Este trabajo es apoyado por la Oficina del Estado de Nueva York de Ciencia, Tecnología e Investigación Académica (NYSTAR) (en la forma de un Centro de Tecnología Avanzada de subvención), y por las subvenciones del Centro de Nanobiotecnología (CNTS), un Programa Nacional de la STC Science Foundation bajo el Acuerdo No. ECS-9876771, y la Asociación de Tumores Cerebrales de América y el New York Academy of Medicine (JAB).

Procedimiento Diapositivas recubrimiento con fibronectina Antes de la reunión de los dispositivos de microfluidos, esterilizar a las diapositivas de cristal con la fibronectina. Escudo de las diapositivas en una biohood para mantener la esterilidad. Alinear un espaciador PDMS estéril a lo largo de los bordes de la diapositiva y marcar el lado que está hacia arriba, con un marcador permanente. Pipeta de 1 ml de 5 mg / ml de solución de fibronectina (Sigma) en el interior del espaciador de PDMS sobre la totalidad de la lámina de vidrio. Deje los portaobjetos en reposo durante una hora, luego se seca por completo con una pistola de N 2. Las diapositivas se pueden almacenar a 4 º C para posteriores experimentos. Montaje del dispositivo El protocolo de dispositivo conjunto está realizado en un biohood en condiciones estériles, mediante los siguientes procedimientos: <ol><li> Limpie el maestro de silicio con el patrón de microcanales que frotándolo hasta con el 70% de etanol y secado con el N 2 armas de fuego. Coloque un espaciador PDMS estéril de altura de 1 mm con pinza en torno a las funciones de ayuda del maestro. </li><li> Preparar el gel de agarosa utilizado en el dispositivo por un peso de 0,3 g de polvo de agarosa (Fisher Scientific) y 10 ml de CO 2-medios de comunicación independientes (Invitrogen) en un vaso de 50 ml. Revuelva la mezcla con una espátula y el calor en el microondas durante 20 segundos a potencia ALTA. Si los gránulos disueltos están presentes, calentar la mezcla durante 10 segundos y agitar la mezcla caliente para deshacerse de los gránulos restantes. Repita el proceso con un tiempo de calentamiento de 8 segundos, y luego 5 segundos. </li><li> Rápidamente verter la solución de agarosa en el patrón de silicio rodeado por el separador de PDMS y cubrir inmediatamente la mezcla de agarosa con un portaobjetos de vidrio estéril. Aplique una presión constante y suave a la diapositiva durante unos 2 minutos para asegurarse de que el gel de agarosa se a la misma altura constante de 1 mm como espaciador PDMS. </li><li> Después de los geles de agarosa, retire el gel de agarosa al patrón con el espaciador PDMS del maestro de silicio y la transferencia de un portaobjetos de vidrio recubiertas con fibronectina los microcanales en el gel de agarosa al frente de la diapositiva. Utilice una punta de la jeringa de calibre 16 para perforar agujeros en las regiones de reserva de los microcanales de los accesos de entrada y salida. Añadir 500 l de CO 2-medios de comunicación independientes en el gel de agarosa al patrón de la diapositiva para evitar la desecación de los microcanales. </li><li> Lavar el colector de acrílico utilizado en el dispositivo con el 70% de etanol y enjuague con agua DI. Alinee los orificios de la variedad, que los agujeros perforados en el gel de agarosa con los microcanales. A continuación, alinee el colector con el gel, el separador PDMS, y la caída de fibronectina con la estructura metálica del aparato. Coloque los tornillos en el dispositivo y apretar hasta el punto de resistencia con un destornillador. Esto se hace para asegurar que el dispositivo no está demasiado ajustado en la medida de la deformación de los microcanales de la agarosa. Apriete los tornillos en un orden hacia la derecha para asegurarse de que el gel en el interior del dispositivo no se mueva. Pruebe el dispositivo para detectar fugas y obstrucciones en los microcanales con una jeringa de 1 ml. La jeringa está equipado con tubos de Tygon con una punta de la pipeta de gel de carga en el extremo del tubo para inyectar CO 2-medios de comunicación independientes en los microcanales. Un micro se considera formado con éxito cuando los medios se observa que la única salida de la toma de la microcanal cuando los medios de comunicación se inyecta en la entrada correspondiente. Ahora, el dispositivo está listo para su uso. </li></ol> Preparar y sembrar las células en el dispositivo Cuando las células alcanzan el 70% (la densidad de células alrededor de 100.000 células / ml) de confluencia, que están preparados para ser cabeza de serie en el dispositivo. Sujeto a las células a dos DPBS (Invitrogen) lavadas. Añadir 200 l de tripsina-EDTA (Invitrogen) para separar las células. Transferencia de las células a un tubo de centrífuga de 15 ml que contienen 5 ml de los medios de comunicación M2 que contiene el suero para inactivar la tripsina. Centrifugó el medio de cultivo con las células a 1000 rpm durante 5 minutos. Aspiración el sobrenadante y resuspender el precipitado de células 5 ml de DPBS. Centrifugar las células DPBS nuevo en las mismas condiciones. Aspiración el sobrenadante de nuevo, y resuspender el precipitado de células en 500 l de CO 2-medios de comunicación independientes. Semilla de la suspensión resultante de células en el centro de microcanales