Los autores desean agradecer a Nancy Downer y todos los miembros del laboratorio de Química Analítica de la Universidad de Roma &quot;Tor Vergata&quot; por su colaboración y apoyo logístico. Este trabajo fue apoyado por el proyecto de la UE &quot;BioCop&quot;.

1) El bloqueo de perlas magnéticas recubiertas con: Proceder de la siguiente manera para bloquear perlas magnéticas recubiertas con: <ol><li> Preparar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf; </li><li> Homogeneizar (temblores, pero no agitación) de perlas magnéticas recubiertas (véase el apéndice para la preparación de perlas magnéticas recubiertas) con la muestra de rotación del mezclador; </li><li> Inmediatamente después de la homogeneización, pipeta de 10 l de perlas magnéticas recubiertas por separado en cada uno de los tubos Eppendorf; </li><li> Añadir 1 ml de leche desnatada solución de bloqueo en cada tubo Eppendorf de la serie; </li><li> Vamos a perlas magnéticas se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en el mezclador de rotación de la muestra; </li><li> Retire la solución de bloqueo: para ello se coloca el tubo en el concentrador de partículas magnéticas con la parte magnética para poner en 2 minutos (ver partículas magnéticas se pegue en la pared lateral del tubo); pipeta cuidadosamente el sobrenadante, dejando cuentas sin perturbaciones; </li><li> Añadir 1 ml de tampón PBS + NaN3 + BSA como solución de almacenamiento para cada tubo; </li><li> Tienda recubierto y bloquearon las bolas magnéticas a 4 ° C (por favor, tenga en cuenta que de perlas magnéticas recubiertas son estables durante al menos 2 meses a 4 ° C); </li></ol> 2) la cadena inmunológica en partículas magnéticas para la construcción de la curva de calibración y análisis de las muestras Proceder de la siguiente manera para que las bolas magnéticas listo para la medición: <ol><li> Tome un tubo de Eppendorf (2 ml) de solución de cubierta y bloqueada por cada extracto de muestra que se va a analizar; </li><li> Tomar un extra de tubo de Eppendorf para cada solución calibrador de trabajo; </li><li> Homogeneizar las bolas magnéticas durante 2 minutos en el mezclador de rotación de la muestra antes de su uso; </li><li> Retire el líquido de almacenamiento mediante concentrador de partículas magnéticas; </li><li> Lávese las partículas magnéticas tres veces con solución de lavado PBS / BSA. Eliminar líquido de lavado; </li><li> Paso la competencia: Añadir a cada tubo que contiene las cuentas de lavado magnético, 200μl de la muestra de extracto preparado, el uso de un tubo de cuentas magnéticas para cada muestra. Repita el mismo procedimiento para cada solución estándar. Añadir 200 l de solución de anticuerpos monoclonales para cada tubo de cuentas magnéticas. Vamos a perlas magnéticas se incuba durante una media hora en el mezclador de rotación de la muestra a temperatura ambiente; </li><li> Eliminar de los tubos Eppendorf la solución utilizada para la competición a paso; </li><li> Etiquetado paso: Añadir 400μl del anticuerpo secundario marcado a cada tubo de bolas magnéticas Eppendorf. Vamos a perlas magnéticas se incuba durante una media hora en el mezclador de rotación de la muestra a temperatura ambiente; </li><li> Quitar el etiquetado de los tubos Eppendorf solución; </li><li> Lávese las partículas magnéticas tres veces con PBS / Tween ® 20 solución de lavado. Eliminar el líquido; </li><li> Resuspender con 100μl de buffer DEA cada alícuota de partículas magnéticas. Ahora las bolas magnéticas están listos para la etapa de medición electroquímica; </li></ol> 3) El conjunto de PalmSens con el multiplexor (MUX) opciones Tenga en cuenta: el producto enzimático de hidrólisis del sustrato faltas la superficie del electrodo, por este motivo un nuevo electrodo que se necesita para cada medición. <ol><li> Conectar un PC portátil a PalmSens a través del cable de serie; </li><li> Conecte el conector de 9-DIN de CH8 multiplexor con PalmSens. </li><li> Conecte el cable de serie de ocho canales Mux contacto eléctrico con CH8 multiplexor; </li><li> Coloque la tira de electrodos