Parte 1: marcaje fluorescente de cDNA El tinte Cy3 utilizados en el experimento de microarrays es sensible a la foto-degradación. El procedimiento debe llevarse a cabo en una mínima cantidad de luz. El protocolo de etiquetado es una adaptación del sistema Array CGH BioPrime Etiquetado Genómica Manual 1. <ol><li> Los reactivos para la reacción de marcaje se almacenan a -20 ° C. Desde el CGH array BioPrime Genómica sistema de etiquetado descongelar 2,5 veces el tampón Primer azar, mezcla de dCTP 10 veces, y el agua libre de nucleasa. También descongelar el tinte Cy3-dCTP. Después de descongelar, en pocas palabras centrífuga todos los reactivos antes de usar. </li><li> Una reacción de marcaje por separado tendrá que ser completado para cada muestra de ADNc para ser analizados. En un 0,6 ml de pared gruesa del tubo se añaden 500 ng de cDNA, 40 ml Buffer 2,5 veces el Primer azar y el agua libre de nucleasa para alcanzar un volumen total de 86 microlitros. </li><li> Mezclar bien y centrifugar brevemente. Incubar la reacción durante 5 minutos a 100 ° C en un termociclador. </li><li> Inmediatamente la transferencia de reacción en una suspensión de baño de hielo durante 10 minutos. </li><li> Para cada tubo se añaden 10 l de mezcla dCTP 10 veces, 2 l 1 mM Cy3-dCTP y 2 l Exo ADN polimerasa de Klenow. La polimerasa de ADN Klenow Exo se debe dejar en el congelador hasta que sea necesario y siempre se debe mantener en hielo. </li><li> Mezcla de reacción bien y centrifugar brevemente. </li><li> Incubar la reacción a 37 ° C durante 16 horas en un termociclador. </li></ol> Parte 2: La precipitación de cDNA etiqueta <ol><li> Antes de continuar en el turno de protocolo en el sistema de hibridación NimbleGen y permitir que el sistema se equilibre a 42 ° C. </li><li> Para cada reacción, el lugar de una columna Microcon en un tubo de 1.5 ml. Añadir 300 l SSC 0,1 X a cada columna seguidos por el contenido de la reacción de marcaje (100 l). </li><li> Centrifugar el tubo que contiene la columna a 16.100 xg durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Deseche el flujo a través, que puede ser un poco de color rosa, y añadir otros 300 l SSC 0,1 X a la columna. </li><li> Repetir la centrifugación a 16.100 xg durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Deseche el flujo a través y agregar un adicional de 300 l SSC 0,1 X a la columna. </li><li> Centrifugar a 16.100 xg durante 12 minutos a 4 ° C. </li><li> Deseche el flujo a través. El flujo a través Debe quedar claro después de este último lavado y usted debería ser capaz de ver la rosa cDNA marcado en la columna. </li><li> Aplicar 100 l agua libre de nucleasa a la columna. Eliminar la columna del tubo de 1.5 ml y se invierte la columna en un tubo de 1.5 ml nuevo. </li><li> Centrifugar a 2300 xg durante 2 minutos a 4 ° C. El cDNA marcado debe ser rehidratado en el agua que se acumula en la parte inferior del tubo. </li><li> Use un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro de acuerdo a las instrucciones del fabricante para el cálculo de la concentración de ADN y evaluar la incorporación tinte mediante el cálculo de la base de tinte en la relación de nucleótidos a Cy3 relación es igual a la A 260 / A 550 multiplicado por 23,15. La base de relación de medio de contraste debe ser entre 50 y 80. </li><li> Si cDNA si la etiqueta lo suficiente, alícuota de 6 mg de ADNc marcado en un tubo de 1.5 ml nuevo. </li><li> Mezcle en el volumen de 0.1X de 3 M NaOAc, pH 5,2 y 1X volumen de isopropanol. Deje que la mezcla de incubación en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> A continuación centrifugar la muestra a 16.100 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Con cuidado, descartar el sobrenadante sin perturbar el precipitado de ADN, que debe ser de color rosado. </li><li> Realizar un lavado de etanol mediante la adición de 500 l EtOH 70% y mezclar por inversión suave. </li><li> Centrifugar la muestra a 16.100 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante, invierta el tubo, y permitir que el precipitado se seque durante 5 minutos. En este paso la bolita se puede almacenar a -20 º C si se desea o el protocolo se puede continuar con el paso de hibridación. </li></ol> Parte 3: La hibridación El procedimiento de hibridación es una adaptación de la Guía del usuario Roche NimbleGen matrices para dos análisis de expresión génica. <ol><li> Disolver el precipitado en 5 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Una vez que la pastilla se disuelve añadir componentes de la hibridación en la Tabla 1. Componentes de la hibridación son del Kit de hibridación Roche NimbleGen. Después de todos los componentes se añaden el volumen total ahora un total de 18 microlitros. Mezclar bien y brevemente girar el tubo para recoger el contenido en la parte inferior. </li><li> El siguiente paso es desnaturalizar el cDNA marcado por colocarlo en un bloque de calor a 95 ° C durante 5 minutos. </li><li> Transferir inmediatamente el tubo con el sistema de hibridación NimbleGen, mientras que las matrices se preparan en los siguientes pasos. </li><li> Microarrays siempre deben manipularse con cuidado y almacenarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Roche NimbleGen recomienda el almacenamiento de sus arrays de expresión en la oscuridad con desecante a temperatura ambiente. </li><li> Cargar la matriz en la herramienta de alineación de precisión Mixer (PMAT), siempre en los accesorios del procesado NimbleGen matriz. </li> &lt;li&gt; Carga de un mezclador de X1 en el PMAT y retire la cinta adhesiva con una pinza. Cierre el PMAT segura. Aplique presión a la mesa de mezclas a través del agujero en el PMAT y abrir lentamente para que la matriz y un mezclador de retirarse de la PMAT. </li><li> Firmemente ejercer presión con el rodillo en el exterior de la mesa de mezclas para asegurar el sello de la matriz es completa y para eliminar las burbujas. Coloque el complejo conjunto mezclador en el sistema de hibridación para calentar. </li><li> Usando una pipeta de desplazamiento, agregue lentamente 15 l de la muestra de la etiqueta en el puerto de llenado. Este es el agujero situado en el centro de la mesa de mezclas. Aplique una presión lenta y constante de la pipeta de modo que la muestra se extienda de manera uniforme a través de la mezcla sin burbujas de aire. Limpie cualquier exceso de muestra de los orificios y sellar los agujeros de puerto con cinta adhesiva. </li><li> Cierre el pestillo y empezar a mezclar de la solución de hibridación con el programa B en el sistema de hibridación NimbleGen. Permitir la hibridación de microarrays de 16-20 horas. </li></ol> Parte 4: hibridación de Post-Lava y Análisis de Microarrays El procedimiento de lavado y barrido es una adaptación de la Guía del usuario Roche NimbleGen matrices para análisis de expresión génica 2. <ol><li> Una vez que la hibridación está casi terminada preparar tampones de lavado como se indica en la Tabla 2. Pre-caliente IA tampón de lavado a 42 ° C en un baño de agua. </li><li> Encienda el escáner GenePix serie 4000B y permitir que el escáner se caliente durante unos 15 minutos antes de su uso. </li><li> Vierta la IA lavado pre-calentado de búfer en un plato. </li><li> Quitar el complejo conjunto mezclador del sistema de hibridación NimbleGen y caer en la plantilla (incluido en los accesorios del procesado NimbleGen matriz). Sumerja asamblea en pre-calentado IA tampón de lavado y retirar con cuidado mezcladora pelando de diapositivas. </li><li> Quitar matriz de plantilla y agite por 15 segundos en el tampón de lavado IA. </li><li> Rápidamente la transferencia de matriz en un estante de la diapositiva en el IB temperatura ambiente tampón de lavado. Agite la gradilla para portaobjetos enérgicamente durante 2 minutos. </li><li> La transferencia de la parrilla portaobjetos en el tampón de lavado II y agitar durante 1 minuto. </li><li> La transferencia de la parrilla portaobjetos en el tampón de lavado III y agite por 15 segundos. </li><li> La transferencia de la matriz en la diapositiva de secado y centrifugado giro de 2 minutos para eliminar toda la humedad. Proceder a la exploración. </li><li> Es recomendable analizar la matriz inmediatamente, ya que el tinte es sensible a la luz y la capa de ozono. </li><li> Cargar la matriz, código de barras hacia abajo, en el escáner de gama GenePix 4000B. </li><li> Abra el software GenePix Pro y proceder a la exploración de la matriz. La Roche NimbleGen matrices de expresión génica utilizar una estrategia de un solo color hibridación. Como resultado de una sola longitud de onda es necesaria para la exploración. Exploración Cy3 señal de fluorescencia utilizando el láser de 532 nm. Abra el cuadro de diálogo Configuración de hardware y establecer el valor de PMT del láser de 532 nm a un valor de 500. </li><li> En el cuadro de diálogo de configuración de hardware, sistema de energía al 100%, tamaño de píxel de 5 micras, las líneas de media a 1, y el foco puesto en 0 micras. </li><li> Realizar una exploración previa y establecer el área de exploración. </li><li> Realizar un análisis. </li><li> Una vez que haya finalizado la digitalización comprobar el histograma de la imagen. Lo ideal sería que 1E-5 cuentas normalizado debe ser de 65.000 significado límite de saturación que ~ 1.2% de las características se encuentran saturados. Si el recuento de normalización están a menos de 1e-5, aumentar la ganancia PMT y diapositivas a escanear el. Si el recuento normalizado son mayores que 1e-5, disminuye la ganancia PMT y diapositivas a escanear el. </li><li> Una vez que haya finalizado la digitalización guardar la imagen. Se recomienda elegir una convención de nomenclatura estándar para las imágenes para facilitar la referencia. La imagen ahora se pueden cargar en el programa de análisis de datos de preferencia para la normalización de datos y cálculo de los valores de intensidad. </li></ol> Resultados representante En primer lugar, puede comenzar a evaluar la eficacia de la reacción de marcaje fluorescente Cy3 del cDNA al comenzar el lavado con 0.1X SSC. Durante cada lavado posterior el flujo a través debería ser menos de color rosa con el último flujo a través de claro. Además, el Cy3 marcado cDNA producto debe ser visible en la columna durante estas etapas de lavado. Si el flujo a través de es de color rosa brillante en