del dispositivo a través de la gravedad impulsada por el flujo. Agregar la entrada y salida del centro de microcanal con 60 l de la suspensión celular y 20 l de CO 2-independiente medio, respectivamente. Observar el centro de microcanal con un microscopio de campo claro para buscar la adhesión celular. Las células generalmente se adhieren a los 10 minutos. Después las células se adhieren al fondo del canal, con una densidad adecuada, pipeted a cabo la suspensión de células que permanecen en la entrada y los medios de comunicación en la toma de corriente. Lugar 60 l de CO 2-medios de comunicación independientes, tanto de entrada y salida del canal central. Lugar PDMS cubre más de the entrada y salida del centro para minimizar la evaporación de los medios de comunicación desde el canal central. Imágenes de las células en el dispositivo Antes de la asamblea del dispositivo, pase el tubo peristáltico estéril a través de la estación meteorológica del microscopio (Olympus X81) y conectarse con la bomba peristáltica (Watson-Marlow 205U/CA). Ras PBS a través del tubo a una velocidad de 4 RPM. Después de que el montaje del dispositivo, preparar las concentraciones de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Sigma) en las soluciones de las emisiones de CO 2-medios de comunicación independientes en un 15 tubos de centrifugación ml. Vortex del FEAG soluciones durante 5 segundos y conectar con la tubería. Conectar los tubos marcados con las concentraciones de FCE correspondiente al dispositivo. Se tarda aproximadamente una hora para el FEAG para difundir a través del canal del canal y establecer un gradiente químico estable. Un software de imagen, Slidebook, se utiliza para tomar un conjunto de imágenes cada 10 minutos durante 5 horas en una carrera experimental. La etapa xy automático está programado de tal manera que dos sub-zonas (cada uno con un área de x400μm 400μm) del canal del mismo centro, y un total de tres canales centrales son expuestas en un momento dado. Las células en los canales de centro diferente (normalmente de 3 en una carrera) tiene diferentes concentraciones EGF, como está marcado en el tubo. Materiales y Equipo Líneas de células: las células se C17.2 NSCs derivados de la capa externa germinal del cerebelo de ratón postnatal 6, 7. Siguiendo esta línea celular, se han desarrollado otras dos líneas de células madre murinas utilizando el método de transfección retrovirus. Estas dos líneas de células establemente transfectadas son (1) wtEGFR - que la sobre-expresa el EGFR humano de tipo salvaje, y (2) ΔEGFR - que es un mutante constitutivamente activa EGFR. Para facilitar la detección, los retrovirus tienen una columna vertebral con el gen de interés seguida por un sitio interno de unión al ribosoma (IRES) y la proteína verde fluorescente (GFP). De cultivo celular: El ratón C17.2 NSCs y sus variantes fueron cultivadas en una placa de 6 pocillos en los medios de comunicación M2 (DMEM (Invitrogen) con fetal al 10% de suero bovino (SFB) (Invitrogen), el 5% de suero de caballo (HS) (Invitrogen ), y el 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen).) Las células se mantuvieron a 37 º C en el 80% de aire y 5% de CO 2. Microfluidos dispositivo: un colector de plástico, un separador de PDMS, y un marco de acero para sostener el dispositivo en su lugar. Imágenes Un microscopio invertido de fluorescencia (Olympus IX-81) se utiliza, en relación con una cámara CCD intensificada (Orca, Hamamatsu). El dispositivo de microfluidos está montado sobre un sistema automatizado de fase xyz, y el escenario está rodeado por una cámara ambiental que mantiene una temperatura de 37 º C. Hay por lo general los dispositivos de 3-4 en el mismo chip que será filmado en el mismo momento con el automatizado etapa xyz. Mantener el flujo de Una bomba peristáltica con 8 líneas paralelas (Watson-Marlow 205U/CA) automático se utiliza para mantener los flujos en todas las de la pileta y canales de origen. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="Figura 1" width="573" height="414" /> Fig. Una motilidad de tres cepas de NSC (padres, wtEGFR y EGFR D) en las concentraciones de diversos FEAG Todas las trayectorias se han tomado de seguimiento de una película de 5 horas (a excepción de wtEGF 100ng/ml, 4 horas), y fueron el origen de todas las pistas reposicionado en (0,0) para fines de comparación. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="Figura 2" width="576" height="546" /> Fig. 2 Correlación del nivel de expresión del EGFR y la motilidad (a) dos imágenes de NSCs wtEGF en la superficie de un canal de microfluidos con 100ng/ml FEAG. La imagen de la izquierda es una imagen fluorescente, y el derecho es una imagen transmitida de campo claro. La barra de escala es 100μm, y el Anchura del canal es de 400 micras. Las células se separan en dos poblaciones por la luminosidad de la GFP expresado. Las células en los círculos azules son más débiles, por lo tanto tienen menos nivel de expresión del EGFR, y las células en los círculos rojos son brigher, por lo tanto tienen mayor nivel de expresión del EGFR. (B) Las trayectorias de las células con el nivel de EGFR expresión de alta y baja. Estas trayectorias se han tomado de una cuatro horas de duración de cine.

