y T1 procesos vertebral. No aproximar al final del nervio distal de la médula espinal o el tejido muscular. </li><li> Los músculos cerca de las capas con sutura 4-0 y incisión en la piel cercana con los clips de la herida. </li><li> Lugar de los animales en la celebración de la jaula en la barrera térmica y volver a la jaula una vez que esté alerta y activo. </li></ol> El día 21 <ol start="11"><li> Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar el campo quirúrgico destinado como se describió anteriormente (1,3). Colocar el animal en la barrera térmica y administrar antibióticos y analgésicos que el anterior (1,4). Corte a través de puntos de sutura superficial para exponer la membrana de silastic que rodean el injerto de nervio. Con cuidado, sin la longitud de los nervios de la membrana de silastic con fórceps y tijeras primavera y reflexionar desde el campo quirúrgico. </li><li> Realizar una laminectomía parcial en el lado derecho del proceso de C7 vertebral. Pierce las meninges que el anterior (4.4) y por la aspiración preparar un 1 mm 3 cavidad dorsal lesión cuadrante en la médula espinal C7. Use empapada en solución salina de espuma de gel para lograr la hemostasia y luego reemplazarlo con espuma de gel empapada con chondroitinase ABC. El tratamiento de la lesión durante 15 minutos, proporcionando nuevas condroitinasa empapados de espuma de gel cada 5 minutos. </li><li> Cubrir la longitud externa del injerto de nervio con la membrana de silastic. Cerca de los músculos superficiales con suturas 4-0 y la incisión de la piel con pinzas de la herida. Lugar de los animales en la celebración de la jaula en la barrera térmica y volver a la jaula una vez que esté alerta y activo. </li></ol> Día 23 <ol start="14"><li> Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar el campo quirúrgico destinado como se describió anteriormente (1,3). Colocar el animal en la barrera térmica y administrar antibióticos y analgésicos que el anterior (1,4). Corte a través de puntos de sutura superficial para exponer la membrana de silastic que rodean el injerto de nervio. No molestar el injerto, sino más bien exponer el sitio del injerto C7 y el uso de una jeringa Hamilton de vidrio tirado a la cánula microinject 1μl de condroitinasa ABC en el lado derecho de la médula espinal de aproximadamente 1 mm distal a la aposición de injerto de la médula espinal. </li><li> Con cuidado, vaya el epineuro distal del 2 mm del segmento de nervio y aproximar este fin a la cavidad de la lesión C7. Asegurar el segmento con 10-0 sutura por el epineuro a la duramadre. </li><li> Cerca de los músculos superficiales con suturas 4-0 y la incisión de la piel con pinzas de la herida. Lugar de los animales en la celebración de la jaula en la barrera térmica y volver a la jaula una vez que esté alerta y activo. </li></ol> 5) registro electrofisiológico del potencial de acción en la médula espinal distal del injerto y <ol><li> Para determinar si la actividad eléctrica se transmite a través de los axones que se regeneran en el PNG, primero debemos denunciar y aislar el injerto. Especial cuidado se debe tomar durante este procedimiento para evitar daños físicos a los injertos y aquí es donde el uso de la membrana de silastic después de la colocación del injerto es importante. Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar el campo quirúrgico destinado como se describió anteriormente (1,3). º lugare animales de barrera térmica. </li><li> Después de abrir la piel y la separación de los músculos superficiales, las tiras de Silastic membrana se identifican y se diseca cuidadosamente libre del injerto. </li><li> Pinzas para quitar el uso del proceso dorsal vertebral inmediatamente rostral y caudal a los sitios de la aposición PNG-la médula espinal. Tenga cuidado de no perturbar el injerto demasiado durante este enfoque. Haga un corte en la duramadre en ambos niveles. </li><li> Aproximadamente 1 cm rostral a la C5 injerto espinal sitio aposición cable de insertar un solo cable (mezcla de platino e iridio) electrodo estimulador en la médula espinal ipsilateral a la lesión, a una profundidad de aproximadamente 1 mm. Levante con cuidado la parte central del injerto sobre un electrodo bipolar conectado. Proporcionar pulsos de estimulación única de 10μA con una duración 100μsec y determinar si hay potencial de acción viajando a través de los axones que se regeneran en el injerto. </li><li> Cambiar la posición de las conexiones y los cables de modo que el electrodo conectado se convierte en el electrodo de estimulación y el cable solo se inserta en la médula espinal distal a la aposición de PNG a la médula espinal y el intento de registro de potenciales de acción en la médula espinal. </li><li> Al final del experimento proporcionan un tren de estímulos para la duración de 1mA 100μsec a 50 Hz, para un total de 1 hora. La eutanasia a los animales 1 hora más tarde, perfusión con paraformaldehído al 4% y el tejido de la médula espinal proceso para la detección inmunohistoquímica de cFos en las neuronas que se activan por los axones regenerados en el PNG. </li></ol> 6) el etiquetado retrógrado de las neuronas que regeneran los axones en el PNG y el etiquetado anterógrada de los axones que se regeneran de nuevo en la médula espinal <ol><li> Para los animales que no han sido evaluados a través de medidas electrofisiológicas, es posible identificar el origen de los axones que crecen en el injerto y el curso de su terminación en la médula espinal. Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar el campo quirúrgico destinado como se describió anteriormente (1,3). Colocar el animal en la barrera térmica y exponer el PNG como se describe en 6.1. </li><li> Use las tijeras para cortar micro a través del injerto en su punto medio y tira de nuevo el epineuro de los extremos del corte del injerto. Reflejan los extremos cortados de distancia unos de otros y poner cada uno en una hoja de parafilm. </li><li> Coloque una compresa de gel de espuma empapada de True Blue en el extremo del corte proximal marcar las neuronas que han contribuido de un axón a la PNG. Coloque una compresa de gel de espuma empapada en biotina dextrano amina (BDA) en el extremo del corte distal de los axones que se extienden a la etiqueta de la parte posterior del injerto en la médula espinal. </li><li> La eutanasia a los animales 3-4d después, perfusión con paraformaldehído al 4% y el cerebro y la médula espinal proceso de cortes de tejido del cordón umbilical para microscopía de fluorescencia para True neuronas azul etiquetada o histoquímica BDA para los axones etiquetados. </li></ol> 7) lesión torácica transección completa y el trasplante Esto ofrece un enfoque alternativo para el modelo de hemisección lesión cervical anterior. Aquí uno más grave, la lesión bilateral se produce y los segmentos de los nervios periféricos se colocan en la cavidad de la lesión para abarcar y tocones rostral y caudal de la médula espinal lesionada. Día 1 <ol><li> Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar el campo quirúrgico destinado como se describió anteriormente (1,3). Colocar el animal en la barrera térmica. Administrar antibióticos y analgésicos que el anterior (1,4). </li><li> Identificar nivel vertebral T12 en el punto de inserción de la última costilla. Hacer incisión en la piel de este punto rostral de los procesos vertebral T11, T10 y T9. Corte a través de la fascia superficial a través de los músculos supra-adjunta a estos tres procesos. </li><li> Realizar una laminectomía completa de T10 proceso vertebral (que cubre T12 segmento de la médula espinal). Utilice una hoja de bisturí micro o una aguja de calibre 30 para perforar la dura mater y extender la incisión con el cable T12 espinal. Haga una pequeña incisión en la subaracnoidea subyacente y la piamadre. </li><li> Con una copa sacó micro-cánula de comenzar a aspirar la médula espinal T12 bilateral, con una presión suave y pinzas de micro-para separar los tejidos y facilitar su eliminación. Continúe a través de porciones intermedias y ventral de la médula espinal para crear una cavidad de 3 mm de largo que es dorsal a ventral y completa entre las meninges lateral. </li><li> Use empapada en solución salina de espuma de gel para lograr la hemostasia y luego reemplazarlo con espuma de gel empapada con chondroitinase ABC. El tratamiento de la lesión durante 15 minutos, proporcionando nuevas condroitinasa empapados de espuma de gel cada 5 minutos. </li><li> Cortar un segmento de nervio periférico de la solución de Hank s. Suavemente reflejan el epineuro del próximo 4 mm del segmento de nervio y corta un trozo para que encaje perfectamente entre los muñones rostral y caudal de un lado de la médula espinal. Coloque un segundo segmento junto con el primer segmento injertado, adosados ​​a la otra cara de la médula espinal. Sutura de la duramadre se cerró sobre los injertos implantados y la cubierta dura con un pequeñopedazo de membrana de silicona. </li><li> Los músculos cerca de las capas con sutura 4-0 y incisión en la piel cercana con los clips de la herida. </li><li> Lugar de los animales en la celebración de la jaula en la barrera térmica y volver a la jaula una vez que esté alerta y activo. </li></ol> Día 3 <ol start="9"><li> Anestesiar a los animales, afeitarse y limpiar el campo quirúrgico destinado como se describió anteriormente (1,3). Colocar el animal en la barrera térmica y administrar antibióticos y analgésicos que el anterior (1,4). Corte a través de puntos de sutura superficial para exponer la membrana que recubre silastic el sitio del injerto. No molestar el injerto, sino más bien exponer la médula espinal caudal a la corrupción y el uso de una jeringa Hamilton de vidrio tirado a la cánula microinject 1μl de condroitinasa ABC en cada lado de la médula espinal de aproximadamente 1 mm distal a la aposición de injerto de la médula espinal. </li><li> Cerca de los músculos superficiales con suturas 4-0 y la incisión de la piel con pinzas de la herida. Lugar de los animales en la celebración de la jaula en la barrera térmica y volver a la jaula una vez que esté alerta y activo. Realizar la estimulación y el registro electrofisiológico y el etiquetado de marcador como se describe en 5) y 6) anteriores. </li></ol> 8) Los resultados representativos Cuando este procedimiento se ha optimizado el segmento de nervio periférico cerca se integrará con el cordón espinal de acogida. Ascendente y descendente axones espinales entrará en el injerto, crecer en una línea paralela relativamente sencillo a la longitud del injerto y se extienden hasta el extremo distal del injerto a un ritmo de aproximadamente 1 mm por día. Al llegar al extremo distal, los axones se penetran en la médula espinal adyacente si condroitinasa se ha utilizado para eliminar los proteoglicanos inhibidor del tejido cicatricial alrededor. Conectividad funcional se determinó mediante la detección inmunohistoquímica y electrofisiología de una respuesta por las neuronas de la médula espinal a la estimulación de los axones en el injerto. Correlación anatómica para la recuperación funcional serán evaluadas por el seguimiento del número y la longitud de los axones que se han extendido más allá de la parte posterior injerto de nervio en la médula espinal.