color o no hay ningún producto de color rosa en la columna, esta es una buena indicación de que la reacción de marcaje no procedió correctamente. La reacción de marcaje se puede evaluar cuantitativamente mediante el ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro para determinar la concentración de la etiqueta de ADN y la base de proporción de medio de contraste (Figura 1). La reacción de marcaje habitualmente produce al menos 10 mg de ADN marcado en nuestro laboratorio. Incorporación de tinte se puede calcular mediante una sencilla base / medio de contraste en relación a la secuencia de nucleótidos Cy3 relación es igual a la A 260 / A 550 multiplicado por 23,15. Valores que van desde 50 hasta 80 indican incorporación tinte suficiente en la reacción de marcaje. Si la reacción de marcaje produce una baja concentración de ADN o la incorporación tinte pobres, la hibridación de la muestra en el micrófonoroarray no es recomendable y etiquetado de reacción se debe repetir. Evaluación de la calidad de la hibridación puede llevarse a cabo mediante la evaluación del histograma de la imagen y la imagen escaneada de los microarrays (Figura 2). Hibridaciones aceptable tendrá un 1-2% de las características saturado (es decir, dando 1e-5 cuenta normalizado en el límite de saturación de 65.000) con el valor de PMT establecido cerca de 500. Si el valor de PMT tiene que ser ajustado drásticamente de 500 a alcanzar 1e-5 cuenta normalizado en el límite de saturación de 65.000, esto generalmente indica hibridación pobres del cDNA marcado con la micromatriz. Calidad de los datos estará compuesta por si estos datos se continúa a través de su análisis posterior. La calidad de la hibridación puede ser evaluada cualitativamente por la visualización de imágenes escaneadas de la matriz (Figura 3). El kit de Roche NimbleGen hibridación contiene una mezcla de oligo alineación de Cy3 y Cy5-etiquetados oligonucleótidos que hibridan 48mer a las características de alineación en las matrices. Evaluación cualitativa de la intensidad de los oligos de alineación con otras características de la matriz permite un control de calidad en la eficiencia de la hibridación del cDNA marcado con fluorescencia en la matriz. Tras el análisis anterior, un diagrama de dispersión de los datos analizados se puede utilizar para determinar los niveles relativos de expresión de genes y la identificación de genes que son expresados ​​diferencialmente entre las muestras (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="Miniatura de la Figura 1" /> Figura 1. Un espectro NanoDrop de cDNA marcado con Cy3. Rendimiento de ADNc marcado y la incorporación de medio de contraste puede ser evaluada mediante un ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="Miniatura de la Figura 1" /> Figura 2. Un histograma GenePix de microarrays de análisis. Calidad de la hibridación puede ser evaluado por el histograma de la imagen. Hibridaciones aceptable tendrá un 1-2% de las características saturado de 1e-5 cuenta normalizado en el límite de saturación de 65.000 con el valor de PMT establecido cerca de 500. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="Figura 3" /> Figura 3. Una imagen escaneada de microarrays. Hibridación de calidad puede ser evaluada mediante la visualización de la imagen escaneada de la micromatriz. La imagen debe ser examinado para detectar la presencia de polvo u otros factores que interfieren en la prohibición de visualización de cada función y, por tanto, la prevención de un cálculo preciso de la intensidad de fluorescencia de la función. La intensidad de los oligos alineación puede ser comparada con las otras características de la matriz para evaluar la eficiencia de la hibridación. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un gráfico de dispersión de un experimento de microarrays analizados. El objetivo de este procedimiento es identificar los genes que se expresan diferencialmente en las muestras. Microarrays de datos pueden ser analizados y ver en un gráfico de dispersión para visualizar los genes que son expresados ​​diferencialmente. Tabla 1. Componentes de Kit Roche NimbleGen hibridación agregar para el paso de hibridación 2. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Muestra (disuelto en agua) </td><td> 5 l </td></tr><tr><td> Tampón de hibridación 2X </td><td> 9 l </td></tr><tr><td> Una hibridación </td><td> 3,6 l </td></tr><tr><td> Alineación Oligo </td><td> 0,4 l </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 18 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Lave buffers que estar preparados para el lavado de las matrices siguientes hibridación. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Tampón de lavado IA * </td><td> Tampón de lavado IB </td><td> Tampón de lavado II </td><td> Tampón de lavado III </td></tr><tr><td> De agua </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td></tr><tr><td> 10 veces el tampón de lavado I, II o III </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M de TDT </td><td> 25 l </td><td> 25 l </td><td> 25 l </td><td> 25 l </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td></tr></tbody></table> * Pre-caliente a 42 ° C

