Diese Arbeit wurde vom NIH / NINDS Grants NS26380 und NS55976, der Christopher and Dana Reeve Foundation und der Daniel Heumann Fund for Spinal Cord Research gefördert. Die Drexel University College of Medicine Spinal Cord Research Center bietet Unterstützung für Core Facilities verwendet, um dieses Werk zu vollenden.

1) Vorbereitung für die mikroskopische Chirurgie <ol><li> Die chirurgischen Station muss sauber und hygienisch mit einer verdünnten Bleiche-Lösung vor von Instrumenten und Zubehör Materialien. Instruments wird autoklaviert 1 Tag vor der Operation werden und in einem sterilen Behälter. Schalten Sie den Hot Bead-Sterilisator (Fine Science Tools) eingesetzt, um Krankheitserreger und mikrobielle Verunreinigungen von Instrumenten zwischen Prozeduren auf verschiedene Tiere zu entfernen. </li><li> Stecken Sie in der Wärmedämmschicht verwendet werden, um die Körpertemperatur während der Operation zu erhalten. Set aus Wattestäbchen und Gazekompressen verwendet, um Blutungen zu kontrollieren. Bereiten Sie kleine (&lt;2mm 3) Stücke von Gel-Schaum, um für die Mikro-Hämostase und tauchen in eine sterile Kochsalzlösung verwendet werden. </li><li> Legen Sie Ratte in einer Induktion Kammer und betäuben mit Isofluran (5% in Sauerstoff verdampft, Durchfluss 2,0 L / min). Entfernen Tier aus der Kammer zur Vorbereitung Tisch und rasieren einen weiten Bereich von Pelzen durch die bestimmungsgemäße OP-Feld. Wischen Sie mit 70% Isopropylalkohol Anfang in der Mitte des Feldes und strahlenförmig, gefolgt von Waschen mit Polyhydroxidine Solution (Xenodine) in der gleichen Weise. Wiederholen Sie diesen Vorgang der wäscht 3 mal. </li><li> Legen Tier auf der Wärmedämmschicht, decken Nase und Mund mit Inhalation Kegel, reduzieren Isofluran bis 3% und Volumenstrom bis 0,2 L / min. Deliver geeignete Dosis Antibiotikum (Ampicillin) durch subkutane Injektion und analgetische (Buprenorphin 0,05 mg / kg) durch intramuskuläre Injektion. </li><li> Der Chirurg wird ihre Hände mit Xenodine Lösung schrubben und mit Wasser abspülen. Eine sterile OP-Kittel wird auf der Chirurg ausgestattet werden, die Hände werden mit einem sterilen Tuch getrocknet werden und mit sterilen Handschuhen. Dieses Verfahren ist für jeden chirurgischen Eingriff in diesem Text beschrieben wird. </li><li> Der Deckel für den sterilen Instrumenten wird von einem Assistenten entfernt werden und Instrumente werden auf einer sterilen Abdeckung verlegt werden durch den Operateur. </li></ol> 2) Durchtrennung der PN zu fördern Degeneration <ol><li> Mit dem Tier auf der Seite liegend zu einer geraden Linie Schnitt aus dem Kopf des Oberschenkelknochens zum Knie und hält parallel und ca. 3mm vom Oberschenkelknochen. Schnitt durch den oberflächlichen biceps femoris entlang der gleichen Linie wie der Hautschnitt, um die zugrunde liegenden Musculus vastus lateralis freizulegen. </li><li> Mit einer Schere einen kleinen Schnitt in der vastus lateralis in der Nähe der Knie-und erweitern diese bis zum Kopf des Oberschenkelknochens. Auch mit einer Schere vorsichtig trennen vastus lateralis bis verbunden tibialis und peronaeus Zweige der Ischiasnerv visualisiert werden (parallel zur Femur). </li><li> Trace diesen Branchen auf den Kopf des Oberschenkelknochens bis der Hauptstamm der Ischiasnerv ist identifiziert. Knapp unterhalb der Bifurkation der Ischiasnerv Verwendung feinen Pinzette vorsichtig getrennt Bindegewebe (Epineurium) rund um den Nervus tibialis Zweig (das ist der größere Ast). </li><li> Nach der Isolierung slip einem 6-0 Seidenfaden um den Nervus tibialis und anziehen. Verwenden Sie Mikro-Schere auf den Nerv rostral der Ligatur Transekt. Pass die Naht durch den Musculus vastus lateralis und binden Sie in einen Knoten. Dies wird eine Linie zur einfachen Lokalisierung von dem abgeschnittenen Ende des Nervus tibialis, wenn der Nerv auf 7-10 Tage später geerntet werden. </li><li> Degeneration des Nervus tibialis vor der Transplantation stellt eine Umgebung besser geeignet für das axonale Wachstum als es einen frischen Nerv Vorbereitung. </li><li> Schließen Sie den Musculus vastus lateralis mit 6-0 Seidenfäden. Schließen Sie die Bizeps femoris mit 6-0 Seidenfäden. Schließen Sie die Haut mit Michel Wundklammern. Schalten Sie den Strom von Isofluran, entfernen Sie das Einatmen Nasenkonus und Ort Tier in Haltekäfigs auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist. </li></ol> 3) Entfernung von PN-Segment <ol><li> Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere. </li><li> Entfernen Wundklammern und separate früheren Hautschnitt. Cut durch die Naht der oberflächlichen Muskulatur zu vastus lateralis freizulegen und schneiden durch die Naht in diesem Muskel. </li><li> Verfolgen Sie die Naht zu Ende N.tibialis schneiden und entfernen Naht von Nerven. Verwenden feinen Pinzette Epineurium aus einer 15 mm Länge des Nervus tibialis sezieren und Schnitt durch das distale Ende. Entfernen Sie die Nerven Segment und tauchen in sterile Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Wenn dies eine heterologe Transplantat Experiment euthanize das Tier durch intraperitoneale Injektion von Euthasol. Wenn dies ein autologes Transplantat Experiment, das Bein Muskeln und Haut geschlossen ist, wie in 2.6 beschrieben) und das Tier zur zervikalen Rückenmarksverletzung vorbereitet, wie unten beschrieben. </li></ol> 4) Cervical Hemisektion Verletzungen und Transplantation Tag 1 <ol><li> Anesthetize Tier, rasieren und reinigen Sie die intended OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere. Verwalten Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). </li><li> Suchen Sie die occipital erstklassig und die prominenten T2 dorsalen Wirbelkörper zu verarbeiten und einen Schnitt über die gesamte Länge zwischen diesen externen Landmarken. Schnitt durch die Mittellinie des oberflächlichen M. trapezius und trennen Sie die zugrunde liegenden zervikalen rhomboideus Muskeln. Keep Muskeln auseinander, indem Sie einen Spreizer. </li><li> Die tiefe supraspinal Muskeln sollten aus dem dorsalen Wirbelfortsätzen C4, C5 und C6 geschnitten werden. Mit Rongeure eine partielle Laminektomie von C5 bis die gesamte rechte Seite und den medialen Teil der linken Seite des Rückenmarks aussetzen. Verwenden Sie den prominenten Dorsalvene als Wahrzeichen für das Rückenmark Mittellinie. </li><li> Verwenden Sie ein Mikro-Skalpell oder einer 30-Gauge-Nadel zu durchbohren die Dura mater und verlängern die Inzision über dem C5 Rückenmark. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der zugrunde liegenden subarachnoidale und Pia mater. </li><li> Mit einem gezapftes Mikro-Kanüle beginnen, die dorsal, rechte Seite des Rückenmarks absaugen, mit sanftem Druck und Mikro-Pinzette, um das Gewebe zu trennen und zu erleichtern seine Entfernung. Weiter durch Zwischen-und ventralen Teile des Rückenmarks zu einer 2 mm langen Hohlraum, der abgeschlossen ist von dorsal nach ventral und von der Mittellinie an den seitlichen Meningen zu schaffen. </li><li> Legen Sie mit Kochsalzlösung getränkt Gel-Schaum in den Hohlraum der Hämostase zu erreichen. </li><li> Entfernen Sie das Segment der peripheren Nerven aus dem Hanks-Lösung. Vorsichtig schälen Epineurium vom proximalen 3mm des Nerven-Segment und appose diesem Zweck an den rostralen Wand des Hemisektion Läsion Hohlraum. Sichern Sie das Segment mit 10-0 Faden durch das Epineurium an die Dura mater, dann Naht die Dura geschlossen über dem implantierten Ende des Transplantats. </li><li> Sandwich das Transplantat zwischen 2 Stück Silastic Membran (Biobrane) zum Schutz und zur einfachen Isolierung zu einem späteren Zeitpunkt. Platz neben der C6, C7 und T1 Wirbelfortsätzen. Nicht appose distalen Nerven Ende des Rückenmarks oder Muskelgewebe. </li><li> Close Muskeln in Schichten mit 4-0 Nahtmaterial und schließen Hautschnitt mit Wundklammern. </li><li> Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist. </li></ol> Tag 21 <ol start="11"><li> Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und zu verwalten, Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). Schnitt durch oberflächliche Nähte an Silastic Membran umgibt den Nerv Transplantat aussetzen. Sorgfältig kostenlos die Länge der Nerv aus dem Silastic Membran mit feinen Pinzetten und Scheren Frühjahr und reflektieren aus dem OP-Feld. </li><li> Führen Sie eine partielle Laminektomie auf der rechten Seite des C7 Wirbelkörper Prozess. Pierce den Hirnhäuten, wie oben (4,4) und durch Absaugen vorzubereiten einem 1 mm 3 dorsalen Quadranten Läsion Hohlraum in der C7 Rückenmark. Verwenden Kochsalzlösung getränkt Gel-Schaum zur Blutstillung und ersetzen Sie dann mit Gel-Schaum mit Chondroitinase ABC getränkt. Behandeln Sie die betroffenen Stellen waren 15 Minuten lang und bietet frische Chondroitinase-getränkten Gel-Schaum alle 5 Minuten. </li><li> Decken Sie die Außenlänge des Nervs Transplantat mit Silastic Membran. Close oberflächlichen Muskeln mit 4-0 Nähten und der Hautschnitt mit Wundklammern. Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist. </li></ol> Tag 23 <ol start="14"><li> Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und zu verwalten, Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). Schnitt durch oberflächliche Nähte an Silastic Membran umgibt den Nerv Transplantat aussetzen. Bitte nicht stören das Transplantat, sondern setzen die C7 Transplantat Website und die Nutzung einer Hamilton-Spritze mit Kanüle gezogen Glas zu 1μl von Chondroitinase ABC in die rechte Seite des Rückenmarks ca. 1 mm distal der Anlagerung von Transplantat Rückenmark microinject. </li><li> Vorsichtig schälen Epineurium vom distalen 2mm des Nerven-Segment und appose diesem Zweck an den C7 Läsion Hohlraum. Sichern Sie das Segment mit 10-0 Faden durch das Epineurium an die Dura mater. </li><li> Close oberflächlichen Muskeln mit 4-0 Nähten und der Hautschnitt mit Wundklammern. Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist. </li></ol> 5) Elektrophysiologische Aufzeichnung der Aktionspotentiale in Transplantat und distalen Rückenmark <ol><li> Um festzustellen, ob die elektrische Aktivität durch Axone, die in das PNG regeneriert haben übertragen wird, müssen wir zuerst zu entlarven und zu isolieren des Transplantats. Besondere Vorsicht ist bei diesem Verfahren getroffen werden, um zu vermeiden körperlich schädigen das Transplantat und das ist, wo die Verwendung von Silastic Membran nach der Platzierung des Transplantats wichtig ist. Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen the Tier auf thermische Barriere. </li><li> Nach dem Öffnen der Haut und die Trennung oberflächlichen Muskeln sind Silastic Membranstreifen identifiziert und sorgfältig freipräpariert des Transplantats. </li><li> Mit Rongeure entfernen Sie die dorsalen Wirbelkörper Prozess sofort rostral und kaudal der PNG-Rückenmark Apposition Seiten. Achten Sie darauf, um das Transplantat zu viel stören während dieses Ansatzes. Machen Sie einen Schlitz in der Dura mater auf beiden Ebenen. </li><li> Ungefähr 1cm rostral des C5 graft-Rückenmark Apposition Website ein Single-Wire (Platin-Iridium-mix) Reizelektrode in das Rückenmark ipsilateral zur Läsion, bis zu einer Tiefe von ca. 1mm. Heben Sie den mittleren Teil des Transplantats auf einer bipolaren Elektrode angeschlossen. Geben Sie einzelne stimulierende Impulse von 10μA mit 100μsec Dauer und festzustellen, ob es Aktionspotentiale Reise durch Axone, die in das Transplantat regeneriert haben. </li><li> Schalten Sie die Anschlüsse und die Position der Drähte, so dass das hakenförmige Elektrode wird der stimulierenden Elektrode und der Single-Wire ist in das Rückenmark distal der Anlagerung von PNG auf das Rückenmark und Versuch Aktionspotentiale in das Rückenmark Datensatz eingefügt. </li><li> Am Ende des Experiments eine Bahn von 1mA Impulse für 100μsec Dauer bei 50 Hz, für insgesamt 1 Stunde. Euthanize Tieren 1 Stunde später, mit 4% Paraformaldehyd und Prozess Rückenmark für die immunzytochemische Detektion von cFos in Neuronen, die durch regenerierte Axone im PNG aktiviert wurden perfuse. </li></ol> 6) Retrograde Markierung von Neuronen, die regenerieren Axone in der PNG-und anterograde Kennzeichnung von Axonen, die zurück in das Rückenmark zu regenerieren <ol><li> Für Tiere, die nicht durch elektrophysiologische Messungen getestet ist es möglich, die Quelle der Axone, die in das Transplantat und der Verlauf ihrer Kündigung im Rückenmark wachsen zu identifizieren. Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und setzen die PNG als in 6.1 oben beschrieben. </li><li> Verwenden Sie Mikro-Schere durch das Transplantat in seiner mid-point Cut and Strip zurück Epineurium aus dem abgeschnittenen Enden des Transplantats. Spiegeln die abgeschnittenen Enden von einander entfernt und liegen jeweils auf einem separaten Blatt Parafilm. </li><li> Legen Sie eine Bäuschchen Gel-Schaum mit True Blue auf der proximalen Schnittfläche zu beschriften Neuronen, die ein Axon, die PNG beigetragen getränkt. Legen Sie eine Bäuschchen Gel-Schaum in biotinylierten Dextran Amin (BDA) am distalen Ende zu schneiden Label Axone, die aus dem Transplantat wieder in das Rückenmark zu erweitern getränkt. </li><li> Euthanize Tiere 3-4d später, mit 4% Paraformaldehyd und Prozess Gehirn und Rückenmark Gewebeschnitten für Fluoreszenz-Mikroskopie für True Blue