Agradecemos RB Tesh para proporcionar el ratón policlonal anti-RVFV antisuero y M. Griffin del UTMB Citometría de Flujo Core Facility para ayudar con la citometría de flujo. Esta labor fue apoyada por 5 U54 AI057156 a través del Centro de Excelencia de la Región Occidental, NIH subvención R01 AI08764301, y la financiación del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de UTMB.BK fue apoyado por el James W. McLaughlin Fondo de Becas en UTMB.OL fue apoyado por R. Hilleman Early-Stage Premio Investigador Carrera Maurice.

Análisis de la transcripción por microscopía de fluorescencia 1. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE <ol><li> Lugar 12 mm cubreobjetos redondos en placa de cultivo tisular de 12 pocillos, un cubreobjetos por pocillo. </li></ol> Nota: Si las células tienen problemas para la adhesión a cubreobjetos, la capa con poli-L-lisina (MW ≥ 70000) antes de colocar en los pozos. Para este objetivo, cubreobjetos de sumergir en una solución estéril de 0,1 mg / ml en H2O de poli-L-lisina durante 5 min. Enjuague cubreobjetos con H2O estéril y secar al aire durante al menos 2 horas. <ol start="2"><li> Para las células de semillas 293 en cubreobjetos, añadir x 10 células 4 5 en 1 ml de medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) por pocillo. Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% CO 2 S / N. </li><li> Infectar las células con MP-12 a una multiplicidad de infección (MOI) de 3. Incluya por lo menos dos<html> pozos no infectados: uno de los dos pozos servirán como el control no infectado, y el otro serán tratados con actinomicina D (ActD) en el paso 1.5 como un control para la supresión transcripcional. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 200 ml. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> Nota: En vez de infectar a las células, las células también se pueden transfectar con ADN plásmido o in vitro sintetizan ARN que codifica una proteína viral específica. Para este objetivo, transfectar células con un reactivo de transfección química apropiada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y continúe en el paso 1.5 a 16 h después de la transfección. Es aconsejable para optimizar las condiciones de transfección y el tiempo de incubación antes de su etiquetado ARN y la fijación. <ol start="4"><li> Eliminar el inóculo y se añade 1 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 15 hr. </li></ol>ove_content &quot;&gt; Nota:. Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado de ARN y la fijación Configurar este curso de tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonadas y todos muestras pueden ser etiquetados, se fijaron, y se tiñeron en el mismo tiempo. <ol start="5"><li> En 15 horas después de la infección (hpi), sustituya medio de cultivo con medio que contenía 1 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora. </li><li> A los 16 hpi, eliminar el medio y lavar los cubreobjetos de una vez con 1 ml de PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / l, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) por pocillo. Fijar las células mediante la adición de 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) por pocillo e incubando durante 30 min a TA. </li></ol>Nota: Para preparar la solución de fijación PFA 4%, se disuelven 10 g de paraformaldehído en 150 ml de H 2 O se calienta a 60 ° C en un agitador magnético con calefacción. Añadir 500 l de NaOH 1 M y seguir removiendo hasta que la solución se aclare. Filtrar la solución de PFA a través de un papel de filtro para eliminar las partículas y añadir 62,5 ml de tampón de fosfato (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,4). Añadir H2O hasta un volumen total de 250 ml. Congelar a -20 ° C en alícuotas de un solo uso. <ol start="7"><li> Lavar una vez con 1 ml de PBS por pocillo. No se requiere tiempo de incubación para este y todos los pasos de lavado posteriores. Proceda inmediatamente al paso 2. </li></ol> Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo, una pérdida de la señal de fluorescencia de RNA ya se puede observar si las células se mantienen durante 1 hora a 4 ° C . Del mismo modo, si porformando un experimento de evolución en el tiempo, asegúrese de etiqueta, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo. 2. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado <ol><li> Permeabilizar las células mediante la adición de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA. </li></ol> Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 2.1 a 2.3 deben estar libre de nucleasa. <ol start="2"><li> Lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li><li> Retire cubreobjetos de la placa de 12 pocillos y transferencia en cámara húmeda. Cubra cada portaobjetos con 50 - 100 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de CuSO4, 20 mM de azida fluorescente [excitación / emisión máxima: 590/617 nm], ácido ascórbico 100 mM) cada uno. Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Para el montaje de la cámara húmeda, línea de la parte inferior de un cultivo de células o placa de Petri con un diámetro de 10 cm con una película de plástico de parafina. Forre el interior del borde de la diSH con toallas de papel húmedas. Coloque el cubreobjetos sobre la película de parafina plástico. Nota: Tenga cuidado de no dejar que los cubreobjetos se sequen durante este o cualquier otro paso en el protocolo. Lo mejor es añadir la solución de tinción a cada cubreobjetos directamente después de que se ha colocado en la cámara húmeda. Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo. Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que coincida con los filtros de su microscopio de fluorescencia. <ol start="4"><li> Retire cubreobjetos de cámara húmeda y colocar en una placa de 12 pocillos frescos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li></ol> Nota: si no dese desea la protección de las proteínas virales, cubreobjetos se puede montar y fotografiada después de este paso (vaya al paso 3.3). 3. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales <ol><li> Añadir 1 ml de tampón de bloqueo (3% (w / v) de suero de albúmina (BSA) en PBS bovina) a cada pocillo y se incuba durante 30 min a TA en la oscuridad. </li><li> Retire cubreobjetos de placa de 12 pocillos, de transferencia en cámara húmeda y cubra con 50 - 100 l de anticuerpo primario (anti-RVFV, una especie de regalo del Dr. RB Tesh, UTMB) diluido en tampón de bloqueo (1:500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero. Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad. <ol start="3"><li> Retire cubreobjetos de cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavartres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li><li> Retire cubreobjetos de un lugar de 12 pocillos, en lugar cámara húmeda y cubierta con 50 - 100 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón de bloqueo (1: 500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Asegúrese de seleccionar un anticuerpo secundario que puede reconocer el anticuerpo primario y coincide con los filtros de su microscopio de fluorescencia. Nota: Si se desea, 200 ng / ml de DAPI se puede añadir a la dilución de anticuerpo secundario para visualizar los núcleos. <ol start="5"><li> Retire cubreobjetos de la cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li><li> Montar cubreobjetos mediante la colocación de una gota (ca. 15 l) de Fluoromount-G en un portaobjetos de microscopio. Sumerja el portaobjetos en H 2 O, eliminar el exceso de H 2 O tocando ªlado de correo contra una toalla de papel, y el lugar de células del lado hacia abajo en la gota de Fluoromount-G. Deje secar al aire durante 5 minutos. </li></ol> Nota: Si formación de imágenes en un microscopio invertido, permitir Fluoromount-G para solidificar a 4 ° CO / N o colocar el cubreobjetos en el portaobjetos de un microscopio mediante el sellado del borde con esmalte de uñas transparente. Nota: diapositivas se pueden visualizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de una semana. 4. Adquisición de Datos <ol><li> De imagen usando un microscopio de fluorescencia. </li></ol> Nota: Asegúrese de seleccionar fluoróforos adecuados que se pueden visualizar utilizando su microscopio. Como referencia, los siguientes son los fluoróforos y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de las imágenes mostradas en esta publicación. DAPI: Filtro de excitación: BP 330-385 Dichromatic espejo: 400 DM Filtro de emisiones: LP 420 Filtro de excitación: BP 460-490 Dichromatic espejo: 505 DM Filtro de emisiones: LP 510 Fluoróforo con un máximo de excitación / emisión de 590/617: Filtro de excitación: BP 545-580 Dichromatic espejo: 600 DM Filtro de emisiones: LP 610 Análisis de la transcripción por citometría de flujo 5. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE <ol><li> Semilla células 293 en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos en medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina). Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que las células han alcanzado el 80 - 100% de confluencia. </li><li> Infectar las células con MP-12 a una moi de 3. Incluir al menos dos pozos infectados: uno de los dos pozos servirá como control no infectado, el otro serán tratados con ActD en el paso5.4. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 400 l. