Este trabalho foi financiado pelo NIH / NINDS Grants NS26380 e NS55976, o Christopher e Dana Reeve Foundation e do Fundo de Daniel Heumann de Pesquisas da Medula Espinhal. A Drexel University College of Medicine Centro Spinal Cord Research fornece suporte para instalações do núcleo usada para concluir este trabalho.

1) Preparação para a cirurgia microscópica <ol><li> A estação cirúrgica precisa ser limpo e higienizado com uma solução de água sanitária diluída antes de definir instrumentos e materiais acessórios. Instrumentos serão autoclavados um dia antes da cirurgia e armazenado em um recipiente esterilizado. Ligue o Esterilizador Bead Quente (Ferramentas Ciência Fine) usado para remover patógenos e contaminantes microbianos de instrumentos entre os procedimentos em animais diferentes. </li><li> Plug na barreira térmica usada para manter a temperatura corporal durante o procedimento cirúrgico. Estabelecidos cotonetes e gaze utilizada para controlar o sangramento. Prepare pequeno (&lt;2mm 3) peças de Espuma Gel para ser usado para micro-hemostasia e mergulhe em uma solução salina estéril. </li><li> Rat lugar em uma câmara de indução e anestesiar com isoflurano (5% vaporizado em oxigênio, vazão 2,0 L / min). Remover animais da câmara para a mesa de preparação e raspar uma ampla área de pele a partir do campo destinado cirúrgico. Limpe com início de álcool isopropílico a 70% no centro do campo e irradiando para fora, seguido por lavagem com solução Polyhydroxidine (Xenodine) da mesma maneira. Repita esta sequência de lavagens 3 vezes. </li><li> Coloque o animal na barreira térmica, o nariz ea boca com tampa cone inalação, reduzir o isoflurano a 3% e vazão de 0,2 L / min. Entregar dose adequada de antibiótico (Ampicilina) por sub-cutânea de injeção e analgésico (buprenorfina 0,05 mg / kg) por via intramuscular. </li><li> O cirurgião vai esfregar as mãos com solução Xenodine e enxágüe com água. Um vestido cirúrgica estéril será montado para o cirurgião; mãos será secado com uma toalha estéril e coberto com luvas estéreis. Este procedimento é seguido para cada procedimento cirúrgico descrito neste texto. </li><li> A tampa que cobre o instrumentos esterilizados serão removidos por um assistente e instrumentos serão dispostas em uma cobertura estéril pelo cirurgião. </li></ol> 2) Transecção da PN para promover a degeneração <ol><li> Com o animal deitado de lado fazer uma incisão linha reta da cabeça do fêmur em direção ao joelho, mantendo paralelamente e cerca de três milímetros do fêmur. Cortar o superficial músculos bíceps femoral ao longo da mesma linha que a incisão na pele, para expor o músculo vasto lateral subjacente. </li><li> Usando uma tesoura faça um pequeno corte no vasto lateral, perto do joelho e estender isto para a cabeça do fêmur. Novamente com uma tesoura delicadamente separar o vasto lateral até a conjoined ramos do nervo tibial e peroneal do nervo ciático são visualizadas (que corre paralelo ao fêmur). </li><li> Traço desses ramos para a cabeça do fêmur até o tronco principal do nervo ciático é identificado. Logo abaixo da bifurcação do nervo ciático utilize uma pinça fina para separar cuidadosamente tecido conjuntivo (epineuro) em torno do ramo do nervo tibial (este é o maior ramo). </li><li> Uma vez isolados deslizamento uma ligadura de seda 6-0 ao redor do nervo tibial e aperte. Use uma tesoura para micro transecto nervo rostral à ligadura. Passe a linha de sutura através do músculo vasto lateral e amarrar com um nó. Isto irá fornecer uma linha para facilitar a localização do fim do corte do nervo tibial quando o nervo é para ser colhido 70-10 dias depois. </li><li> Degeneração do nervo tibial anterior à enxertia proporciona um ambiente mais adequado para o crescimento axonal do que uma preparação nervo fresco. </li><li> Fechar o músculo vasto lateral com seda 6-0. Fechar o músculo bíceps femoral com seda 6-0. Feche a pele com grampos de sutura Michel. Desligue o fluxo de isoflurano, remova o cone do nariz inalação e animal lugar na realização de gaiola na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo. </li></ol> 3) A remoção do segmento PN <ol><li> Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica. </li><li> Remova grampos de sutura e incisão da pele em separado anterior. Corte através de sutura do músculo superficial para expor vasto lateral e corte através de sutura em músculo. </li><li> Traçar a linha de sutura para cortar final do nervo tibial e remover a sutura de nervo. Use uma pinça fina para dissecar epineuro de um comprimento de 15 mm do nervo tibial e cortou essa extremidade distal. Remova o segmento do nervo e mergulhe em solução estéril Sal Hanks Balanced. </li><li> Se este é um experimento do enxerto heterólogo eutanásia do animal por meio de injeção intraperitoneal de Euthasol. Se este é um experimento enxerto autólogo, o músculo da perna ea pele é fechada, tal como descrito em 2.6) e os animais preparadas para lesão da medula espinhal cervical, conforme descrito abaixo. </li></ol> 4) lesão hemissecção Cervical e transplante 1 dia <ol><li> Anestesiar animais, fazer a barba e limpar a intençãocampo cirúrgico ded como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica. Administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). </li><li> Localize o entalhe occipital eo processo dorsal proeminente T2 vertebral e fazer uma incisão no comprimento total entre esses marcos externo. Atravessam a linha média do músculo trapézio superficial e separar os músculos subjacentes rombóide cervical. Manter os músculos além inserindo um espalhador. </li><li> Os