en el bloque de imán ocho. Preste atención para que cada imán debajo de cada electrodo de trabajo (de la nota, la necesidad de un solo imán para cada electrodo es imprescindible lo contrario, la partícula magnética no se concentrará en el área del electrodo de trabajo); </li><li> Conecte la tira de electrodos en ocho canales de contacto eléctrico Mux; </li></ol> Para la medición de la DPV utilizar los siguientes parámetros en las casillas correspondientes: E comenzar: 0 (V); final E: 0,6 (V); paso E: 0.016 (V); E pulso: 0,0339 (V); E acondicionado: 0 (V), deposición de E: 0 (V); Velocidad de lectura : 0,1 (V / s); T pulso: 0,06 (s); acondicionado T: 0 (s), deposición de T: 0 (s) de equilibrio T: 8 (s). 4) una reacción enzimática y medición electroquímica <ol><li> Homogeneizar agitando suavemente cada tubo Eppendorf que contiene partículas magnéticas listo para la etapa de medición electroquímica con el fin de obtener una suspensión y dispersión de partículas magnéticas; </li><li> Pipeta de cada Eppendorf, inmediatamente después de la homogeneización, una alícuota de 20 l de la dispersión con bolas magnéticas en la superficie del electrodo de trabajo correspondiente. Para cada electrodo del uso de una franja de 20 l de bolas magnéticas tomadas de diferentes tubos Eppendorf (por ejemplo, para el uso de electrodos ocho ocho diferentes Eppendorf); </li><li> Añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el primer electrodo. Inicio 2 minutos la cuenta regresiva. Después de 14 segundos, añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el segundo electrodo. Después de otros 14 segundos, añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el thiº de los electrodos. Proceder, en el mismo intervalo de tiempo (14 segundos) hasta que el último electrodo (que significa: agacharse cada alícuota de sustrato, con intervalos de 14 segundos). El intervalo de tiempo de 14 segundos se calcula como el tiempo requerido por el potenciostato para realizar la medición de la nota, la solución de 80 l de cada sensor debe cubrir el electrodo de trabajo, referencia y contra. Además, las soluciones para cada sensor no debe entrar en contacto con las soluciones de los electrodos de vecinos. </li><li> Después del minuto 2 la cuenta regresiva de la primera adición de la solución de sustrato enzimático, iniciar la medición electroquímica; </li><li> Utilice el PalmSens Lite para obtener picos de corriente (mA) para cada solución. </li></ol> 5) Cálculo Establecer una curva de calibración utilizando una ecuación logística cuatro parámetros para calcular la concentración de la cantidad total de toxina HT-2/T-2 en nanogramos por mililitro para cada tubo Eppendorf que contiene la muestra desconocida. Los datos experimentales, la altura del pico (mA) en contra de la concentración de los calibradores (ng / ml), debe estar equipado con un no-lineal de cuatro parámetros logísticos (4-PL) trama ecuación (1) (con Sigma Plot 8.0 o KaleidaGraph). La no-lineal 4-PL modelo se adopta generalmente para describir los ensayos de unión ligando (LBA) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="La ecuación 1" /> (1) a, b, x0, y0 son los parámetros de logística dada por el programa Sigma Plot ajuste de la curva. Use la fórmula explicada para calcular el contenido de HT-2/T-2 cantidad total de toxina en la solución de extracto de la muestra diluida <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="La ecuación 2" /> (2) x es la concentración en masa de la cantidad total de HT-2/T-2 toxinas en la solución del extracto diluido, calculado a partir de la ecuación logística cuatro parámetros en nanogramos por milliltre (ng / ml) y es el valor actual en mA obtenidos para la muestra desconocida Apéndice 6) de perlas magnéticas recubiertas Proceder de la siguiente manera para tener perlas magnéticas recubiertas con: <ol><li class="none"> Procedimiento de lavado </li></ol><ol><li> Homogeneizar tosylactivated Dynabeads ® M-280 (solución madre 2 x 109 cuentas / ml) por agitación y agitación (velocidad máxima) durante 1 min (evitar la formación de