El trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones AI57159 (SCH) y AI72346 (a amvo). SCH es un Howard Hughes Medical Institute.

Cubierta de vidrio antideslizante funcionalización La bicapa plana utilizada en el ensayo de fusión es compatible con una película hidratada de dextrano. Dextrano actúa como un espaciador entre las dos capas planas y superficie de cristal. Esto evita que los componentes de la membrana de ser atrapado en la superficie del cristal y también proporciona un espacio para que el contenido de una partícula de virus puede escapar a la fusión. Cubreobjetos de vidrio son funcionalizados mediante el tratamiento con una resina epoxi de silano, que nos permite adhieren químicamente dextrano al vidrio (Elender, et al. 1996). <ol><li> Organizar 25 mm cubreobjetos en una gradilla de tinción de cerámica, y colocar el bastidor en una jarra o un vaso. </li><li> Llene el recipiente con una solución al 10% de grado de laboratorio detergente cristalería. Coloque el recipiente en un limpiador ultrasónico durante 30 minutos. </li><li> Enjuagar el recipiente y el estante portaobjetos con agua destilada, y rellenar con hidróxido de postassium 1M. Devolver el contenedor al baño de ultrasonido durante 30 minutos. </li><li> Repita este procedimiento de limpieza con acetona y etanol. </li><li> Enjuague el coverlips en agua y seco. </li><li> Por último, limpiar los cubreobjetos con un separador de plasma de oxígeno durante tres minutos. </li><li> El paso de la última limpieza se oxida la superficie, haciendo que el cristal de manera uniforme hidrofílicos y reactivos en los pasos siguientes silanización. </li><li> Prepare una solución al 0,2% de 3-glycidoxypropyltrimethoxy silano en isopropanol. Sumerja el cubreobjetos en esta solución durante cinco minutos. </li><li> Deseche la solución de silano y enjuague varias veces cubreobjetos en isopropanol. </li><li> El cubreobjetos están recubiertas con una capa de silano, pero deben ser curadas para permitir que el silano de unión covalente con el vidrio. Coloque el cubreobjetos en un horno a 80 grados centígrados durante una hora. </li><li> Mientras que el cubreobjetos se cura, se pesarán dextrano 500 y preparar un 30% w / v solución. El precalentamiento del agua ayudará a la disolución. Vamos a utilizar aproximadamente 1 ml de esta solución por tapar. Una vez que el dextrano se ha disuelto, desairear la solución en un desecador de vacío. </li><li> Cuando el cubreobjetos silanizada haya terminado el curado, sacarlos de la parrilla de cerámica y colocarlos apoyados en el interior de una caja de plástico para congelar. Use una pipeta de 1 ml para cubrir la superficie superior de cada cubreobjetos con ~ 1 ml de la solución de dextrano. Cerrar el cuadro de congelador y déjelo en un lugar tranquilo para 24-36 horas. </li><li> Mientras sujeta el cubreobjetos con unas pinzas de plástico, vierte el exceso de dextrano y vuelva a colocar en el frontal de cerámica. Enjuagar varias veces el cubreobjetos en agua, y permitir que el cubreobjetos en remojo en agua durante 48 horas. El frasco se agita suavemente en un rotor de mesa. </li><li> Seque el cubreobjetos en un horno a 80 grados centígrados y almacenar en un desecador de vacío. </li></ol> Preparación de liposomas Apoyado bicapas lipídicas se forman mediante la adsorción de liposomas para un cubreobjetos dextrano funcionalizados. El adsorbido liposomas se fusionan con la membrana entre si hasta que se rompe y se extiende sobre la superficie plana. <ol><li> Una formulación típica liposoma utilizado en el ensayo se compone de 1,2, dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), el colesterol, el cerebro de la especie bovina Disialoganglioside (GD 1 bis), y N-(6 (- (biotinoyl) amino) hexanoilo) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina en una proporción de 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Todos los componentes están almacenados en cloroformo o cloroformo y soluciones de metanol. </li><li> Prepare una mezcla que contiene dos micromoles de lípidos mediante la transferencia de volúmenes de cada componente en un tubo de ensayo de vidrio. Se evapora el solvente bajo una corriente de argón o nitrógeno. Eliminar el disolvente restante, dejando el tubo de ensayo en un desecador al vacío durante dos horas. </li><li> Resuspender la película de lípidos se seca en 400 microlitros de tampón HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de plástico. Congelar la suspensión en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en un baño de agua tibia. Repita este ciclo de congelación / descongelación en cuatro ocasiones. </li><li> Montar una extrusora de lípidos con un 100 nm filtro de membrana de policarbonato, y la extrusión de la suspensión de lípidos 25 veces. La suspensión debe aparecer para ser más transparente después de la extrusión. </li><li> Los liposomas se debe utilizar en el día en que se preparan. Se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su uso. </li></ol> Flujo de