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

Fig. 1 muestra las trayectorias de tres cepas Consejo de Seguridad Nacional, las células de los padres, la wtEGFR y ΔEGFR el (control). Cada conjunto de trayectorias se obtuvieron de una película de 5 horas de duración. Para las células de los padres, la motilidad celular alcanzó su punto máximo cuando la concentración de EGF se ~ 10ng/ml, porque las células wtEGFR, el pico de motilidad celular pasó a 100ng/ml o superior, para que las células ΔEGFR, la motilidad celular es independiente de la concentración de FCE como se espera...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

Si bien la tecnología de microfluidos está llegando a un nuevo nivel de madurez para los ensayos de macromoléculas, ensayos basados ​​en células están todavía en una etapa infantil 1. Esto se debe principalmente a la dificultad con la que se puede crear un microambiente celular compatible y estable con las técnicas convencionales de microfabricación y materiales. Estamos frente a este problema mediante la introducción de un material de microfabricación novela, un gel de agarosa, como material de base para el dispositivo de microfluidos. En gel de agarosa es muy maleable y permeable a los gases y los nutrientes necesarios para la supervivencia celular, y por lo tanto un material ideal para ensayos basados ​​en células. Hemos demostrado anteriormente que los dispositivos de gel de agarosa base han tenido éxito en el estudio de la migración celular de las bacterias y los neutrófilos 2. En este informe, tres canales de microfluidos en paralelo se modelan en una membrana de gel de agarosa de alrededor de 1 mm de espesor. Flujos constantes con los medios de comunicación / buffer se mantienen en los dos canales laterales mediante una bomba peristáltica. Las células se mantienen en el canal central para la observación. Dado que los nutrientes y productos químicos en los canales laterales están en constante difusión de un lado para el canal central, el ambiente químico del canal central se controla fácilmente a través del flujo a lo largo de los canales laterales. El uso de este dispositivo, se demuestra que el movimiento de las células madre neurales se puede controlar ópticamente con facilidad en condiciones químicas diferentes, y los resultados experimentales demuestran que la sobreexpresión de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mejora la motilidad de las células madre neurales. Motilidad de las células madre neurales es un importante biomarcador para evaluar la agresividad de las células, por lo tanto el factor tumorigénico 3. Descifrar el mecanismo subyacente de la motilidad del Consejo de Seguridad Nacional dará conocimiento de los trastornos del desarrollo neuronal y en la invasión del cerebro células madre del cáncer.

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Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Nos demuestran que la sobreexpresión de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mejora la motilidad de las células madre neurales (NSC) utilizando un nuevo gel de agarosa de microfluidos dispositivo basado. Esta tecnología puede ser fácilmente adaptable a otros sistemas de células de mamíferos, donde las fuentes de células son escasos, como las células madre neurales, y la vuelta el tiempo es crítico.

La evaluación de la motilidad de células madre neurales uso de un gel de agarosa al dispositivo basado en microfluídica

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.6K vistas.  Cornell University. Nos demuestran que la sobreexpresión de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mejora la motilidad de las células madre neurales (NSC) utilizando un nuevo gel de agarosa de microfluidos dispositivo basado. Esta tecnología puede ser fácilmente adaptable a otros sistemas de células de mamíferos, donde las fuentes de células son escasos, como las células madre neurales, y la vuelta el tiempo es crítico.

Video: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

Cultura de ratón con células madre neurales Precursores

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Investigación

Biología

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Conteo de células madre neurales humanas

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparación de neuronas de rata E18 cortical de compartimentación en un dispositivo de microfluidos

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

No plasmáticos de unión de PDMS para la Fabricación de bajo costo de los dispositivos de microfluidos

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Ratón epidérmico de la cresta neural de células madre (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...