Este trabajo fue apoyado por el NIH y la fundación PKD de ZS. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con Yale Centro de Recursos Animales (YARC) y Atención Institucional para las directrices del Comité (IACUC).

Parte 1: Preparación de pipetas y placas de microinyección de cámara <ol><li> Fabricar micropipetas de calefacción y tirar los tubos capilares de vidrio de borosilicato (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) en un dispositivo extractor de micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Almacenar en una placa de Petri en la parte superior de la pequeña cantidad de arcilla o cinta adhesiva. </li><li> Vierta el 1,5% de agarosa (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) en placas de medio 1x E3 moldeado con forma de cuña canales que sirven como un método fácil para la celebración de los embriones durante la inyección (como se describe en &#39;El libro de pez cebra &quot;) 1. Deje que la cámara de placas de agar se solidifique antes de usar y almacenar a 4 º C. </li></ol> Parte 2: Preparación de ARN Un método poderoso para los estudios de la función del gen es microinject in vitro transcritos de ARN tope en embriones de pez cebra. Cubiertas de ARN se comporta de manera similar a los ARNm eucariotas en vivo debido a la presencia del análogo de la PAC. Investigadores del pez cebra rutinariamente utilizan este método para sobreexpresar o misexpress su gen de interés. En esta demostración, vamos a microinject una transcripción EGFP de etiquetado y el uso directo de todo el embrión GFP-expresión como una lectura visible de una inyección de éxito. <ol><li> Realizar una reacción de transcripción in vitro de la PAC en su transcripción de ARN de interés. En nuestro laboratorio, de manera rutinaria insertar un cDNA de interés en un vector pCS2 + y llevar a cabo una reacción de síntesis in vitro de grandes cantidades de ARN tope con el mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340). </li><li> Purificar la muestra de ARN mediante la ejecución a través de la RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., 74104) o con fenol: cloroformo extracción y precipitación con isopropanol. </li><li> Con cuidado, determinar la concentración de la preparación de ARN y almacenar a -80 º C hasta que esté listo para su uso. </li><li> En el día de la inyección, descongelar la muestra de ARN, vortex ligeramente y girar hacia abajo brevemente. </li><li> Prepare una solución de trabajo con agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,050% de rojo fenol (Sigma-Aldrich Co., P0290). Rojo fenol sirve como un marcador visible para la inyección de la solución en el embrión. En este artículo, vamos a preparar una solución de trabajo de 100 ARNm EGFP ng / uL con 0,050% de rojo fenol. </li><li> Mantenga la muestra de trabajo en el hielo y acciones retorno de ARN a -80 ° C. </li><li> Proceder a la parte 4 cuando esté listo para inyectar la muestra. </li></ol> Parte 3: Preparación de morfolino Morfolino oligonucleótidos antisentido son ampliamente utilizados para modificar la expresión de genes mediante el bloqueo de la traducción de una proteína específica o mediante la modificación de pre-mRNA de empalme 2,3. Morfolinos en el pez cebra servir como una poderosa herramienta genética inversa por derribar la función del gen. En este artículo vamos a microinject un oligo morfolino dirigidos al sitio de iniciación de la traducción de PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Basado en el trabajo previamente establecido, se espera que los embriones inyectados para imitar fenotípicamente PKD2 4 peces mutantes. <ol><li> En forma rutinaria para 300 nmol de un oligo morfolinos diseñado específicamente para un gen de interés por parte de Gene Herramientas, LLC (Philomath, OR). </li><li> Añadir 100 uL de agua estéril para obtener una solución 3 mM de valores. Alícuota de la solución y almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> En el día de la inyección, calentar la solución morfolino a 65 ° C durante 5 minutos. Ajustar enfriar en hielo inmediatamente y girar brevemente. Este paso desnaturaliza las estructuras secundarias en el oligo y asegura que la solución esté completamente solubilizados. </li><li> Prepare una solución de trabajo mediante la dilución de la solución morfolino en agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,050% de rojo fenol. En esta demostración, que se prepara una solución de trabajo de 0,50 mm PKD2 morfolino con 0,050% de rojo fenol. </li><li> Seguir trabajando solución a temperatura ambiente. </li><li> Proceder a la parte 4 cuando esté listo para inyectar la muestra .---- </li></ol> Parte 4: Llenado de la micropipeta con su solución de trabajo <ol><li> Cortar el extremo distal de una micropipeta con fórceps o una hoja de afeitar quirúrgico para crear una abertura que es apenas visible bajo un microscopio de disección (Nikon Instruments, Inc., SM2645) con un aumento de 50X. </li><li> Coloque 2 l de la solución de trabajo como una gota en un portaobjetos. </li><li> Coloque la parte de atrás de una micropipeta a una jeringa de 5 ml equipado con un tubo de una aguja hipodérmica y un poco sumergir la punta distal de la micropipeta en su gota de solución de trabajo. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta. </li><li> Sifón de la solución de trabajo a través del extremo distal de la micropipeta, tirando del émbolo de la jeringa. </li></ol> Parte 5: Calibración del volumen de inyección micropipeta <ol><li> Coloque una gota de aceite mineral (American Inc. Bioanalytical, AB00921-00025) en una diapositiva micrómetro (Fisher, 12-561-SM1). </li><li> A su vez en el poder y el suministro de aire a la presión de pulso micro inyectores aparato (World Precision Instruments Inc., PV830). </li><li> Fije la micropipeta al titular de la micropipeta de los aparatos de micro inyectores. El inyector de micro es la presión regulada y las descargas se activan pulsando el pedal. </li><li> Bajo el microscopio de disección, prueba el volumen de inyección con inyector micro para colocar una gota de la solución de trabajo sobre el aceite de micrómetro. Mida el diámetro de la gota que flota como una esfera en la parte superior del aceite. </li><li> Ajustar la duración y la presión de inyección para calibrar su cuidado volumen de inyección. Este paso ayuda a la reproducibilidad de los experimentos de microinyección. En esta demostración, todas las microinyecciones se llevará a cabo con un diámetro de la gota de 0,15 mm (aproximadamente 1,76 nL en volumen). </li><li> Una vez que el volumen de la inyección ha sido calibrado, utilice el &quot;Hold&quot; botón en el inyector de micro para evitar que el relleno y las fugas de la micropipeta. </li></ol> Parte 6: Preparación fecundado embriones de pez cebra para la microinyección <ol><li> Pez cebra al azar mate en las primeras horas de cada mañana. Recoger los embriones en la etapa 1 de las células y colocarlas en 1x medio E3. </li><li> Con una pipeta de transferencia de 3 ml (Becton Dickinson Labware, 357524), organizar los embriones a lo largo de los valles en forma de cuña en las placas de microinyección de cámara. </li><li> Eliminar el medio para que los embriones son superficialmente sumergida y no inundadas. Este paso ayuda a la solución de los embriones en el fondo de los valles, así como en la penetración del corion de la micropipeta. </li></ol> Parte 7: Microinyección a través del corion <ol><li> Manipular los embriones con la micropipeta de modo que el citoplasma de las embrión en su fase 1-célula ya es visible bajo el microscopio de disección. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta. </li><li> Penetrar en el corion y la yema con la micropipeta con el fin de inyectar en el embrión. En esta demostración, que será la primera microinyección en la yema directamente debajo de la celda, y permitir el flujo citoplásmico y difusión para que la solución de trabajo en la célula. Este flujo es visible debido a la rojo fenol a la solución de trabajo. </li><li> También vamos a demostrar de inyección directa en el citoplasma celular. Microinyección directa en la célula es más robusto, pero mucho tiempo como la orientación adecuada del embrión y la técnica de microinyección es necesario. Como la membrana celular es más riguroso que la membrana de la yema, a menudo es más rápido para entrar en la micropipeta a través de la yema de huevo para alcanzar el citoplasma de la célula. Orientar el polo animal hacia la parte inferior de la cubeta y el trabajo con mano firme puede ayudar en este método de la inyección. </li><li> Después de la microinyección, colocar los embriones en una placa de Petri con medio E3 y se incuba en los 28,5 ° C para el desarrollo normal. </li><li> Durante las próximas horas y días diferentes del desarrollo del embrión, observar los embriones para su fenotipos de interés. </li></ol> Parte 8: Los resultados representativos EGFP sobreexpresión de ARNm: Para verificar el éxito de la microinyección, vamos a observar la expresión de GFP en los embriones en desarrollo a partir de la etapa escudo (~ 6 HPF) de la microscopia de fluorescencia in vivo de todo el embrión (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expresión de la construcción es el más fuerte durante los primeros eventos del desarrollo embrionario y, a menudo disminuirá durante el desarrollo como la inyección de ARN tope es degradado gradualmente y depende de la estabilidad de la proteína expresada. PKD2 traslación de bloqueo morfolino: En base a los resultados publicados anteriormente, esperamos que el PKD2 morphants para imitar la curvatura del cuerpo del eje dorsal que se encuentra en PKD2 pez cebra mutante y quistes del riñón en la actualidad aproximadamente 2 - 3 fdd 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: Los resultados representativos de la microinyección de ARNm EGFP y PKD2 agosto morfolino. (A) los embriones fueron TAB microinyección en la etapa de una célula con 0,17 ng de ARNm EGFP y se visualizan en un DPF en vivo la expresión de GFP. (B, c) los embriones fueron TAB microinyección en la fase 1 de las células con ~ 1,7 nl de una PKD2 traslacional bloqueo morfolino a 0,50 mm y anotó para la curvatura dorsal del cuerpo a las 4 de fdd.