microfluidos preparación de células Una simple célula de flujo de microfluidos se hace intercalando cinta adhesiva doble entre un portaobjetos de cuarzo y un portaobjetos funcionalizado. <ol><li> Obtener una diapositiva mm 20x20x3 cuarzo. Utilice una fresa de diamante para perforar dos agujeros de 1 mm en los lados opuestos. </li><li> Corte un cuadrado de 20 mm de una lámina de cinta adhesiva doble, y una hoja de afeitar, cortar una sección de 15 x 2 mm del centro. </li><li> Pele un lado de la cinta de respaldo, y cumplir la cinta hasta el cuartoz de diapositivas. Se adhieren al otro lado de un cubreobjetos funcionalizados. </li><li> Cortar dos de 20 cm de longitud de tubería de polietileno y los insertan en los agujeros en la diapositiva de cuarzo. </li><li> Sello de la celda de flujo con pegamento epóxico de 5 minutos. </li><li> Cuando el pegamento ha curado, el primer celular y el flujo de la tubería con el tampón. </li><li> Una bicapa lipídica apoyo se pueden formar en esta etapa de la elaboración de aproximadamente 80 microlitros de la suspensión de liposomas en los canales. </li></ol> Virus etiquetado de partículas <ol><li> H3N2 de la gripe A (X-31) se suele utilizar para el ensayo de fusión, pero otras cepas de gripe y otros virus han utilizado con éxito. </li><li> Virus se etiqueta con un máximo de dos tintes fluorescentes diferentes para permitir la detección de hemifusion y formación de poros. </li><li> Disolver sulforodamina b (SRB) en tampón HNE para hacer una solución de 20 mM. Combine 20 microlitros de la solución de colorante con 10 microlitros de la suspensión viral, y dejar a temperatura ambiente durante 20 horas. Durante este período, el tinte poco a poco se acumulan dentro de las partículas del virus. </li><li> Retire el exceso de colorante al pasar la suspensión de virus a través de una columna PD-10 desalación. Si el material viral se usa suficiente, una banda de color se puede ver en la columna. Esta banda contiene virus de la etiqueta y se pueden recoger, ya que se eluye. </li><li> Si la banda no es visible, recogen fracciones de 200 microlitros y determinar qué fracciones contienen la etiqueta del virus mediante la medición de la absorción de 565 nm en un espectrofotómetro. El virus debe eluir en un volumen total de aproximadamente 0,8 ml. </li><li> Etiqueta de la envoltura viral mediante la adición de 13 microlitros de una formamida 2 mM de dimetilo (DMF), solución de octadecilo rodamina 110 (Rh110C18) a la suspensión de virus SRB etiquetados. </li><li> Agite la suspensión por colocar el tubo a un rotor de laboratorio y se deja durante 3 horas. </li><li> Purificar el virus del exceso Rh110C18 con un PD-10 columna de la desalación como se ha descrito antes. </li></ol> Microscopio de configuración El experimento se realiza en un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de inmersión en alta NA aceite adecuado para el total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna. Los 488 y 568 nm de las líneas de un láser de argón / kriptón gas se utiliza para excitar el virus Rh110C18 SRB y etiquetados. Imágenes simultáneas de cada etiqueta se logra mediante el fraccionamiento de la emisión de fluorescencia verde y rojo con un espejo dicroico y centrarse de forma independiente las imágenes en mitades separadas de un electrón de multiplicar la cámara CCD. Realizar el ensayo Ejecución de la fusión de ensayo consiste en un conjunto de pasos de los componentes bioquímicos en la celda de flujo: el montaje de la bicapa lipídica plana, de acoplamiento de las partículas de virus marcado, cubriendo la superficie con fluoresceína, y el inicio de la reacción con el buffer de pH bajo (Figura 1) . <ol><li> Montar la celda de flujo en la platina del microscopio, y conectar la tubería de salida de una bomba de jeringa establecido en el flujo a una velocidad de 40 microlitros por minuto. </li><li> Borrar los canales de flujo de los liposomas por el exceso de fluido en 300 microlitros de la ENH. </li><li> Enfocar el microscopio y ajustar la potencia del láser para iluminar la superficie con 350 W / cm 2 de luz de 488 nm y 70 W / cm 2 nm de luz 568. Si usted está usando un 1.45 NA objetivo 60x de inmersión en aceite, ajustar la intensidad de láser de 100 vatios y 20 vatios micro micro, respectivamente. </li><li> Bomba de virus marcado (diluido 1 / 100) en una celda de flujo. A medida que el virus se difunde a la superficie inferior del canal de flujo, las partículas comienzan a pegarse a los gangliósidos incorporados en la bicapa lipídica. </li><li> Cuando una densidad adecuada de partículas de virus acoplado se ha alcanzado (hasta alrededor de 1000 partículas por campo de visión). Cambiar la tubería de entrada a una solución que contiene dos microgramos por mililitro estreptavidina marcada con fluoresceína. La estreptavidina marcada se une a la biotina unido moléculas de lípidos en la bicapa, y, finalmente, un fondo verde oscuro será visible. </li><li> Lave el canal de flujo con 300 microlitros de la