músculos supra-espinhal profundas devem ser cortados a partir dos processos dorsal vertebral C4, C5 e C6. Rongeurs usando realizar uma laminectomia parcial de C5 para expor todo o lado direito e na porção medial do lado esquerdo da medula espinhal. Use a veia dorsal proeminente como um marco para a linha média da medula espinhal. </li><li> Use uma lâmina de bisturi ou micro-agulha de calibre 30 para perfurar a dura-máter e estender a incisão sobre a medula espinhal C5. Faça uma pequena incisão no subarachnoid subjacente e pia-máter. </li><li> Com um copo puxado micro-cânula começar a aspirar o lateral, dorsal direita da medula espinhal, usando uma pressão suave e micro-pinças para separar o tecido e facilitar a sua remoção. Continue com parcelas intermediárias e ventral da medula espinhal para criar uma cavidade 2 milímetros de comprimento que é completa de dorsal para ventral e da linha média para as meninges lateral. </li><li> Lugar salina encharcada de espuma gel na cavidade para realização da hemostasia. </li><li> Remover o segmento do nervo periférico da solução Hanks. Descascar delicadamente o epineuro do 3 milímetros proximal do segmento do nervo e appose este fim para a parede rostral da cavidade lesão hemissecção. Assegurar o segmento com 10-0 sutura através do epineuro para a dura-máter, em seguida, sutura da dura-máter fechada sobre a extremidade do enxerto implantado. </li><li> Sandwich do enxerto entre 2 pedaços de membrana silastic (Biobrane) para proteção e isolamento fácil em um ponto mais tarde. Lugar ao lado do C6, C7 e T1 processos vertebral. Não appose final nervo distal à medula espinhal ou tecido muscular. </li><li> Músculos próximos em camadas com fio de sutura 4-0 e incisão na pele estreita com grampos de sutura. </li><li> Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo. </li></ol> Dia 21 <ol start="11"><li> Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). Cortar suturas superficiais para expor membrana silastic ao redor do enxerto de nervo. Cuidadosamente livre do comprimento do nervo da membrana silastic usando uma pinça fina e tesoura primavera e refletem a partir do campo cirúrgico. </li><li> Executar uma laminectomia parcial no lado direito do processo C7 vertebral. Pierce as meninges como acima (4.4) e por aspiração preparar a 1 mm 3 cavidade lesão dorsal quadrante na medula espinhal C7. Use soro fisiológico embebido de espuma em gel para realização da hemostasia e depois substituir com espuma de gel embebido com condroitinase ABC. Tratar o local da lesão durante 15 minutos, proporcionando espuma gel fresco condroitinase encharcada de cada 5 minutos. </li><li> Cobrir o comprimento externo do enxerto de nervo com membrana Silastic. Fechar músculos superficiais com 4-0 ea incisão na pele com clipes ferida. Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo. </li></ol> Dia 23 <ol start="14"><li> Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). Cortar suturas superficiais para expor membrana silastic ao redor do enxerto de nervo. Não perturbe o enxerto, mas sim expor o local do enxerto C7 e usar uma seringa Hamilton com puxada de vidro cânula para microinject 1μl de condroitinase ABC para o lado direito da medula espinhal de cerca de 1 mm distal à aposição de enxerto a medula espinhal. </li><li> Descascar delicadamente o epineuro do 2 milímetros distal do segmento do nervo e appose este fim para a cavidade lesão C7. Assegurar o segmento com 10-0 sutura através do epineuro a dura-máter. </li><li> Fechar músculos superficiais com 4-0 ea incisão na pele com clipes ferida. Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo. </li></ol> 5) a gravação eletrofisiológicos do potencial de ação no enxerto e distal da medula espinhal <ol><li> Para determinar se a atividade elétrica é transmitida através de axônios que se regenerado no PNG primeiro devemos expor e isolar o enxerto. Cuidados especiais devem ser tomados durante este procedimento para evitar danos físicos do enxerto e é neste ponto que o uso de membrana Silastic após a colocação do enxerto é importante. Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). º lugaranimais e na barreira térmica. </li><li> Após a abertura da pele e separando músculos superficiais, tiras de membrana Silastic são identificados e cuidadosamente dissecado livre do enxerto. </li><li> Rongeurs usando remover o processo dorsal vertebral imediatamente rostral e caudal para o PNG-espinhal sites de aposição do cordão umbilical. Tome cuidado para não perturbar o enxerto muito durante esta abordagem. Faça uma fenda na dura-máter em ambos os níveis. </li><li> Aproximadamente um centímetro rostral ao C5 local aposição de enxerto da medula espinhal inserir um único fio (platina irídio-mix) eletrodo estimulante para a medula espinhal ipsilateral à lesão, a uma profundidade de aproximadamente 1mm. Levante cuidadosamente a porção central do enxerto em um eletrodo bipolar viciado. Fornecer pulsos único estimulante de 10μA com duração 100μsec e determinar se existem potenciais de ação viajando através dos axônios regenerados em que o enxerto. </li><li> Alterne as ligações ea posição dos fios de modo que o eletrodo viciado torna-se o eletrodo estimulando eo único fio é inserido na medula espinhal distal à aposição de PNG para a medula espinhal e tentar gravar potenciais de ação na medula espinhal. </li><li> No final do experimento fornecer um trem de 1mA estímulos de duração 100μsec a 50Hz, para um total de 1h. Euthanize animais 1hr depois, perfundir com paraformaldeído 4% e tecido da medula espinhal processo para a detecção imunocitoquímica de cFos em neurônios que foram ativados por axônios regenerados no PNG. </li></ol> 6) rotulagem retrógrada dos neurônios que regeneram axônios para o PNG e rotulagem anterógrada de axônios que regeneram de volta para a medula espinhal <ol><li> Para animais não testados por medidas eletrofisiológicas é possível identificar a fonte de axônios que crescem no enxerto e no curso de sua rescisão na medula espinhal. Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e expor o PNG, conforme descrito no item 6.1 acima. </li><li> Use uma tesoura para cortar micro através do enxerto em seu ponto médio e acabar com a epineuro das extremidades cortadas do enxerto. Refletir as pontas cortadas longe um do outro e colocar cada um em uma folha de parafilme. </li><li> Coloque um chumaço de espuma de gel embebido com True Blue na extremidade cortada proximal aos neurônios etiqueta que contribuiu com um axônio para o PNG. Coloque um chumaço de espuma de gel embebido em biotinilado dextran amina (BDA) na extremidade distal para cortar axônios rótulo que se estendem da parte traseira do enxerto para a medula espinhal. </li><li> Euthanize animais 3-4d depois, perfundir com paraformaldeído 4% e cérebro processar e seções do tecido da medula espinhal para microscopia fluorescente para True Blue neurônios rotuladas ou para BDA histoquímica para axônios rotulados. </li></ol> 7) lesão torácica transecção completa e transplante Isto oferece uma abordagem alternativa ao modelo de lesão cervical hemissecção acima. Aqui uma lesão mais grave, bilateral é produzida e segmentos de nervo periférico são colocados na cavidade lesão a tempo de tocos e rostral e caudal da medula lesionada. 1 dia <ol><li> Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica. Administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). </li><li> Identificar T12 nível vertebral no ponto de inserção da última costela. Fazer incisão na pele a partir deste ponto rostral sobre os processos vertebral T11, T10 e T9. Cortar fáscia superficial através dos músculos supra-espinhal associada a estes três processos. </li><li> Realizar laminectomia completa do processo T10 vertebral (sobrejacente T12 segmento da medula espinhal). Use uma lâmina de bisturi ou micro-agulha de calibre 30 para perfurar a dura-máter e estender a incisão sobre a medula espinhal T12. Faça uma pequena incisão no subarachnoid subjacente e pia-máter. </li><li> Com um copo puxado micro-cânula começar a aspirar a medula espinhal T12 bilateralmente, usando uma pressão suave e micro-pinças para separar o tecido e facilitar a sua remoção. Continue com parcelas intermediárias e ventral da medula espinhal para criar uma cavidade 3 milímetros de comprimento que é dorsal e ventral completa para entre as meninges lateral. </li><li> Use soro fisiológico embebido de espuma em gel para realização da hemostasia e depois substituir com espuma de gel embebido com condroitinase ABC. Tratar o local da lesão durante 15 minutos, proporcionando espuma gel fresco condroitinase encharcada de cada 5 minutos. </li><li> Remover o segmento do nervo periférico de solução Hank s. Suavemente refletem a epineuro do 4 milímetros proximal do segmento do nervo e corte um pedaço para encaixar confortavelmente entre os cotos rostral e caudal de um lado da medula espinhal. Coloque um segundo segmento ao lado do primeiro segmento enxertadas, apposed para o outro lado da medula espinhal. Sutura da dura fechado sobre os enxertos implantados e tampa dura com uma pequenapedaço de membrana silastic. </li><li> Músculos próximos em camadas com fio de sutura 4-0 e incisão na pele estreita com grampos de sutura. </li><li> Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo. </li></ol> Dia 3 <ol start="9"><li> Anestesiar animais, fazer a barba e limpar o campo destinado cirúrgica, como descrito acima (1.3). Colocar o animal em barreira térmica e administrar antibióticos e analgésicos como acima (1.4). Cortar suturas superficiais para expor silastic membrana que cobre o local do enxerto. Não perturbe o enxerto, mas sim expor a medula espinhal caudal ao enxerto e use uma seringa Hamilton com puxada de vidro cânula para microinject 1μl de condroitinase ABC em cada lado da medula espinhal de cerca de 1 mm distal à aposição de enxerto a medula espinhal. </li><li> Fechar músculos superficiais com 4-0 ea incisão na pele com clipes ferida. Coloque o animal em gaiola segurando na barreira térmica e retornar à gaiola, uma vez que está alerta e ativo. Realizar estimulação eletrofisiológica e registro e rotulagem, conforme descrito no tracer 5) e 6) acima. </li></ol> 8) Resultados Representante Quando este procedimento é otimizado o segmento de nervo periférico de perto integrar-se com o cabo de anfitrião espinhal. Subindo e descendo os axônios da coluna vertebral vai entrar no enxerto, crescer em uma linha paralela relativamente simples para o comprimento do enxerto e se estendem até a extremidade distal do enxerto a uma taxa de aproximadamente 1 mm por dia. Ao chegar à extremidade distal, os axônios penetram no fio adjacente espinhal se condroitinase tem sido usado para remover proteoglicanos inibitória do tecido cicatricial ao redor. Conectividade funcional será determinada pela detecção eletrofisiológicos e imunocitoquímicos de uma resposta por neurônios da medula espinhal para a estimulação dos axônios dentro do enxerto. Correlação anatômica para a recuperação funcional será avaliado, traçando o número eo comprimento dos axônios que se estenderam além do enxerto de nervo de volta para a medula espinhal.