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Retire inóculo y añadir 2 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 12 hr. </li></ol> Nota: Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado y la cosecha. Establecer este supuesto tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonados y todas las muestras pueden ser etiquetados, se recogieron, y se tiñeron en el mismo tiempo. <ol start="4"><li> A las 12 hpi, sustituya medio de cultivo en un medio con 0,5 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora. </li><li> A los 13 hpi, lavar las células una vez que el ingenioh PBS y la cosecha por tratamiento con tripsina de las células. Lavar las células cosechadas tres veces con PBS que contenía 1 mM de EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Nota: Durante esta y las siguientes medidas, no centrifugar las células más rápidamente que 500 - 1000 xg para evitar la rotura celular. Centrifugar las células durante 1-2 min para sedimentar. Nota: Si se planea una inmunotinción superficie siguiendo la reacción de click, la cosecha utilizando una goma de policía o un raspador celular desechable en su lugar. <ol start="6"><li> Fijar las células mediante resuspensión en 1 ml de PFA al 4% y se incuba durante 30 min a TA. Consulte el paso 1.6 para obtener instrucciones sobre cómo preparar 4% PFA. </li><li> Lavar una vez con 1 ml de PBS-EDTA por pocillo. Proceda inmediatamente al paso 6. </li></ol> Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo. Del mismo modo, si se realiza una vez cexperimento ourse, asegúrese de etiquetar, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo. 6. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado <ol><li> Permeabilizar las células mediante resuspensión en 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA. </li></ol> Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 6.1 a 6.3 deben estar libre de nucleasa. Nota: Si las células no hacen sedimentos correctamente durante este paso, aumentar el tiempo de centrifugación de 5 min. Comportamiento de sedimentación se mejorará una vez que las células se suspenden en tampón FACS (paso 6.4). <ol start="2"><li> Lavar una vez con 1 ml de PBS. </li></ol> Nota: No utilice EDTA en este paso, ya que esto quelar el Cu 2 + iones necesarios para la reacción de click. <ol start="3"><li> Resuspender las células en 200 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de CuSO4, 200 nM azida marcado con colorante fluorescente [exclitación / máximo de emisión: 650/665 nm], ácido ascórbico 100 mM). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo. Nota: Si las células se agrupan durante este paso, volver a suspender pipeteando arriba y abajo varias veces. Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que puede ser detectada por el citómetro de flujo. Nota: también preparar una muestra de las células infectadas que no están sometidos al procedimiento de tinción clic; éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas o incluir un adicional de infección así en el paso 5.2. Estos concélulas trol se immunostained en el paso 7.1. <ol start="4"><li> Lavar dos veces con tampón FACS (PBS que contenía 1 mM de EDTA y 0,5% (w / v) de BSA). </li></ol> Nota: Si no se desea inmunotinción de proteínas virales, las células se pueden analizar inmediatamente (continúe en el paso 8). 7. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales <ol><li> Resuspender las células en 200 l de anticuerpo primario (anti-RVFV) diluidos en tampón FACS (1:10.000) y se incuban durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad. Nota: También prepara una muestra de las células no infectadas que se sometieron al procedimiento de tinción clic, pero no se immunostained, éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas simuladas o incluir un bien no infectada adicional enpaso 5.2. Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero. <ol start="2"><li> Lavar las células dos veces en tampón FACS. </li><li> Resuspender las células en 200 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón FACS (1:1.000) y se incuba durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li><li> Lavar las células una vez en tampón FACS. </li></ol> Nota: En este punto, las células pueden ser almacenadas O / N a 4 ° C en la oscuridad. 8. Adquisición de Datos <ol><li> Resuspender las células en 500 l de tampón FACS, transferencia en tubos de poliestireno de 5 ml y analizar utilizando un citómetro de flujo. Usa-12 MP células infectadas (ninguna reacción clic, sólo tinción anti-RVFV) y las células infectadas simuladas (haga clic reacción sólo) para calibrar el instrumento. </li></ol> Noe: Asegúrese de seleccionar fluoróforos que pueden ser detectados por el instrumento. Como referencia, las siguientes son las líneas de láser y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de los datos mostrados en esta publicación. Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 495/519: Láser: 488 nm Filtrar: 530/30 Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 650/665: Láser: 640 nm Filtrar: 670/20