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	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Microinyección en embriones de pez cebra es una técnica bien establecida y robusta para explorar el papel de un gen en particular en el desarrollo. Las aplicaciones incluyen la sobre-expresión, misexpression, y los ensayos de caída de su gen de interés, así como el análisis de epistasis entre múltiples genes. Microinyección en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para la generación de animales transgénicos y la asignación de destino de las células de los embriones tempranos de blástula 5,6,7,8,9...

Todos los otros materiales se enumeran en el protocolo.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

Una herramienta esencial para investigar el papel de un gen durante el desarrollo es la capacidad de realizar caída del gen, la sobreexpresión y estudios misexpression. En el pez cebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), La microinyección de ARN, el ADN, las proteínas, los oligonucleótidos antisentido y otras moléculas pequeñas en el embrión en desarrollo ofrece a los investigadores un ensayo rápido y robusto para explorar la función de genes<em&gt; In vivo</em&gt;. En este video-artículo, vamos a demostrar cómo preparar y microinject<em&gt; In vitro</em&gt; Sintetizado EGFP ARNm y un oligo-traslacional bloqueo contra morfolino<em&gt; PKD2</em&gt;, Un gen asociado con la enfermedad de herencia autosómica dominante del riñón poliquístico (PQRAD), en una de las células de embriones de pez cebra etapa. A continuación, se analizará el éxito de los ARNm y microinyecciones morfolino mediante la verificación de buenas prácticas agrarias expresión y análisis de fenotipo. Amplia gama de aplicaciones de esta técnica incluyen la generación de animales transgénicos y las quimeras de línea germinal, la cartografía de la célula-destino y la detección de genes. En este documento se describe un protocolo para la sobreexpresión de EGFP y caída de<em&gt; PKD2</em&gt; Por ARNm y la inyección de morfolino oligonucleótidos.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. at JoVE.com

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.6K vistas.  Yale University School of Medicine. Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Video: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Investigación

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

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