espuma) (tenga en cuenta la concentración de partículas magnéticas debe ser siempre la misma para asegurar la reproducibilidad de la medición); </li><li> Inmediatamente pipeta de 1 ml de homogeneizado por encima de las cuentas en un tubo de 2 ml Eppendorf; </li><li> Colocar el tubo en el concentrador de partículas magnéticas con la parte magnética para poner en 2 minutos (ver partículas magnéticas se pegue en la pared lateral del tubo); </li><li> Pipeta cuidadosamente el sobrenadante, dejando inalteradas cuentas; </li><li> Retire el tubo de Eppendorf del concentrador de partículas magnéticas y volver a suspender las bolas en 1 ml de 0,1 M pH 9,5 borato. Mezclar suavemente durante 2 minutos en el mezclador de rotación de la muestra durante 2 minutos; </li><li> Pipeta el sobrenadante; </li><li> Pipeta de 1 ml de solución tampón de borato en el tubo Eppendorf. Partículas magnéticas están listos para el paso de revestimiento; Proceso de emulsionado </li><li> Añadir 600 ml de HT-2 conjugado con KLH solución stock (hemocianina de lapa californiana) a 1 ml de partículas magnéticas) (final HT-2-KLH concentración de 375 mg / ml); incubar perlas magnéticas y la solución HT-2-KLH para 20h a 37 ° C * con una rotación lenta de inclinación en la rotación de mezclador de la muestra; </li><li> Después de colocar el tubo de incubación en el concentrador de partículas magnéticas y la pipeta el sobrenadante; Lávese las bolas recubiertas dos veces con 1 ml de solución tampón PBS / BSA. Entre cada lavado eliminar PBS / BSA solución. Todos los pasos de lavado se realizaron entorno perlas magnéticas y PBS / BSA en un mezclador rotatorio durante 5 minutos; </li><li> Lávese las bolas magnéticas, una vez utilizando 1 ml de solución tampón TRIS / BSA. Quitar TRIS / solución de BSA. Llevar a cabo este paso mediante el establecimiento de perlas magnéticas y tampón Tris / BSA en la rotación de mezclador de 4 horas a 37 ° C *; </li><li> Lávese las bolas magnéticas con 1 ml de una vez refrescado (conservarse en la nevera a 4 ° C) de PBS / BSA solución buffer. Quitar PBS / BSA solución. Llevar a cabo este paso, establecer las bolas magnéticas y el tampón PBS / BSA en la rotación de mezclador durante 5 minutos a temperatura ambiente; </li><li> Después de la etapa de lavado eliminar todo el líquido de lavado y añadir 1 ml de tampón PBS + NaN3 + BSA como de almacenamiento de líquidos; </li><li> Tienda de perlas magnéticas recubiertas a 4 ° C (por favor, tenga en cuenta que de perlas magnéticas recubiertas son estables durante al menos 2 meses a 4 ° C); * Para este fin, el mezclador se coloca en el horno equipado con un agujero que permite la inserción de los cables de la fuente de alimentación. Como alternativa, el mezclador puede ser colocado en una habitación con termostato a 37 ° C. </li></ol> 7) Preparación de la muestra y la extracción 25 g demuestra finamente molida (el bebé los cereales del desayuno o la comida) se pesan en un vaso de la licuadora y se extrajo con 100 ml de solución de acetonitrilo / agua (86/14) durante 3 minutos en una batidora de alta velocidad. Después de la centrifugación a 4000 rpm (3000 g) durante 5 minutos, 8 ml de sobrenadante se tomaron y se purifica con la columna Mycosep, 4 ml de extracto de limpieza se secaron bajo corriente de nitrógeno. Las muestras secas se pueden guardar a -30 ° C hasta varios meses. 8) la reconstitución de muestra Cereales para el desayuno Reconstituir el extracto seco de cereales de desayuno (comida a base de cereales destinados al consumo para adultos) con 40 ml de PBS pH 7,4. De esta manera, una muestra con una concentración de la toxina igual que el límite legal supone (200 ng / g) se dan en la etapa de medición de una señal cae en el medio del rango de trabajo. Comida para bebés Reconstituir el bebé extracto seco de alimentos (comida a base de cereales destinados al consumo infantil) con 4 ml de PBS. De esta manera, una muestra con una concentración de toxinas igual que el límite legal supone (20-25 ng / g) se dan en la etapa de medición de una señal cae en el medio del rango de trabajo.