ENH. </li><li> Elija un área de imagen, enfocar el microscopio y preparar la cámara CCD para la adquisición de la imagen del tiempo transcurrido. Establecer el tiempo de exposición a 100 ms y recoger imágenes a una velocidad de 10 Hz. </li><li> Iniciar la fusión por las corrientes en un tampón ácido que contiene 10 mM de citrato sódico y 140 mM de NaCl. El pH de la solución debe ser ajustado por debajo del pH crítico de los virus que se analizaron. X-31 fusibles con un pH por debajo de 5,5. </li></ol> Resultados representante La figura 1B muestra instantáneas de bicapa viriones atracado antes y durante la fusión. Cada punto de difracción limitada representa una partícula de virus individuales. Red y la fluorescencia verde se han separado imágenes en las mitades superior e inferior de una cámara CCD, que permite la observación simultánea de la envoltura viral y etiquetas de contenido. Normalmente hay el doble de puntos en el canal verde en comparación conel rojo, lo que refleja la menor eficiencia de etiquetado por el tinte de contenido en comparación con la etiqueta envolvente. La fluorescencia de fondo verde emitida por la superficie límite fluoresceína desaparece a la llegada de la solución tampón de citrato y permite determinar la hora de inicio de la reacción de fusión. Hemifusion eventos se detectan como ráfagas de fluorescencia de color verde como el apagado Rh110C18 en la cubierta del virus se difunde a través del tallo hemifusion y se diluye en la membrana plana. Una nube en expansión hacia el exterior fluorescentes se pueden ver alrededor de las partículas hemifused, lo que demuestra la libre difusión del colorante-acil grasos unidos en la membrana plana. La formación de poros se observa como la decadencia de la fluorescencia roja de SRB atrapado en el interior de las partículas virales. La apertura de un poro de fusión permite que la tinta se escape al espacio acuoso por debajo de la bicapa plana y fuera de la región de observación. Trayectorias de intensidad de fluorescencia para cada partícula, trazada a partir de las intensidades integradas de las partículas individuales, facilitar la determinación del rendimiento y los tiempos de hemifusion y la formación de poros (Fig. 1C). Veces Hemifusion y la formación de poros caso se determinará como el punto donde la pendiente máxima de un estallido Rh110C18 fluorescencia o la decadencia SRB señal. En un experimento exitoso, un 50 por ciento de las partículas marcadas con señales Rh110C18 dequenching rendimiento, y un 30 por ciento de las partículas SRB etiquetados dar señal útil. De las partículas marcadas con ambos colorantes, aproximadamente el 10 por ciento muestran las dos señales de la formación de mezcla de lípidos y de los poros. Fig. 2A-C muestra la distribución de hemifusion y los tiempos de formación de poros retraso de un experimento típico. Fig.2D-F muestra la distribución de eventos de eventos combinados de cinco experimentos realizados en las mismas condiciones. Incluso con un modesto número de observaciones, la forma de los histogramas es evidente. Debido a que cada experimento se sincroniza con la detección de los casos la disminución del pH, los experimentos se pueden combinar y obtener información detallada sobre la limitación de velocidad pasos intermedios se pueden obtener. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="la figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="la figura 1" /> Figura 1. El diseño experimental. A) Las partículas virales se marcan con dos tintes fluorescentes para controlar la cinética de hemifusion y la formación de poro de fusión. La fluorescencia es recogida por un objetivo de microscopio de alto NA y la imagen en un CCD. B) Imágenes de fluorescencia antes (izquierda) y durante (derecha) la fusión de las partículas virales individuales. Mitad superior e inferior de cada imagen corresponden a la fluorescencia roja y verde, respectivamente, de la misma área de ~ 50 x 100 mm 2 de la bicapa de apoyo. C) La intensidad de la fluorescencia del marcador rojo SRB contenido viral (traza superior), el verde Rh110C18 membrana tinte (en el centro de seguimiento), y el sensor de pH de fluoresceína (traza inferior) ofrecen tiempos exactos transcurridos entre la caída de pH, hemifusion, y la fusión. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Cinética de fusión del virus de la etiqueta fluorescente. Distribuciones del tiempo transcurrido entre la caída del pH y hemifusion (A, D) y la formación de poros (B, E). El auge y la decadencia de las distribuciones de indicar la presencia de varios pasos intermedios. La transición entre hemifusion y la apertura de un poro de fusión de las partículas individuales se distribuyen de manera exponencial, lo que sugiere un solo paso limitante. Los paneles AC muestran los resultados de un solo experimento. DF paneles se compilan a partir de cinco experimentos independientes realizados en las mismas condiciones. Por favor, <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2.