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No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo proporcionado describe un método para medir el efecto de la infección viral en la transcripción de la célula huésped a través de la incorporación de uridina análogo de la UE en el ARN nacientes. Este método tiene varias ventajas sobre los métodos anteriores: es rápido, sensible, y no se basa en el uso de isótopos radiactivos. Además, el método puede ser adaptado para producir los datos cualitativos a través de microscopía de fluorescencia o de datos cuantitativos a través de citometría de ...

<html> Tradicionalmente, la actividad transcripcional se ha medido mediante la incorporación de cualquiera radiactivo (3 H-uridina) 1 o halogenados (BRU) 2 nucleósidos en ARN nacientes. Estos análogos de uridina son absorbidos por las células, convertidos en uridina-trifosfato (UTP) a través de la vía de recuperación de nucleósido, y posteriormente incluidas en los ARN recientemente sintetizado. 3 H-uridina pueden ser detectados por autorradiografía, que puede llevar mucho tiempo, o de centelleo contando, que requiere un equipo especializado. Por otra parte, el uso de isótopos radiactivos puede no ser práctico en una serie de entornos de laboratorio, incluidos los laboratorios de alta contención de seguridad de la biotecnología. BrU se puede detectar a través de inmunotinción con anticuerpos anti-Bru, que pueden requerir la permeabilización áspera para garantizar el acceso del anticuerpo al núcleo o desnaturalización parcial de ARN, como la estructura secundaria del ARN podría ser un impedimento estérico para la unión de anticuerpos. _content &quot;&gt; El protocolo descrito aquí utiliza el Click recientemente desarrollado clic química 3 para medir la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12. química se basa en un cobre altamente selectiva y eficiente (I) catalizada por reacción de cicloadición entre un alquino y un resto azida 4,5. En este protocolo, ARN naciente en las células infectadas se etiqueta primero a través de la incorporación de uridina análogo de la UE. En un segundo paso, que se incorpora a la UE se detecta a través de la reacción con una azida fluorescente. Las principales ventajas de este método son (1) que no requiere el uso de isótopos radiactivos y (2) que no requiere la permeabilización dura o desnaturalización del ARN. Con un peso molecular de menos de 50 Da, el acceso de la azida fluorescente no esté impedido por el insuficiente estructura secundaria permeabilización o ARN. Además, los investigadores no están limitados en su elección de anticuerpos primarios cuando la combinación de la detección de ARN con una claseinmunotinción ical para las proteínas virales. Dos diferentes métodos se describen en este protocolo: uno para la visualización de la transcripción a través de microscopía de fluorescencia (pasos 1-4), y uno para la cuantificación de la transcripción a través de citometría de flujo (pasos 5-8). Ambos de estos métodos cosechadora etiquetado de ARN naciente con una inmunotinción intracelular de proteínas virales, lo que permite una correlación entre la actividad transcripcional y la infección viral en una base de celda por celda. Los autores han utilizado con éxito el protocolo que se describe aquí para determinar la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12 6, las células infectadas con diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, y las células infectadas con el virus Toscana (TOSV) 10. El protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para el uso con diferentes virus y tiene el potencial de ser modificado para incluir la tinción de inmunofluorescencia de las proteínas virales o celulares específicas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-uridine</td>
			<td>Berry &amp; Associates</td>
			<td>PY 7563</td>
			<td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-mm round coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D (ActD)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9415</td>
			<td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8027</td>
			<td>dissolve in H2O for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>dissolve in H2O for 5 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10270</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>dissolve in H2O for 500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper filter</td>
			<td>VWRbrand</td>
			<td>28333-087</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine (MW &ge; 70000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. Olympus IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