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , (2008).</li></ol>

Muchos protocolos de microarrays, incluyendo el que se detalla aquí, utilice colorantes fluorescentes como un medio de medir y cuantificar la hibridación. El tinte fluorescente Cy3 es sensible a la foto y la degradación de la capa de ozono. Se recomienda que el procedimiento se llevó a cabo en un mínimo de iluminación. Además, las pequeñas partículas de polvo pueden interferir con la hibridación y la exploración. Se debe prestar especial atención a asegurarse de que el área de trabajo esté limpia y libre d...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Array Microcentrifuge Dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C-1303-T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioPrime Array CGH Genomic Labeling System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18095-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanine 3-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>NEL576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Array Processing Accessories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223539001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223474001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization System 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223652001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223504001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X1 Mixers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223725001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

global gene expression analysis using a zebrafish oligonucleotide microarray platform

Gen la tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y perfiles de expresión génica de los niveles de transcripción en forma todo el genoma. Gen la tecnología de microarrays se utiliza en numerosas disciplinas biológicas en una variedad de aplicaciones, incluyendo el análisis global de la expresión génica en relación con la etapa de desarrollo, a un estado de enfermedad, y en las respuestas tóxicas. En este documento, se incluye una demostración de un análisis global de la expresión génica utilizando una amplia pez cebra-específicas de la plataforma de microarrays de oligonucleótidos. La expresión de pez cebra plataforma de microarrays contiene 385.000 sondas, 60 pares de bases de longitud, interrogando a 37.157 blancos con hasta 12 sondas por objetivo. Para esta plataforma, toda la información genómica y de cDNA para el pez cebra se obtuvieron de diversas bases de datos genómicas incluyendo Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), y ZFIN (http://www.zfin.org). Como resultado de esta gama de expresión ofrece una cobertura completa de la transcriptome pez cebra actual. Los microarrays de expresión pez cebra fue impreso por Roche NimbleGen (Madison, WI). Esta demostración técnica incluye el marcaje fluorescente de un producto de cDNA, hibridación de los productos etiquetados cDNA a la plataforma de microarray y análisis de matriz para la adquisición de señales mediante la estrategia de un solo color el análisis.

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Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Microarrays de genes son herramientas poderosas en el perfil de expresión génica a nivel de todo el genoma. Esta tecnología tiene aplicación en una variedad de disciplinas biológicas como la biología del desarrollo y la toxicología. En este video, se detalla un protocolo para el análisis global de la expresión génica utilizando microarrays de oligonucleótidos de una plataforma completa para el pez cebra.

Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

global-gene-expression-analysis-using-zebrafish-oligonucleotide

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K vistas.  Purdue University. Microarrays de genes son herramientas poderosas en el perfil de expresión génica a nivel de todo el genoma. Esta tecnología tiene aplicación en una variedad de disciplinas biológicas como la biología del desarrollo y la toxicología. En este video, se detalla un protocolo para el análisis global de la expresión génica utilizando microarrays de oligonucleótidos de una plataforma completa para el pez cebra.

Video: Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...