<ol>
	<li>Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+the+potential+for+chronically+injured+neurons+to+regenerate+axons+into+intraspinal+peripheral+nerve+grafts.">Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts.</a> Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).</li><li>Ye, J. H., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+the+chronically+injured+spinal+cord+with+neurotrophic+factors+can+promote+axonal+regeneration+from+supraspinal+neurons.">Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons.</a> Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).</li><li>Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+an+autologous+peripheral+nerve+bridge+and+matrix+modification+by+chondroitinase+allows+robust+functional+regeneration+across+a+hemisection+lesion+of+the+adult+rat+spinal+cord.">Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).</li><li>Tom, V., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+microinjection+of+chondroitinase+ABC+following+injury+promotes+axonal+regeneration+out+of+a+peripheral+nerve+graft.">Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft.</a> Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).</li></ol>

<ol><li> Para a reprodutibilidade do experimento é importante que o nível de lesão da medula espinhal ser consistente de animal para animal. Por isso, é fundamental que o processo adequado vertebral para laminectomia ser identificado. Como estamos usando um modelo de lesão ou hemissecção transecção para este estudo não há ambigüidade sobre o tamanho da lesão, ou se específicos tratos espinhais foram feridos ou poupados. </li><li> É necessário que o nervo periférico ser pré-degenerado antes do transplante porque este inicia a d...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>10-0 silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ArosSurgical</td>
<td>T5A10N10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>2693</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>483549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibody to cFos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F7799</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated dextran Amine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphin (.3mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>12496075701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chondroitinase ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Associates of Cape Cod</td>
<td>100332-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Euthasol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Webster Veterinary</td>
<td>07-805-9296</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-021-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>209-1966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Michel Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>12040-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurotrace Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>N7167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>True Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T5891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Webster Veterinary</td>
<td>92201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Bead Sterilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forced Exercise Wheel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lafayette Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TreadScan System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clever System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infinite Horizon Impact Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Precision Systems and Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Stimulation Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MagStim Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining peripheral nerve grafting and matrix modulation to repair the injured rat spinal cord