markierten Neuronen oder BDA Histochemie für markierte Axone perfuse. </li></ol> 7) Thoracic komplette Durchtrennung Verletzungen und Transplantation Dies bietet einen alternativen Ansatz zur zervikalen Hemisektion Verletzungen Modell vor. Hier eine schwerere, bilaterale Verletzungen produziert wird und Segmente der peripheren Nerven sind in die Läsion Hohlraum Spannweite und rostral und caudal Stümpfe des verletzten Rückenmarks platziert. Tag 1 <ol><li> Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere. Verwalten Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). </li><li> Identifizieren T12 vertebralen Ebene Ansatzstelle des letzten Rippe. Machen Hautschnitt von diesem Punkt rostral über Wirbelfortsätzen T11, T10 und T9. Schnitt durch oberflächliche Faszie durch supraspinale Muskeln, die an diesen drei Prozessen. </li><li> Führen Sie vollständige Laminektomie von T10 Wirbelkörper-Prozess (darüberliegenden T12 Rückenmarks-Segment). Verwenden Sie ein Mikro-Skalpell oder einer 30-Gauge-Nadel zu durchbohren die Dura mater und verlängern die Inzision über dem T12 Rückenmarks. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der zugrunde liegenden subarachnoidale und Pia mater. </li><li> Mit einem gezapftes Mikro-Kanüle beginnen, die T12 Rückenmarks bilateral absaugen, mit sanftem Druck und Mikro-Pinzette, um das Gewebe zu trennen und zu erleichtern seine Entfernung. Weiter durch Zwischen-und ventralen Teile des Rückenmarks zu einer 3 mm langen Hohlraum, der komplette dorsal nach ventral und zwischen den seitlichen Meningen zu schaffen. </li><li> Verwenden Kochsalzlösung getränkt Gel-Schaum zur Blutstillung und ersetzen Sie dann mit Gel-Schaum mit Chondroitinase ABC getränkt. Behandeln Sie die betroffenen Stellen waren 15 Minuten lang und bietet frische Chondroitinase-getränkten Gel-Schaum alle 5 Minuten. </li><li> Entfernen Sie das Segment der peripheren Nerven aus dem Hank s Lösung. Gently spiegeln die Epineurium vom proximalen 4mm des Nerven-Segment und schneiden eine Länge oder zu eng zwischen den rostralen und kaudalen Stümpfe von einer Seite des Rückenmarks zu passen. Platzieren Sie ein zweites Segment neben den ersten veredelten Segment apposed auf die andere Seite des Rückenmarks. Suture die Dura geschlossen über dem implantierten Grafts und decken Dura mit einem kleinenStück Silastic Membran. </li><li> Close Muskeln in Schichten mit 4-0 Nahtmaterial und schließen Hautschnitt mit Wundklammern. </li><li> Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist. </li></ol> Tag 3 <ol start="9"><li> Anesthetize Tier, rasieren und saubere den vorgesehenen OP-Feld, wie oben beschrieben (1,3). Legen Sie das Tier auf thermische Barriere und zu verwalten, Antibiotika und Analgetika wie oben (1,4). Schnitt durch oberflächliche Nähte an Silastic Membran über dem Transplantat vor Ort verfügbar zu machen. Bitte nicht stören das Transplantat, sondern setzen das Rückenmark kaudal des Transplantats und die Verwendung einer Hamilton-Spritze mit Kanüle gezogen Glas zu 1μl von Chondroitinase ABC in jeder Seite des Rückenmarks ca. 1 mm distal der Anlagerung von Transplantat Rückenmark microinject. </li><li> Close oberflächlichen Muskeln mit 4-0 Nähten und der Hautschnitt mit Wundklammern. Tier in den Käfig halten auf thermische Barriere und zurück nach Hause zu Käfig, wenn es wach und aktiv ist. Führen elektrophysiologische Stimulation und Aufnahme-und Tracer-Kennzeichnung wie in 5 beschrieben) und 6) vor. </li></ol> 8) repräsentative Ergebnisse Wenn dieses Verfahren optimiert die peripheren Nerven-Segment wird eng mit dem Host-Rückenmarks integrieren. Aufsteigende und absteigende spinale Axone treten wird das Transplantat, wachsen in einer relativ geraden Linie parallel zur Länge des Transplantats und reichen bis zum distalen Ende des Transplantats mit einer Rate von ca. 1 mm pro Tag. Bei Erreichen des distalen Endes wird Axone dringen in die angrenzenden Rückenmark, wenn Chondroitinase verwendet wurde, um hemmende Proteoglykane aus den umliegenden Narbengewebe zu entfernen. Funktionelle Konnektivität wird durch elektrophysiologische und immunzytochemische Nachweis einer Reaktion Rückenmarksneuronen auf die Stimulation der Axone im Transplantat bestimmt werden. Anatomische Korrelation für die funktionelle Erholung wird durch die Verfolgung der Anzahl und Länge der Axone, die über die Nerventransplantat erweitert haben wieder in das Rückenmark zu beurteilen.