<ol>
	<li>Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+the+potential+for+chronically+injured+neurons+to+regenerate+axons+into+intraspinal+peripheral+nerve+grafts.">Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts.</a> Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).</li><li>Ye, J. H., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+the+chronically+injured+spinal+cord+with+neurotrophic+factors+can+promote+axonal+regeneration+from+supraspinal+neurons.">Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons.</a> Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).</li><li>Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+an+autologous+peripheral+nerve+bridge+and+matrix+modification+by+chondroitinase+allows+robust+functional+regeneration+across+a+hemisection+lesion+of+the+adult+rat+spinal+cord.">Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).</li><li>Tom, V., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+microinjection+of+chondroitinase+ABC+following+injury+promotes+axonal+regeneration+out+of+a+peripheral+nerve+graft.">Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft.</a> Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).</li></ol>

<ol><li> Para la reproducibilidad del experimento es importante que el nivel de lesión de la médula espinal ser consistentes de un animal a otro. Por lo tanto, es fundamental que el proceso adecuado para laminectomía vertebral ser identificado. Debido a que estamos usando un modelo de lesión o hemisección sección transversal de este estudio no hay ambigüedad sobre el tamaño de la lesión o si determinadas extensiones espinal se lesiona o salvado. </li><li> Es necesario que los nervios periféricos se pre-degenerado antes del trasplante,...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>10-0 silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ArosSurgical</td>
<td>T5A10N10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>2693</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>483549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibody to cFos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F7799</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated dextran Amine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphin (.3mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>12496075701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chondroitinase ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Associates of Cape Cod</td>
<td>100332-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Euthasol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Webster Veterinary</td>
<td>07-805-9296</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-021-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>209-1966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Michel Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>12040-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurotrace Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>N7167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>True Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T5891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Webster Veterinary</td>
<td>92201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Bead Sterilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forced Exercise Wheel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lafayette Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TreadScan System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clever System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infinite Horizon Impact Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Precision Systems and Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Stimulation Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MagStim Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining peripheral nerve grafting and matrix modulation to repair the injured rat spinal cord

