Este trabajo fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0846453).

1. Fabricación de los maestros de silicio estándar con SU-8 fotolitografía 1 (no se muestra en este video). <ol><li> El uso estándar de SU-8 métodos de fotolitografía para crear un SU-8 &quot;maestro&quot; (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) para la fabricación del molde PDMS que contiene la red de microfluidos y cámara de quimiotaxis. Moldes como maestro se pueden fabricar en cualquier centro de microfabricación (por ejemplo, Stanford microfluídica de fundición; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Antes de la replicación PDMS, exponer el SU-8 amo a fluorosilane vapor en un desecador conectado a una fuente de vacío para facilitar la liberación fácil de PDMS del maestro. Añadir una gota de fluorosilane a una toalla de papel y aplicar vacío durante un minuto. Retire el vacío y dejar 30 minutos para la deposición de fluorosilane. Mantenga el SU-8 maestro en un recipiente cerrado para su uso futuro. </li></ol> 2. Moldeo réplica de PDMS de SU-8 master: La capa de fluido y la capa de control son realizadas por moldeo réplica de PDMS de SU-8 maestro. <ol><li> Mezclar el PDMS pre-polímero y la cruz enlazador en un peso de 10:01. relación y desgasificar en un desecador durante 1 hora (o hasta que las burbujas de aire de la mezcla de PDMS). </li><li> Coloque el SU-8 maestro en una placa de Petri y con cuidado vierta la mezcla de PDMS en la parte superior de la SU-8 amo hasta el grosor deseado. </li><li> Calentar la cápsula de Petri que contiene el PDMS y el SU-8 molde maestro a 80 ° C durante dos horas para curar el PDMS. </li><li> Quite la cubierta de curado PDMS SU-8 maestros de la placa y la cáscara del molde PDMS de la SU-8 maestro. La estructura deseada se integrará en el molde de PDMS. </li><li> Haga agujeros en el molde de PDMS para la tubería del generador de gradiente y la entrada de la celda con un calibre 20 de extremo romo de la aguja. </li></ol> 3. La vinculación de los dispositivos de PDMS: <ol><li> Limpiar un portaobjetos de vidrio con isopropanol y se seca con nitrógeno o una corriente de aire. </li><li> Exponer el PDMS y portaobjetos de vidrio de plasma de oxígeno en un incinerador de plasma. </li><li> Lleva el molde de PDMS en contacto con la lámina de vidrio. El calor de la diapositiva en contacto con el moho y PDMS a 65 ° C durante 15 min. </li></ol> 4. Montaje del dispositivo de PDMS <ol><li> Usando una hoja de afeitar, cortar los tubos en un ángulo de 45 ° a la longitud correcta requerida para el dispositivo. </li><li> Inserte un extremo del tubo en los agujeros perforados en el dispositivo (por ejemplo, de salida) el uso de fórceps. </li><li> Con unas pinzas, inserte un objeto contundente de calibre 30 aguja en el otro extremo de la tubería. </li><li> Repita el paso 4.2 para todos los hoyos restantes. </li><li> Recoger 1 ml de buffer de la quimiotaxis (CB) en una jeringa de 3 ml, teniendo cuidado de eliminar las burbujas de aire de la jeringa. </li><li> Fijar una base de la aguja en un extremo de la tubería de salida. </li><li> Añadir CB a la base de la aguja, y toque en el pabellón de la aguja para eliminar cualquier burbuja de aire. </li><li> Empujar un poco más de CB de la punta de la jeringa y conectar la jeringa 3 ml a la base de la aguja sin atrapamiento de aire. </li><li> Push CB a través del dispositivo hasta que todos los centros de aguja restantes se rellenan con con el CB. Esto debería eliminar la mayoría de las burbujas de aire. </li><li> Llenar dos jeringas con 500μL CB contienen las concentraciones adecuadas de la chemoeffector se está probando. Eliminar la formación de burbujas de aire, empujando un pequeño descenso del contenido de la jeringa y tocar la gota del líquido en la base de la aguja y colocar. </li><li> Del mismo modo, conectar una jeringa que contiene CB a la entrada de bacterias. Esto se quitará cuando las bacterias se introducen en el dispositivo. </li></ol> 5. Crecimiento de la gran movilidad E. coli <ol><li> Crecer cultivos de una noche de E. coli RP437 con una expresión de plásmido GFP en 20 ml de caldo de triptona (TB) a 32 ° C con agitación. Añadir las concentraciones adecuadas de antibióticos para mantener el plásmido. En nuestro protocolo, se utiliza un plásmido pCM182 bajos copia para la detección de las bacterias sobre la base de la fluorescencia en el dispositivo. Para E. coli, cultivos en crecimiento a 32 ° C se recomienda para la movilidad de alta, como la movilidad es menor a temperaturas más altas. </li><li> Utilice el cultivo de una noche para inocular un cultivo de 20 ml de la tuberculosis en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a una densidad óptica a 600 nm de ~ 0,05. Mantener el