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

El uso de anticuerpos como la sonda de reconocimiento biomolecular ha visto un uso generalizado de tecnologías de detección, métodos inmunoquímicos de detección, tales como ELISA y Meias, son, hoy en día, entre las plataformas más utilizadas y aplicadas en muchos laboratorios de 7. Si bien estos enfoques lograr una sensibilidad y especificidad, el objetivo principal de muchos grupos de investigación en los últimos años ha sido la mejora y optimización de sus actuaciones...

Reactivos <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Cloruro de potasio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Dihidrógeno fosfato de potasio </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato disódico de hidrógeno </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 anhidro </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil]-aminometano </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albúmina de suero bovino) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfato disódico sal </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de leche desnatada bloquear - leche en polvo no grasa </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 conjugado con KLH (hemocianina de lapa californiana), solución de reserva (1 mg / ml en PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> El conjugado HT-2-KLH se obtuvo por el CDI-método en el que la libre circulación de grupos OH en la posición 3 y 4 de la toxina HT-2 fueron activados por N, N&#39;-carbonildiimidazol (CDI) y la activa HT-2 toxina vamos a reaccionar con aminogroups de la proteína (KLH) para generar un vínculo carbammate estable. </td></tr><tr><td> Anticuerpo secundario marcado: Anti-ratón IgG (H + L) de caballo, conjugado con fosfatasa alcalina, la concentración de 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 toxina </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Partículas magnéticas: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentración de 2 x 10 9 bolas / ml. </td></tr></table> Soluciones <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Preparación </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4 </td><td> Disolver 0,20 g de cloruro de potasio, 0,20 g de dihidrógeno fosfato de potasio, 1,16 g de fosfato disódico de hidrógeno y 8,00 g de cloruro de sodio en 900 ml de agua </td><td></td></tr><tr><td> Dietanolamina de amortiguamiento, la DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Disolver 0.0476g de MgCl2 anhidro y 7.3.59 g de KCl en ~ 300 ml de agua. Vez disueltos, añadir 51 ml de la DEA (99,5%). Ajustar el pH a 9.8 con HCl (6 M). Diluir hasta 500 ml con agua. </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de borato, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Disolver 3,09 g de H 3 BO 3 en ~ 300 ml de agua destilada, ajustar el pH a 9.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir hasta 500 ml con agua destilada. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Disolver 3,85 g de Tris [hidroximetil]-aminometano en 100 ml de agua. Ajustar el pH a 8.5 con NaOH y / o HCl (6 M o menor concentración). Diluir a 200 ml con agua. </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TRIS + BSA solución (0,1%), pH 8,4 </td><td> Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de TRIS buffer de pH 8,4. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Tampón PBS + Tween ® 0,05% </td><td> Disolver 0,250 g de Tween 20 en 500 ml del preparado previamente buffer PBS, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón PBS + BSA solución al 0,1% </td><td> Disolver 0,050 g de BSA en 50 ml de PBS, pH 7,3. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Tampón PBS + BSA 0,1% + 0,02% NaN3 </td><td> Disolver 0,050 g de BSA y 0.010 de NaN 3 en 50 ml de tampón PBS, pH 7,3. </td><td> Almacenamiento de sollución </td></tr><tr><td> Sustrato enzimático </td><td> Disolver 0,010 g de sal 1-naftil fosfato de sodio en 100 ml de buffer de pH 9,8 DEA. Envolver el matraz herméticamente en papel de aluminio. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> Solución de leche desnatada bloqueo </td><td> Añadir 0,20 g de secante bloqueador de grado de leche sin grasa seca (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) a 200 ml de tampón PBS pH 7,3. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 de la solución madre </td><td> Disolver 10 mg de tricotecenos vial de toxina HT-2, en 10 ml de acetonitrilo para dar una solución con una concentración de 1 mg / ml. </td><td> Dividir esta solución en un solo uso alícuotas de 30 ml y guárdelos a menos de -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 la solución de trabajo estándar </td><td> Colocar 20 ml de HT-2 toxina solución de reserva en una de 2 ml calibrada matraz aforado y diluir con acetonitrilo para obtener una solución HT-2 de trabajo que contiene 10 mg / ml de toxina tricotecenos. </td><td> Esta solución debe prepararse en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 Trabajo soluciones calibrante </td><td> Diluir el HT-2 solución patrón de trabajo (10 mg / ml) para preparar una solución de trabajo calibrante 100 ng / ml. Diluir HT-2 Solución de trabajo de calibrante 100 ng / ml para preparar soluciones de trabajo calibrador de las siguientes concentraciones 0 (blanco), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Estas soluciones deben estar recién en el día de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 