<ol>
	<li>Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+the+potential+for+chronically+injured+neurons+to+regenerate+axons+into+intraspinal+peripheral+nerve+grafts.">Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts.</a> Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).</li><li>Ye, J. H., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+the+chronically+injured+spinal+cord+with+neurotrophic+factors+can+promote+axonal+regeneration+from+supraspinal+neurons.">Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons.</a> Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).</li><li>Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+an+autologous+peripheral+nerve+bridge+and+matrix+modification+by+chondroitinase+allows+robust+functional+regeneration+across+a+hemisection+lesion+of+the+adult+rat+spinal+cord.">Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).</li><li>Tom, V., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+microinjection+of+chondroitinase+ABC+following+injury+promotes+axonal+regeneration+out+of+a+peripheral+nerve+graft.">Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft.</a> Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).</li></ol>

<ol><li> Für die Reproduzierbarkeit der Experimente ist es wichtig, dass das Niveau der Verletzung des Rückenmarks im Einklang von Tier zu Tier. Daher ist es wichtig, dass die entsprechenden Wirbelkörper Verfahren zur Laminektomie identifiziert werden. Da wir mit einer halbseitiger oder Durchtrennung Läsion Modell für diese Studie sind, gibt es keine Unklarheit über die Größe der Läsion oder ob bestimmte Rückenmarksbahnen wurden verletzt oder nicht verschont. </li><li> Es ist notwendig, dass die peripheren Nerven vor der Transplantati...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>10-0 silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ArosSurgical</td>
<td>T5A10N10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-0 silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>2693</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>483549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibody to cFos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F7799</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated dextran Amine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphin (.3mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McKesson</td>
<td>12496075701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chondroitinase ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Associates of Cape Cod</td>
<td>100332-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Euthasol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Webster Veterinary</td>
<td>07-805-9296</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-021-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>209-1966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Michel Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>12040-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurotrace Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>N7167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>True Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T5891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Webster Veterinary</td>
<td>92201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Bead Sterilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forced Exercise Wheel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lafayette Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TreadScan System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clever System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infinite Horizon Impact Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Precision Systems and Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Stimulation Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MagStim Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining peripheral nerve grafting and matrix modulation to repair the injured rat spinal cord

