作品は、NIHの助成金AI57159（SCH）およびAI72346（AMvOまで）によってサポートされていました。 SCHは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者です。

ガラスカバースリップの機能化融合アッセイで使用される平面二重層は、デキストランの水和フィルムでサポートされています。デキストランは、平面二重層とガラス面との間のスペーサーとして機能します。これにより、ガラス表面に付着し、また、ウイルス粒子の内容が融合によって逃げることができるのでスペースを提供するになるから膜成分を防ぎます。ガラス製カバースリップは、ガラス（Elender、 ら、1996）に化学的に結合デキストランに私たちを可能にするシランエポキシ、治療によって官能化される。 <ol><li>セラミック染色ラック25mmのカバーグラスを配置し、jarファイルまたはビーカーにラックを配置。 </li><li>実験室グレードのガラス製品の洗浄剤の10％溶液と容器を埋める。 30分間超音波洗浄器に容器を置きます。 </li><li>脱イオン水と容器とカバーグラスのラックをすすぎ、および1M postassium水酸化補充。別の30分間入浴の超音波処理するコンテナを返します。 </li><li>アセトンとエタノールを使用してこの洗浄手順を繰り返します。 </li><li>水と乾燥でcoverlipsをすすぐ。 </li><li>最後に、3分間の酸素プラズマのストリッパーとカバーグラスを清掃してください。 </li><li>最後の洗浄ステップは、以下のシリル化のステップでガラスが均一に親水性と反応性作り、表面を酸化させる。 </li><li>イソプロパノールで3 -グリシドキシプロピルシランの0.2％溶液を調製します。 5分間この溶液中でカバーグラスを浸し。 </li><li>シラン液を捨て、イソプロパノールでカバーガラスを数回すすいでください。 </li><li>カバースリップは、現在シランの層でコーティングされていますが、ガラスへの共有結合にシランできるように硬化されている必要があります。 1時間80℃に設定したオーブン中でカバーグラスを置きます。 </li><li>カバーガラスが硬化している間、デキストラン500を計り、30％w / v溶液を準備。水を予熱すると溶解する際に役立ちます。我々は、カバースリップあたりこの溶液約1mlを使用します。デキストランが溶解した後、真空デシケーター内の溶液を泡を取り除く。 </li><li>シラン化カバースリップは、硬化が終了したら、セラミックラックから取り出して、プラスチック製の冷凍ボックスの内側に、それらは平らなアレンジ。デキストラン溶液の約1 mlを各カバーの上面をカバーするために1 mlのピ​​ペットを使用してください。フリーザーボックスを閉じ、24〜36時間のための静かな場所におきます。 </li><li>プラスチックピンセットでカバーグラスをつかんで、余分なデキストランを取り除き、セラミックラックにそれらを交換してください。水の中でカバーガラスを数回すすぎ、およびカバースリップは48時間水に浸漬することができます。瓶を静かにテーブルトップのローテーターで攪拌されることがあります。 </li><li> 80度摂氏と真空デシケーターのストアに設定したオーブン中でカバーグラスを乾燥させる。 </li></ol>リポソーム調製サポートされている脂質二重層は、デキストラン、官能カバースリップにリポソームを吸着することによって形成される。吸着リポソームは、表面上に平坦な膜が破裂し、スプレッドまで、お互いに融合する。 <ol><li>アッセイで使用される一般的なリポソーム製剤は、1,2 - 、ジオレオイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（DOPC）、1 -オレオイル-2 -パルミトイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（POPC）、コレステロール、ウシ脳から構成されています4:4:2:0.1:5 × 10 -5の比で1,2 - dihexadecanoyl - sn -グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン- Disialoganglioside（GD 1A）、およびN -（（biotinoyl）アミノ）ヘキサノイル（6）。すべてのコンポーネントは、クロロホルムまたはクロロホルムとメタノールのソリューションに格納されています。 </li><li>ガラスの試験管に各成分の量を転送することにより、脂質二マイクロモルを含む液を調製する。アルゴンまたは窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させる。 2時間真空デシケーター中で試験管を残すことによって、残りの溶剤を削除します。 </li><li> HNEのバッファ400マイクロリットル（5 mMのHEPES、145 mMのNaCl、0.1mMのEDTA）で乾燥脂質フィルムを再懸濁します。 </li><li>プラスチック製のマイクロ遠心チューブに懸濁液を移す。