cultivo con agitación a 32 ° C. </li><li> Recoger las células en un 600 OD de 0.35 ~ 0.45 por centrifugación a baja velocidad a 400 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender las células a un OD 600 de ~ 0,35 en CB contiene el chemoeffector en la concentración prevista en el medio del canal. </li><li> Añadir RFP marcado con las células muertas con un diámetro exterior de 600 ~ 0,35 a las células que expresan GFP-vivir. Los muertos (rojo), las células se utilizan como un control interno para garantizar que cualquier migración no es debido a los efectos de flujo. </li></ol> 6. Quimiotaxis de vigilancia <ol><li> Eliminar algunos de los CB de la aguja de entrada de la celdacentro. Rellenar con la suspensión celular. </li><li> Llenar la jeringa con suavidad 50μL con las células resuspendidas. Este paso se debe hacer lentamente a medida que los flagelos puede ser cortado y reduce la motilidad. </li><li> Conecte la jeringa 50μL a la entrada del centro con aguja como se describe en el paso pasos 4.10. </li><li> Colocar el dispositivo en el escenario de un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la adquisición de imágenes. Las jeringas de entrada (tanto en el gradiente de 500 jeringas de l y la jeringa de 50 células l) en la bomba de jeringa e iniciar el flujo de tal manera que el gradiente se forma de las células y circula por la tubería. </li><li> Una vez que las células entran en la cámara de quimiotaxis, espere aproximadamente 20 minutos para que el sistema se estabilice antes de la imagen. </li><li> Recoger verde (en vivo) y rojo (muertos) imágenes de fluorescencia en diferentes lugares a lo largo de la longitud de la cámara (que corresponden a diferentes tiempos de exposición). Típicamente, recopilamos 100 imágenes en cada lugar en intervalos de 3 segundos. </li></ol> 7. Análisis de datos: Los siguientes pasos se pueden realizar utilizando cualquier programa de análisis de imagen disponibles en el mercado (por ejemplo, ImageJ, Metamorph) o el uso de códigos simples en Matlab. <ol><li> Eliminar los píxeles de fondo en la imagen (es decir, la intensidad de establecer el umbral de píxeles y eliminar todos los píxeles que tienen menos intensidad que el umbral). Esto minimiza el ruido en el análisis. </li><li> Use la posición de las células muertas (fluorescencia roja) para determinar el centro de la imagen. Dado que las células muertas no muestran quimiotaxis, lo que representa la posición en células entraron en la cámara de quimiotaxis y se detecta en la ausencia de migración. </li><li> Localizar las células vivas (fluorescencia verde) en la imagen. </li><li> Dividir la imagen en canales y determinar el número de células vivas en cada canal. En nuestro trabajo previo 3, la cámara de 1.050 m de ancho quimiotaxis se divide en 64 canales que son cada uno a 16 micras de ancho. </li><li> Repita los pasos 7,1 7,3 para todas las imágenes y la suma total de células para cada canal a través de todas las imágenes. Esto le da al número total de células detectadas en cada canal durante la duración del experimento. </li><li> Calcular el coeficiente de partición quimiotaxis (CPC), que representa la dirección de la migración, de la siguiente manera: Cada celda ubicada en la alta concentración (derecha) y baja concentración (izquierda) partes de las células muertas se le asigna un multiplicador de 1 y -1 , respectivamente. Es decir, una célula que migra hacia un gradiente se multiplica por 1, mientras que las células en movimiento a favor del gradiente se multiplican por -1. Todos los valores multiplicados se suman y se normalizaron con el número total de células detectadas. Por ejemplo, un valor de CPC de 0,40 indica que el 40% más del total de bacterias se trasladó a la parte alta concentración de la parte baja concentración (es decir, el chemoeffector es un atractivo a medida que más se detectaron bacterias subiendo la pendiente). </li><li> Calcular el coeficiente de migración quimiotaxis (CMC), que pesa la migración de las células por la distancia recorrida, de la siguiente manera: Peso contar las células en cada canal por un factor que es proporcional a la distancia que las células migran. Una célula que se mueve hasta el más alejado de la alta concentración de la posición (canal 64) se da un factor de ponderación de 1, mientras que uno que se mueve a medio camino en el lado de mayor concentración se da un factor de ponderación de 0,5, y una célula de trasladarse a la más lejana baja concentración posición ponderada por -1. Resumiendo todos los recuentos de células ponderada y normalizar el número de células para generar el CMC. </li></ol> Los resultados representativos 3,4: Hemos utilizado el dispositivo de microfluidos (Figura 1) se describe aquí para