Lesão traumática da medula espinhal (SCI) causa a morte de neurônios, a interrupção do motor e de fibras nervosas sensoriais (axônio) vias e interrupção na comunicação com o cérebro. Um dos objetivos de nossa pesquisa é o de promover a regeneração do axônio para restaurar a conectividade em todo o local da lesão. Para conseguir isso, desenvolvemos um nervo periférico (PN) de enxerto técnica onde os segmentos do nervo ciático ou são colocados diretamente entre as extremidades danificados da medula espinhal ou são usados ​​para formar uma ponte sobre a lesão. Existem várias vantagens para esta abordagem em relação ao transplante de outros tecidos neurais; axônios em regeneração pode ser direcionada para uma área-alvo específico, o número e fonte de regeneração de axônios é facilmente determinada por rastreamento técnicas, o enxerto pode ser utilizado para experimentos eletrofisiológicos para medir recuperação funcional associado com axônios no enxerto, e é possível usar um nervo autólogo para reduzir a possibilidade de rejeição do enxerto. Em nosso laboratório temos realizado tanto autólogos (doador e receptor são o mesmo animal) e heteróloga (doador e receptor são animais diferentes) enxertos com resultados comparáveis. Esta abordagem tem sido usada com sucesso em situações de lesões agudas e crônicas. Axônios regenerados que atingem a extremidade distal do enxerto PN muitas vezes não conseguem estender para trás para a medula espinhal, por isso usamos microinjeções de condroitinase para degradar moléculas inibidoras associados com o tecido cicatricial ao redor da área de SCI. Ao mesmo tempo, nós descobrimos que o fornecimento de crescimento exógeno e moléculas tróficas incentiva longa distância regrowth axonal na medula espinhal. Vários meses após o transplante realizamos uma variedade de testes anatômicas, comportamentais e eletrofisiológicos para avaliar a recuperação da função nos nossos animais com lesão medular. Esta abordagem experimental tem sido utilizado com sucesso em vários modelos de lesão medular, em diferentes níveis de lesões e em diferentes espécies (rato, camundongo e gato). Importante, a abordagem de enxerto de nervo periférico é eficaz na promoção da regeneração de neurônios aguda e crônica feridos.