Traumatische Verletzungen des Rückenmarks (SCI) führt zum Tod von Nervenzellen, Störungen der motorischen und sensorischen Nervenfaser (Axon) Wege und Störung der Kommunikation mit dem Gehirn. Eines der Ziele unserer Forschung ist es, Axonregeneration zu fördern, um die Verbindung über die Läsion Website wiederherstellen. Um dies zu erreichen haben wir ein peripherer Nerv (PN) Pfropfen Technik, bei der Segmente der Ischiasnerv entweder platziert werden direkt zwischen dem beschädigten Enden des Rückenmarks oder werden verwendet, um eine Brücke über die Läsion zu bilden. Es gibt mehrere Vorteile dieses Ansatzes im Vergleich zur Transplantation anderer Nervengewebe; regenerierenden Axone kann auf ein bestimmtes Zielgebiet gerichtet sein, die Anzahl und die Quelle der Regeneration von Axonen leicht durch Tracing-Techniken bestimmt wird, kann das Transplantat für elektrophysiologische Experimente verwendet werden, um zu messen funktionelle Erholung mit Axone im Transplantat assoziiert, und es ist möglich, eine autologe Nervenzellen benutzen, um die Möglichkeit der Abstoßung des Transplantats zu reduzieren. In unserem Labor haben wir sowohl autologe (Spender und Empfänger die gleiche Tier) und heterologe (Spender und Empfänger sind verschiedene Tiere) Transplantate mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt. Dieser Ansatz wurde bereits erfolgreich bei akuten und chronischen Verletzungen Situationen verwendet. Regenerierte Axone, dass das distale Ende des PN Transplantat erreichen oft nicht reichen zurück in das Rückenmark, so verwenden wir Mikroinjektionen von Chondroitinase zu hemmenden Moleküle mit dem Narbengewebe rund um den Bereich des SCI verbundenen degradieren. Zur gleichen Zeit haben wir festgestellt, dass die Bereitstellung von exogenen Wachstums-und trophischen Molekülen fördert längere Strecke axonalen Nachwachsen in das Rückenmark. Mehrere Monate nach der Transplantation führen wir eine Vielzahl von anatomischen, Verhaltens-und elektrophysiologische Untersuchungen zur Wiederherstellung der Funktion in unserem Rückenmark verletzte Tiere zu bewerten. Dieser experimentelle Ansatz wurde bereits erfolgreich in mehreren Verletzungen des Rückenmarks Modelle verwendet, auf verschiedenen Ebenen von Verletzungen und in verschiedenen Spezies (Maus, Ratte und Katze). Wichtig ist, dass die peripheren Nerven Pfropfen Ansatz wirksam fördern die Regeneration von akuten und chronisch verletzten Neuronen.