investigar la quimiotaxis de los E. coli en los gradientes de atrayentes (ácido aspártico, autoinductor-2) y repelentes (NiSO4, indol) 3,4. El prototipo de la quimiotaxis cepa 5 E. coli RP437 GFP expresión se utilizó, junto con la kanamicina mató E. coli TG1 células que expresan la proteína fluorescente de color rojo para vigilar los efectos de flujo. El gradiente de concentración formado en el dispositivo μFlow se muestra en la Figura 1B. La entrada de la celda era máximo, de forma que no hay flujo a través de ella y un gradiente estable de 0 a 100 ng / mL de fluoresscein se estableció en el dispositivo. La intensidad de los píxeles a través del dispositivo se utilizó para determinar el perfil de concentración de fluoresceína. Los datos muestran que las bacterias encuentran un gradiente lineal cuando entran en la cámara de quimiotaxis. Figura 2A y B muestra imágenes de fluorescencia de E. coli RP437 migrar en respuesta a gradientes de ácido aspártico (0 100 mM) y NiSO4 (0 225 M). Las respuestas observadas a estos atrayente y repelente canónicos son como se predijo. Figura 3A muestra la distribución cuantificada de E. coli RP437 en ausencia de un gradiente de concentración (es decir, la pendiente nula de ácido aspártico), mientras queFiguras 3B y C muestran la distribución de los gradientes de ácido aspártico y NiSO4. La especificidad de estas respuestas (es decir, el sesgo en la migración) es evidente, como E. coli cepa RP437 Δ tar (es decir, que carecen de la cepa quimiorreceptores alquitrán que se utiliza en E. coli para detectar el ácido aspártico y níquel), no demuestra la tendencia de la migración en la presencia de un gradiente de concentración de ácido aspártico o NiSO4. Las tendencias observadas en los perfiles de distribución espacial son también consistentes con los valores calculados CPC y CMC. Los valores de CPC para la migración de E. coli RP437 en los gradientes de ácido aspártico o NiSO4 son 0,33 y -0,33, respectivamente. Los correspondientes valores de CMC son 0,13 y -0,14, respectivamente. Por el contrario, la CPC y CMC valores con el E. RP437 Δ coli cepa de alquitrán en los gradientes de ácido aspártico o NiSO4 son insignificantes. Además, el CPC y CMC en un gradiente nulo de ácido aspártico son 0,03 y 0,02, respectivamente, e indican la ausencia de sesgos en la migración en la ausencia de un gradiente. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> Figura 1. Dispositivo esquemático y un gradiente de concentración. (A) Representación esquemática del dispositivo de la quimiotaxis de microfluidos. El dispositivo consta de un módulo de gradiente de mezcla (20 x 100 x 18 750 m) y un módulo de observación de la quimiotaxis (20 x 1050 x 11500 mm). El ancho de los dos canales gradiente entren en el dispositivo es de 500 micras y el ancho de la entrada de las bacterias es de 50 micras. El recuadro muestra un gradiente de moléculas de señalización (gris) y las bacterias que migran en respuesta a la misma. Bacterias vivas son representados como óvalos sólido, mientras que las bacterias muertas se muestran como óvalos abiertos. (B) un gradiente de concentración entre 0 y 100 ng / mL de fluoresceína fue generada en el dispositivo y utilizando imágenes de microscopía de fluorescencia. Imágenes de fluorescencia fueron adquiridas después de 30 minutos y se cuantificó mediante análisis de imágenes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Quimiotaxis de los E. coli RP437 en el dispositivo de microfluidos. E. coli RP437 fue expuesto a un gradiente de (A) 000 a 100 M de L-aspartato, o (B) 0-225 NiSO4 M en el dispositivo y la migración de bacterias vivas (verde) sobre la L-aspartato o fuera de níquel imágenes cada segundo 2,5 durante 30 minutos. Las bacterias muertas (rojo) sirvió como control para los efectos de flujo en el dispositivo. Las imágenes fueron cuantificados usando un in-house desarrollado análisis programa3. Los datos mostrados son pseudo-color imágenes de tres experimentos independientes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figura 3b" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figura 3c" /> Figura 3: Cuantificación de los perfiles de la migración a un atrayente y repelente canónica. Distribución espacial de la RP437 en el dispositivo de microfluidos en respuesta a (A) uniforme de 100 mM L-aspartato (es decir, sin gradiente), (B) un gradiente de 0 100 M de aspartato, y (C) un gradiente de 0 225 M de NiSO4 . La distribución de las células muertas se muestra como una línea continua, la distribución de células RP437 se muestra como una línea discontinua, y la distribución de células RP437 eda + Δ alquitrán se muestra como una línea de puntos. Los datos mostrados son en promedio de tres experimentos independientes.