温水浴における液体窒素浴と融解の懸濁液を凍結する。この凍結/融解サイクルを4回繰り返します。 </li><li> 100nmのポリカーボネートメンブレンフィルターと脂質の押出機を組み立て、そして脂質の懸濁液を25回押し出します。サスペンションは、押出後さらに透明にする表示されます。 </li><li>リポソームは、彼らが準備されている日に使用する必要があります。使用されるまで、それらは室温で保存することができます。 </li></ol>マイクロ流体フローセルの準備シンプルなマイクロフローセルは、石英のスライドと、官能カバーガラスの間にダブルスティックテープを挟むことにより行われます。 <ol><li> 20x20x3ミリメートル石英スライドを入手。反対側にある2つ1ミリメートルの穴をドリルダイヤモンドバリを使用してください。 </li><li>ダブルスティックテープのシートから20mm角をカットし、カミソリの刃を使用して、中心から15 × 2 mmのセクションを切り取る。 </li><li>テープバッキングの片側をはがし、およびクォートするためにテープを付着zのスライド。官能化されたカバースリップに反対側に付着する。 </li><li>ポリエチレンチューブの2本の20 cmの長さをカットし、石英スライドの穴に挿入してください。 </li><li> 5分エポキシ接着剤でフローセルを密封する。 </li><li>バッファを持つ接着剤が硬化した、プライムフローセルとチューブ。 </li><li>サポートされている脂質二重層は、チャネルにリポソーム懸濁液の約80マイクロリットルを描画することで、この段階で形成することができる。 </li></ol>ウイルス粒子のラベリング<ol><li> H3N2インフルエンザAは、（X - 31）一般的に融合アッセイに使用されますが、他のインフルエンザ株と他のウイルスが正常に使用されている。 </li><li>ウイルスはhemifusionと細孔形成の検出を可能にするために二つの異なる蛍光色素にしてまでラベルが付いています。 </li><li> 20mMのソリューションを作成するHNEバッファにスルホローダミンB（SRB）を溶かす。ウイルス懸濁液10マイクロリットルで色素溶液の20マイクロリットルを組み合わせ、20時間室温でおきます。この期間中に、色素は徐々にウイルス粒子内に蓄積されます。 </li><li> PD - 10脱塩カラムを介してウイルス懸濁液を渡すことによって、余分な染料を外します。十分なウイルス材料が使用されている場合は、着色されたバンドは、列で見ることができます。このバンドは、ラベル付けされたウイルスが含まれており、それが溶出されるように収集することができる。 </li><li>ないバンドが表示されない場合は、200マイクロリットルのフラクションを収集し、分画は分光光度計で565 nmの吸収を測定することにより、ラベルの付いたウイルスが含まれているかを判定する。ウイルスは、約0.8 mlの全体積に溶出してください。 </li><li> SRBというラベルのウイルス懸濁液にオクタデシルローダミン110（Rh110C18）の2 mMのジメチルホルムアミド（DMF）溶液を13マイクロリットルを添加することによりウイルスのエンベロープにラベルを付けます。 </li><li>実験室のローテータにチューブを接続することによってサスペンションをかき混ぜると、3時間放置する。 </li><li>前に説明したように、PD - 10脱塩カラムを用いて過剰Rh110C18からウイルスを精製する。 </li></ol>顕微鏡の構成実験は、全内部反射蛍光顕微鏡に適した高NA油浸対物レンズを装備した蛍光顕微鏡上で実行されます。アルゴン/クリプトンガスレーザーから488と568 nmのラインはRh110C18とSRBというラベルの付いたウイルスを励起するために使用されます。各ラベルの同時イメージングは​​、分割するダイクロイックミラーと、緑色と赤色の蛍光発光することで実現し、独立して電子乗じてCCDカメラの別の半分に画像を注力しています。 アッセイを行う塗装、ラベルの付いたウイルス粒子のドッキング、フルオレセインとの表面、および低pH緩衝液（図1A）との反応の開始を平面脂質二重膜の組立：融合アッセイの実行は、フローセル内の生化学的成分の段階的な組み立てを含む。 <ol><li>顕微鏡のステージにフローセルをマウントし、毎分40マイクロリットルの速度で流れるように設定されたシリンジポンプにアウトレットチューブを取り付けます。 </li><li> HNEの300マイクロリットルで流すことにより過剰なリポソームの流路をクリアします。 </li><li>顕微鏡の焦点と488nmの光と568 nmの光の70 W / cm 2の350 W / cm 2の表面を照らすためにレーザーパワーを調整する。あなたが1.45 NA 60倍油浸対物レンズを使用している場合は、それぞれ、100マイクロワットと20マイクロワットにレーザー強度を設定します。 </li><li>フローセルに標識ウイルスを（1 / 100に希釈）ポンプ。ウイルスは、流路の底部表面に拡散するように、粒子が脂質二重層に組み込まれているガングリオシドに固執して開始されます。 </li><li>ドッキングウイルス粒子の適切な密度（最大視野あたり約1000粒子に）達成されたとき。ミリリットルフルオレセイン標識されたストレプトアビジン当たり2マイクログラムを含む溶液にインレットチューブを切り替えます。標識ストレプトアビジンは、二重層に結合脂質分子をビオチンには結合され、最終的に薄暗い緑の背景が表示されます。 </li><li> HNEの300マイクロリットルと流路を洗浄してください。 </li><li> 、撮像領域を選択し、顕微鏡を集中し、時間経過した画像取得用CCDカメラを準備。 100ミリ秒に露光時間を設定し、10 Hzのレートでフレームを収集する。 </li><li> 10mMのクエン酸ナトリウムと140mMのNaClを含有する酸性緩衝液中で流れることによって融合を開始。バッファーのpHは、アッセイされるウイルスの臨界pH以下になるように調整されるべきである。 X - 31のpHでヒューズは、5.5の下にあります。 </li></ol>代表的な結果図1Bは、融合の実行前と実行中二重層ドッキングビリオンのスナップショットを示しています。それぞれの回折限界のスポットは、個々のウイルス粒子を表しています。赤色と緑色の蛍光が別々にウイルスエンベロープとコンテンツラベルの同時観測が可能、CCDカメラの上半分と下半分上に結像されています。に比べて緑チャネルの2倍の多くのスポットが一般的にあります。赤、そしてこれは、封筒のラベルに比べてコンテンツの色素でラベリングの効率が低下を反映している。フルオレセインを結合した​​表面から放射される緑色のバックグラウンドの蛍光はクエン酸緩衝液の到着時に消滅し、核融合反応の開始時刻の決定を可能にする。 Hemifusionイベントはhemifusionの茎間のウイルスのエンベロープ拡散で急冷Rh110C18として緑色蛍光のバーストとして検出され、平面膜で希釈される。外に広げ蛍光雲が平面膜における脂肪酸-アシルリンクされている染料の自由拡散を示す、hemifused粒子の周りに見ることができます。細孔の形成は、ウイルス粒子の内部に閉じ込められたSRBからの赤色蛍光の減衰として観測される。融合細孔の開口部は色素が観察領域の平面脂質二重層と外下記の水性空間に脱出することができます。 各粒子の蛍光強度の軌跡は、hemifusionと細孔形成の収率と時間（図1C）の決定を容易に、個々の粒子の積分強度からプロット。 Hemifusionと孔形成イベントの時間は、Rh110C18蛍光バーストまたはSRBの信号の減衰の最大傾斜が発生する点として決定される。成功した実験では、Rh110C18降伏dequenching信号、およびSRBというラベルの粒子の30％で標識された粒子の約50％が使用可能なシグナルを与える。両方の色素で標識された粒子のうち、約10％は両方の脂質混合し、孔形成のシグナルを示しています。 図。 2A - Cは、典型的な実験からhemifusionと孔形成の遅れ時間の分布を示しています。 Fig.2D - Fは、同じ条件で5つの実験から結合イベントのイベントの分布を示しています。観測の控えめな数があっても、ヒストグラムの形状は明らかである。各実験はpHの低下の時間を検出することによって同期されるため、複数の実験を組み合わせることができ、中間のステップをレート制限に関する詳細な情報を得ることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="図1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="図1" /> 図1実験デザイン。 A）ウイルス粒子がhemifusionと融合孔形成の動態を監視するには、2つの蛍光色素で標識されています。蛍光は高NA顕微鏡対物によって収集され、CCD上に結像される。前（左）と中B）蛍光画像（右）個々のウイルス粒子の融合。各画像の上部と下半分は、サポートされている二重層の同約50 x 100 mmの2領域の、それぞれ、赤色と緑色蛍光に対応しています。 C）赤SRBバイラルコンテンツのトレーサーの蛍光強度（上側のトレース）、緑Rh110C18膜色素（真ん中のトレース）、およびフルオレセインのpHセンサは、（下のトレース）pHの低下、hemifusion、そして融合の間に経過した正確な時間を提供しています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="図2" /> 図2。蛍光標識ウイルスの融合動力学。 pHの低下とhemifusion（A、D）と細孔形成（B、E）の間の経過時間の分布。ディストリビューションの立ち上がりと減衰では、複数の中間ステップの存在を示している。 hemifusionと個々の粒子の融合細孔の開口部間の遷移は、指数関数的に単一の律速段階を示唆し、配布されています。パネルA〜Cは、単一の実験の結果を示す。パネルのDFは、同じ条件で実行5つの別々の実験からコンパイルされます。してください<a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