La lesión traumática de la médula espinal (SCI) causa la muerte de las neuronas, las disfunciones motoras y las fibras nerviosas sensoriales (axón) y la interrupción de las vías de comunicación con el cerebro. Uno de los objetivos de nuestra investigación es el de promover la regeneración axonal para restaurar la conectividad a través del sitio de la lesión. Para lograr esto, hemos desarrollado un nervio periférico (PN) injerto técnica en los segmentos de nervio ciático son colocados directamente entre los extremos dañados de la médula espinal o se utilizan para formar un puente a través de la lesión. Hay varias ventajas de este enfoque en comparación con el trasplante de otros tejidos neurales, la regeneración de los axones pueden ser dirigidos hacia un área específica, el número y el origen de la regeneración de los axones se determina fácilmente por técnicas de trazado, el injerto se puede utilizar para experimentos electrofisiológicos para medir recuperación funcional asociado con los axones en el injerto, y es posible utilizar un nervio autólogo para reducir la posibilidad de rechazo del injerto. En nuestro laboratorio hemos llevado a cabo tanto autólogos (donante y receptor son el mismo animal) y heteróloga (donante y receptor son diferentes animales) injertos con resultados comparables. Este enfoque ha sido utilizado con éxito en situaciones de lesiones agudas y crónicas. Axones regenerados que llegan al extremo distal del injerto PN a menudo no se extienden a la médula espinal, por lo que utilizar microinyecciones de condroitinasa para degradar moléculas inhibidoras asociados con el tejido de la cicatriz que rodea el área de la lesión medular. Al mismo tiempo, nos han revelado que el crecimiento exógeno y las moléculas tróficas estimula la regeneración axonal ya distancia en la médula espinal. Varios meses después del trasplante que realizamos una serie de pruebas anatómicas, de comportamiento y electrofisiológicos para evaluar la recuperación de la función en los animales de la médula espinal lesionada. Este enfoque experimental ha sido utilizado con éxito en varios modelos de lesión medular, en los diferentes niveles de lesiones y en diferentes especies (ratones, ratas y gatos). Es importante destacar que el enfoque de injerto de nervio periférico es eficaz para promover la regeneración de las neuronas aguda y crónica heridos.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord at JoVE.com

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

La lesión traumática de la médula espinal interrumpe la comunicación con el cerebro. Para restaurar la pérdida de conectividad que utilizan un injerto de nervio periférico para proporcionar un sustrato para la regeneración de las fibras en combinación con factores neurotróficos y las enzimas de la matriz de modulación, para eliminar las moléculas inhibidoras para promover el crecimiento de larga distancia.

La combinación de injerto de nervio periférico y la matriz de modulación para la Reparación de médula espinal de ratas lesionados

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of ...

combining-peripheral-nerve-grafting-matrix-modulation-to-repair

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K vistas.  Drexel University College of Medicine. La lesión traumática de la médula espinal interrumpe la comunicación con el cerebro. Para restaurar la pérdida de conectividad que utilizan un injerto de nervio periférico para proporcionar un sustrato para la regeneración de las fibras en combinación con factores neurotróficos y las enzimas de la matriz de modulación, para eliminar las moléculas inhibidoras para promover el crecimiento de larga distancia.

Video: Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Investigación

Biología

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Medición de esfínter uretral externo cistométrico en ratas despiertas con catéter implantado y electrodos para medidas repetidas

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Medida sensible de la mitofagia por reportero fluorescente flujo Cytometry usando el pH-dependiente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and subsequent bladder wall remodeling. To facilitate assessment of the cellular composition of the bladder wall in non-injured control and spinal cord injured mice, we developed an optimized dissociation protocol that supports high cell viability and enables the detection of discrete subpopulations by flow cytometry.
Spinal cord injury is created by complete transection of the thoracic spinal cord. At the time of tissue harvest, the animal is perfused with phosphate-buffered saline under deep anesthesia and bladders are harvested into Tyrode&#8217;s buffer. Tissues are minced prior to incubation in digestion buffer that has been optimized based on the collagen content of mouse bladder as determined by interrogation of publicly available gene expression databases. Following generation of a single cell suspension, material is analyzed by flow cytometry for assessment of cell viability, cell number and specific subpopulations. We demonstrate that the method yields cell populations with greater than 90% viability, and robust representation of cells of mesenchymal and epithelial origin. This method will enable accurate downstream analysis of discrete cell types in mouse bladder and potentially other organs.

The goal of this protocol is to apply an optimized tissue dissociation protocol to a mouse model of spinal cord injury and validate the approach for single cell analysis by flow cytometry.

Un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...