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	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration.">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li><li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable,+Competing+Gradients.">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li><li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , (2009).</li><li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp;amp, M. a. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis.">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li></ol>

El coeficiente de partición de la quimiotaxis (CPC) y el coeficiente de migración de la quimiotaxis (CMC) se puede calcular como se describe en Mao et al 5. Si una célula se detecta en el lado de alta concentración, se le da un valor de 1, mientras que una célula detecta en la parte baja concentración se da un valor de -1. Los valores se suman y se dividen entre el número total de células para generar el CPC. El signo de la CPC (positivo o negativo) de la dirección de la migración (hacia o...

a microfluidic device for quantifying bacterial chemotaxis in stable concentration gradients

Quimiotaxis permite que las bacterias de acercarse a las fuentes de sustancias atrayentes o para evitar las fuentes de productos químicos repelentes. Las bacterias controlan constantemente la concentración de chemoeffectors específicos mediante la comparación de la concentración actual de la concentración detectada unos segundos antes. Esta comparación determina la dirección neta de movimiento. A pesar de múltiples gradientes, que compiten a menudo coexisten en la naturaleza, los enfoques convencionales para la investigación de la quimiotaxis bacteriana son óptimas para la cuantificación de la migración en respuesta a los gradientes de concentración de atrayentes y repelentes. Aquí se describe el desarrollo de un modelo de quimiotaxis de microfluidos para la presentación de los gradientes de concentración precisa y estable de chemoeffectors a las bacterias y cuantitativamente la investigación de su respuesta al gradiente aplicado. El dispositivo es muy versátil en el que los gradientes de concentración de cualquier concentración deseada absoluta y la fuerza del gradiente puede ser fácilmente generados por la mezcla difusiva. El dispositivo se demuestra mediante la respuesta de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 a los gradientes de los aminoácidos y iones de níquel.

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A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Este protocolo describe el desarrollo de un dispositivo de microfluidos para la investigación de la quimiotaxis bacteriana en los gradientes de concentración estable de chemoeffectors.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K vistas.  Texas A&M University. Este protocolo describe el desarrollo de un dispositivo de microfluidos para la investigación de la quimiotaxis bacteriana en los gradientes de concentración estable de chemoeffectors.

Video: A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Los estudios de quimiotaxis bacteriana utilizando microfluídica - Entrevista

Investigación

Biología

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparación de neuronas de rata E18 cortical de compartimentación en un dispositivo de microfluidos

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el VIH

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

La evaluación de la motilidad de células madre neurales uso de un gel de agarosa al dispositivo basado en microfluídica

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...