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Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Lesão traumática da medula espinhal interrompe a comunicação com o cérebro. Para restaurar a conectividade perdida nós utilizamos um enxerto de nervo periférico para fornecer um substrato de fibras em regeneração em combinação com fatores neurotróficos e matriz de modulador enzimas para remover moléculas inibidoras para promover o crescimento de longa distância.

Combinando nervos periféricos Enxertia e Modulação Matrix reparar o cabo de Rat feridos Spinal

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of ...

combining-peripheral-nerve-grafting-matrix-modulation-to-repair

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K visualizações.  Drexel University College of Medicine. Lesão traumática da medula espinhal interrompe a comunicação com o cérebro. Para restaurar a conectividade perdida nós utilizamos um enxerto de nervo periférico para fornecer um substrato de fibras em regeneração em combinação com fatores neurotróficos e matriz de modulador enzimas para remover moléculas inibidoras para promover o crescimento de longa distância.

Vídeo: Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biologia

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Medições de esfíncter uretral Cystometric e externo em ratos acordados com cateter implantado e eletrodos permitindo medições repetidas

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and subsequent bladder wall remodeling. To facilitate assessment of the cellular composition of the bladder wall in non-injured control and spinal cord injured mice, we developed an optimized dissociation protocol that supports high cell viability and enables the detection of discrete subpopulations by flow cytometry.
Spinal cord injury is created by complete transection of the thoracic spinal cord. At the time of tissue harvest, the animal is perfused with phosphate-buffered saline under deep anesthesia and bladders are harvested into Tyrode&#8217;s buffer. Tissues are minced prior to incubation in digestion buffer that has been optimized based on the collagen content of mouse bladder as determined by interrogation of publicly available gene expression databases. Following generation of a single cell suspension, material is analyzed by flow cytometry for assessment of cell viability, cell number and specific subpopulations. We demonstrate that the method yields cell populations with greater than 90% viability, and robust representation of cells of mesenchymal and epithelial origin. This method will enable accurate downstream analysis of discrete cell types in mouse bladder and potentially other organs.

The goal of this protocol is to apply an optimized tissue dissociation protocol to a mouse model of spinal cord injury and validate the approach for single cell analysis by flow cytometry.

Uma única abordagem de dissociação celular para análise molecular da bexiga urinária no rato após lesão medular

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...