conjugado con KLH </td><td> Dividir HT-2 conjugado con KLH solución stock (hemocianina de lapa californiana) (1 mg / ml en PBS) en un solo uso alícuotas de 350 microlitros. </td><td> Alícuotas de almacenar a -30 ° C. </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal específico </td><td> Diluir 1:350 (v: v) la concentración de acciones (1,383 mg / ml) del anticuerpo monoclonal en PBS para el uso en el paso la competencia </td><td> Esta solución debe prepararse en el momento de su uso. 10 ml de solución de anticuerpos en PBS para obtener un volumen de 3,5 ml, son suficientes para analizar las 17 normas y / o muestras. </td></tr><tr><td> Secundaria de anticuerpos etiquetados </td><td> Anti-ratón IgG (H + L) conjugado con fosfatasa alcalina se diluye 1:100 (v: v) en PBS a utilizar en el paso de la competencia. </td><td> Una solución de 100 l de valores de anticuerpos en PBS para obtener un volumen final de 10 ml, son suficientes para analizar las normas 25 y / o muestras. Esta solución debe prepararse en el momento de su uso. </td></tr></table> Aparato <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Concentrador de partículas magnéticas: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens instrumento </td><td> PalmSens </td><td> Siempre con PalmSens Lite, el cable de serie de conexión PC portátil y el software de las opciones de Mux </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens multiplexor </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Ocho canales de contacto eléctrico Mux </td><td> hecho a mano </td><td></td></tr><tr><td> Tira con ocho electrodos serigrafiados (EFE) </td><td> hecho a mano </td><td></td></tr><tr><td> Apoyo especialmente diseñado para bandas de electrodos </td><td> hecho a mano </td><td> Incluye 8 imanes de neodimio de cada uno de ellos se coloca debajo de la superficie de cada electrodo de trabajo de la SPE </td></tr><tr><td> Calibrar pipetas microlitro </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Agitador magnético y barras de agitación. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vasos de vidrio (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matraces aforados (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 y 2 ml tubos Eppendorf. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ tubos de 5 ml y 15 ml. </td><td> Halcón </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio de Vortex Mixer </td><td></td><td> No utilice vórtex para resuspender perlas magnéticas recubiertas con HT2-KLH o vinculados con la cadena inmunológica para evitar la desnaturalización de las partes proteicas </td></tr><tr><td> Horno de laboratorio o una sala con termostato </td><td></td><td> Elegir un horno capaz de mantener una temperatura de 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Inmunoensayos son una alternativa válida a la que consumen más caro y HPLC cuantitativa o GC 1, 2 métodos de cribado para la detección de micotoxinas peligrosas en los productos alimenticios. En este protocolo se muestra cómo fabricar e interrogar a una enzima vinculada ensayo electroquímicos competitivos inmunomagnética basado en el uso de partículas magnéticas como soporte sólido para la cadena de inmunoquímica 3 y electrodos serigrafiados como la detección de la plataforma. Nuestro método tiene como objetivo determinar la cantidad total de HT-2 y las toxinas T-2, las micotoxinas que pertenecen a la familia de los tricotecenos y de gran preocupación para la salud humana 4. El uso de un anticuerpo clon con una reactividad cruzada del 100% para HT-2 y T-2 permite detectar simultáneamente dos toxinas con una sensibilidad similar 5. El primer paso de nuestro análisis es la etapa de recubrimiento en el que inmovilizar HT2-KLH conjugado toxina en la superficie de partículas magnéticas. Después de una etapa de bloqueo, necesario para evitar absorciones no específicas, la adición de un anticuerpo monoclonal permite la competencia entre los inmovilizados HT-2 y libres presentes HT-2 o T-2 en la muestra o en una solución estándar. Al final de la etapa de la competencia, la cantidad de anticuerpo monoclonal ligado a la inmovilización HT-2 será inversamente proporcional a la cantidad de toxina en la solución de la muestra. Un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina (AP) se utiliza para mostrar la unión entre el anticuerpo específico y el inmovilizado HT-2. La etapa de medición final se realiza dejando caer una parte alícuota de la suspensión de cuentas magnéticas, correspondientes a una muestra específica / solución estándar, en la superficie de un electrodo serigrafiado de trabajo, partículas magnéticas se inmovilizan y se concentraron por medio de un imán colocado precisamente bajo el serigrafiado de los electrodos. Después de dos minutos de incubación entre partículas magnéticas y un sustrato de la AP, el producto enzimático es detectado por voltametría de pulso diferencial (DPV), utilizando un equipo portátil (PalmSens) también es capaz de iniciar automáticamente ocho mediciones en un intervalo de pocos segundos.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

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ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K vistas.  University of Rome, Tor Vergata. Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

La detección de ubiquitinación de proteínas

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Investigación

Biología

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.