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Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Traumatische Verletzungen des Rückenmarks stört die Kommunikation mit dem Gehirn. Zur Wiederherstellung verloren Konnektivität nutzen wir ein peripherer Nerv Transplantat zu einem Substrat zur Regeneration von Fasern in Kombination bieten mit neurotrophen Faktoren und Matrix-modulierenden Enzyme hemmenden Moleküle zu entfernen, um Langstrecken-Wachstum zu fördern.

Die Kombination Peripheral Nerve Grafting und Matrix Modulation der Verletzte Rat Spinal Cord Repair

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of ...

combining-peripheral-nerve-grafting-matrix-modulation-to-repair

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Aufrufe.  Drexel University College of Medicine. Traumatische Verletzungen des Rückenmarks stört die Kommunikation mit dem Gehirn. Zur Wiederherstellung verloren Konnektivität nutzen wir ein peripherer Nerv Transplantat zu einem Substrat zur Regeneration von Fasern in Kombination bieten mit neurotrophen Faktoren und Matrix-modulierenden Enzyme hemmenden Moleküle zu entfernen, um Langstrecken-Wachstum zu fördern.

Serie: Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Forschung

Biologie

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Zystometrischen und externen urethralen Sphincter Messungen in wach Ratten mit implantierten Katheter und Elektroden für wiederholte Messungen

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Bewertung der Reaktion der Gefäß-Tone mit isolierten mesenterischen Arterien mit einem Schwerpunkt auf der Modulation durch Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and subsequent bladder wall remodeling. To facilitate assessment of the cellular composition of the bladder wall in non-injured control and spinal cord injured mice, we developed an optimized dissociation protocol that supports high cell viability and enables the detection of discrete subpopulations by flow cytometry.
Spinal cord injury is created by complete transection of the thoracic spinal cord. At the time of tissue harvest, the animal is perfused with phosphate-buffered saline under deep anesthesia and bladders are harvested into Tyrode&#8217;s buffer. Tissues are minced prior to incubation in digestion buffer that has been optimized based on the collagen content of mouse bladder as determined by interrogation of publicly available gene expression databases. Following generation of a single cell suspension, material is analyzed by flow cytometry for assessment of cell viability, cell number and specific subpopulations. We demonstrate that the method yields cell populations with greater than 90% viability, and robust representation of cells of mesenchymal and epithelial origin. This method will enable accurate downstream analysis of discrete cell types in mouse bladder and potentially other organs.

The goal of this protocol is to apply an optimized tissue dissociation protocol to a mouse model of spinal cord injury and validate the approach for single cell analysis by flow cytometry.

Ein Einzelzell-Dissoziationsansatz für die molekulare Analyse der Harnblase in der Maus nach Einer Rückenmarksverletzung

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...