Muchos virus de ARN han desarrollado la capacidad para inhibir la transcripción célula huésped como un medio para eludir las defensas celulares. Para el estudio de estos virus, por lo tanto, es importante disponer de una manera rápida y fiable de medición de la actividad transcripcional en las células infectadas. Tradicionalmente, la transcripción se ha medido ya sea por la incorporación de nucleósidos radiactivos tales como 3H-uridina seguido por la detección mediante autorradiografía o recuento de centelleo, o la incorporación de análogos halogenados tales como uridina 5-bromouridina (BRU) seguido de la detección a través de inmunotinción. El uso de isótopos radiactivos, sin embargo, requiere un equipo especializado y no es factible en una serie de entornos de laboratorio, mientras que la detección de BrU puede ser engorroso y puede sufrir de baja sensibilidad. La química clic desarrollado recientemente, que consiste en una formación de triazol catalizada por cobre de una azida y un alquino, ahora proporciona un rápido y highly alternativa sensible a estos dos métodos. Haga clic en la química es un proceso de dos pasos en el que el ARN nacientes se etiqueta por primera incorporación de la uridina análogo 5-etiniluridina (UE), seguido por la detección de la etiqueta con una azida fluorescente. Estos azidas están disponibles como varios fluoróforos diferentes, lo que permite una amplia gama de opciones para la visualización. Este protocolo describe un método para medir la supresión transcripcional en células infectadas con el virus de la fiebre de Rift Valley (RVFV) cepa MP-12 usando química clic. Al mismo tiempo, la expresión de proteínas víricas en estas células se determina por inmunotinción intracelular clásica. Los pasos 1 a 4 detalle un método para visualizar la represión transcripcional a través de microscopía de fluorescencia, mientras que los pasos del 5 al 8 de detalle un método para cuantificar la represión transcripcional mediante citometría de flujo. Este protocolo es fácilmente adaptable para su uso con otros virus.

La proteína NE de RVFV (familia Bunyaviridae, género Phlebovirus) 11 inhibe la transcripción en general célula huésped a través de dos mecanismos distintos: (i) por secuestrante de la subunidad p44 del factor de transcripción basal TFIIH 11 y (ii) mediante la promoción de la degradación proteasomal de la p62 subunidad de TFIIH 6. El MP-12 cepa de la vacuna 13 RVFV se ha utilizado para los experimentos descritos en este protocolo desde el MP-12 cepa s...

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Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Este método describe el uso de la química clic para medir los cambios en la transcripción de la célula huésped después de la infección con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12. Los resultados se pueden visualizar a través de microscopía de fluorescencia cualitativamente o cuantitativamente obtenerse a través de citometría de flujo. Este método es adaptable para su uso con otros virus.

Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K vistas.  University of Texas Medical Branch. Este método describe el uso de la química clic para medir los cambios en la transcripción de la célula huésped después de la infección con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12. Los resultados se pueden visualizar a través de microscopía de fluorescencia cualitativamente o cuantitativamente obtenerse a través de citometría de flujo. Este método es adaptable para su uso con otros virus.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

El aislamiento de las variantes de los virus de ARN de fidelidad y caracterización de la frecuencia de mutación de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

La separación de una sola hebra de ADN, el ADN de doble cadena y el ARN de una comunidad ambiental viral mediante cromatografía de hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

El efecto sinérgico de la luz visible y gentamicina en<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Microorganismos

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...