流体と連続的なサポートされている脂質二分子膜の調製が困難な場合があります。材料や表面欠陥を汚染の微量の脂質二重層の拡散防止します。デキストランの均一な層を慎重に洗浄し、堆積が不可欠です。 ウイルス粒子の長時間のイメージングは​​、漂白剤蛍光ラベルをまたはそれらを不活化になることがあります。この種の光損傷はよくバイオイメージングおよ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

膜融合は、細胞内へのエンベロープウイルスの入力時に必須の工程である。従来の核融合アッセイは、通常、それは難しい関係する分子の手順のシーケンスを定量的に分析すること、核融合の多数のイベントを報告する。我々は本質的に流体のサポート上のターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融着の速度を監視するためin vitroで、2色の蛍光アッセイを開発した。 インフルエンザウイルス粒子が細胞膜とウイルスの内部を染色する赤親水性の蛍光物質を染色する緑色の脂溶性蛍光体とインキュベートされています。我々は、フローセルのデキストラン- functionilizedガラスの表面にガングリオシドを含む脂質二重膜を堆積、CCD上の粒子の数百を含む、平面二重層と画像100 × 100μmの2領域の蛍光でウイルス粒子をインキュベートカメラ。イメージングの両方赤と緑の蛍光によって、我々は、同時に膜の色素（緑）と粒子の水性内容（赤）の動作を監視することができます。 融合のpH下の値にpHを下げる際に、粒子は、膜と融合するだろう。 Hemifusionは、標的膜の外葉とウイルス膜の外葉の融合、粒子の緑色蛍光の急激な変化として表示されます。残り2つの遠位リーフレットのその後の融合時に細孔が形成され、ウイルス粒子の赤色発光蛍光体は、標的膜の下にリリースされる予定です。このイベントは、個々の粒子の赤色蛍光の減少を生じさせるだろう。最後に、標的膜に埋め込まれているpH感受性蛍光体からの統合された蛍光はpHの低下の正確な時間を報告します。 three蛍光時のトレースから、すべての重要なイベント（pHの低下、孔形成時に混合hemifusion、コンテンツに応じて混合脂質）は、現在直接的な方法で、個々にすべての粒子について、抽出することができます。ヒストグラムの多くの個々の粒子のための様々な遷移のために経過時間を収集することにより、我々は、対応する中間体の寿命を決定することができます。直接蛍光観察を持っていなくても隠された中間体は、これらのヒストグラムから直接可視化することができます。

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

我々は存在する<em&gt; in vitroで、</em&gt; 2つの色の液体ターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融合を可視化する蛍光アッセイ。差ウイルス膜とその内部を染色する蛍光団でウイルス粒子を標識することにより、我々はhemifusionと細孔形成の動態を監視することができます。

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K ビュー.  Harvard Medical School. 我々は存在する in vitroで、 2つの色の液体ターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融合を可視化する蛍光アッセイ。差ウイルス膜とその内部を染色する蛍光団でウイルス粒子を標識することにより、我々はhemifusionと細孔形成の動態を監視することができます。

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Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

生物学

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

シンプルで効果的な管理と腎臓の注入を使用する小型魚の循環システムの微粒子の可視化

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...