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Preparación de fluido y continuo apoyo bicapa lipídica puede ser un reto. Trazas de contaminación de los defectos de material o superficie prevenir la propagación de bicapas. Su limpieza y deposición de una capa uniforme de dextrano son esenciales. Imagen prolongada de partículas del virus pueden blanquear los marcadores fluorescentes o hacer que se inactiva. Foto-daño de este tipo es muy conocido en la bio-imágenes y campos de una sola molécula y se cree generalmente que se derivan...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

La fusión de membranas es un paso esencial en la entrada de los virus envueltos en las células. Ensayos convencionales de fusión suelen informar sobre un gran número de eventos de fusión, por lo que es difícil de analizar cuantitativamente la secuencia de los pasos moleculares que intervienen. Hemos desarrollado una in vitro, de dos colores ensayo de fluorescencia para controlar la cinética del virus de la única fusión de partículas con una doble capa de destino en un soporte esencial líquido. Partículas virales de la gripe se incuban con un fluoróforo verde lipofílico para teñir la membrana y un fluoróforo rojo hidrófilo para manchar el interior viral. Depositamos una bicapa lipídica que contienen gangliósidos en la superficie del vidrio dextrano functionilized de una celda de flujo, incubar las partículas virales en la bicapa plana y la imagen de la fluorescencia de un 100 x 100 m 2 Superficie, que contiene varios cientos de partículas, en un CCD cámara. Por imágenes tanto de la fluorescencia roja y verde, que al mismo tiempo puede controlar el comportamiento de la membrana de colorante (verde) y el contenido acuoso (rojo) de las partículas. Al bajar el pH a un valor inferior al pH de fusión, las partículas se fusionan con la membrana. Hemifusion, la fusión de la hoja exterior de la membrana viral con la hoja exterior de la membrana de destino, será visible como un repentino cambio en la fluorescencia verde de una partícula. Tras la posterior fusión de los dos folletos distal restante un poro se formará y el fluoróforo rojo que emiten en la partícula viral se dará a conocer en la membrana blanco. Este acontecimiento dará lugar a una disminución de la fluorescencia de color rojo de las partículas individuales. Finalmente, la fluorescencia de un fluoróforo integrados sensibles al pH que se incrusta en la membrana de destino informa sobre la hora exacta de la caída del pH. De las tres de fluorescencia a tiempo las huellas, todos los eventos importantes (disminución del pH, mezcla de lípidos en hemifusion, el contenido de la mezcla sobre la formación de poros), ahora se puede extraer de una manera directa y para cada partícula individual. Mediante la recopilación de los tiempos transcurridos para las diversas transiciones de muchas partículas individuales en los histogramas, se puede determinar la vida útil de los productos intermedios correspondientes. Incluso intermedios ocultos que no tienen un observable fluorescentes directos pueden ser visualizados directamente de estos histogramas.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Se presenta un<em&gt; In vitro,</em&gt; De dos colores ensayo de fluorescencia para visualizar la fusión de las partículas del virus solo con una capa doble objetivo de líquidos. Mediante el etiquetado, las partículas virales con fluoróforos que diferencialmente mancha de la membrana viral y en su interior, somos capaces de controlar la cinética de hemifusion y la formación de poros.

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vistas.  Harvard Medical School. Se presenta un In vitro, De dos colores ensayo de fluorescencia para visualizar la fusión de las partículas del virus solo con una capa doble objetivo de líquidos. Mediante el etiquetado, las partículas virales con fluoróforos que diferencialmente mancha de la membrana viral y en su interior, somos capaces de controlar la cinética de hemifusion y la formación de poros.

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Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Investigación

Biología

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Simple y eficaz administración y visualización de micropartículas en el sistema circulatorio de peces pequeños con inyección de riñón

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Aislamiento y la proyección de imagen de fluorescencia para la reconstrucción de la solo-partícula de Chlamydomonas centriolos

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...