Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. Movimiento de investigación trastornos en el laboratorio ha sido apoyado por la distonía Bachmann-Strauss y la Fundación Parkinson, Reino Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Asociación de la Enfermedad de Parkinson de Alabama, la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson, y una investigación de pregrado.

Plásmido de expresión de construcción Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables. Experimental plásmido <ol><li> Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, por ejemplo, un nervio o músculo promotor específico. Si se va a expresar múltiples genes dentro del mismo tejido, un cassette promotor plásmido en el sistema de puerta de enlace (Invitrogen) se puede utilizar. Este enfoque permite la inserción de un gen de interés aguas abajo del promotor de 4 clonación de recombinación. En general, 2-5 kb de secuencias de aguas arriba es suficiente para tener una expresión correcta y exacta. </li><li> El cDNA del gen de interés puede ser clonado en dos formas: <ol><li> Clonación convencional con enzimas de restricción. </li><li> Para la clonación de puerta de enlace, que es amplificada por PCR utilizando los cebadores que contienen la puerta de enlace att secuencia B de recombinación. El cDNA amplificado se recombinan en la primera pDONR201 vector de donantes para crear el vector de entrada y luego se transformó en E. coli cepa DH5a. Después de la selección de recombinantes éxito y mini-prep aislamiento de ADN, el vector de entrada se recombina en el vector destino promotor que contiene para crear el plásmido de expresión. Detalles sobre la clonación de recombinación están disponibles, ya sea el manual de Invitrogen Gateway o en Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marcador seleccionable plásmido Ejemplos de plásmidos marcador transgénicos incluyen rol-6 o el uso del promotor de la pared muscular del cuerpo unc-54 para dirigir la expresión de proteínas fluorescentes. Estos plásmidos marcadores suelen estar disponibles dentro de la comunidad de investigación bajo pedido. Microinyección de C. elegans Preparación <ol><li> Realizar el aislamiento del ADN de los dos plásmidos que se van a inyectar. Cuantificar ellos y se mezclan en una proporción de 1:1 de 50 ng / l cada uno. </li><li> Preparar pastillas de agar: <ol><li> Haga una solución al 2% de agarosa en el agua, el calor o en el microondas hasta que se disuelva. </li><li> Establecido varios 22 x 50 mm cubreobjetos en una mesa de trabajo. </li><li> Con una pipeta Pasteur, se coloca una gota de la agarosa derretida en una cubierta de vidrio y colocar inmediatamente una tapa de vidrio segundo a través de la caída en un ángulo de 90 a la primera. Repita este procedimiento para varios vasos de las demás. El diámetro del disco aplanado de agarosa debe estar entre 15-20 mm. </li><li> Después de la agarosa se ha solidificado (esto sólo se tarda un minuto), retire la tapa de vidrio y deje que el cojín de aire seco por completo (varias horas o toda la noche). </li><li> Tienda de las pastillas en una caja cubierta de vidrio a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Hacer cargadores aguja para solución de ADN: Cargadores de aguja son creados a partir de 100 tubos capilares l que se calientan en el centro sobre una llama abierta y rápidamente sacó a sus aproximadamente el doble de longitud. Las dos mitades se rompió además una vez que el tubo capilar se enfría. 10-20 arsenal cargadores de aguja para la inyección. Guárdelo en posición vertical en un bastidor de tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no atravesar a sí mismo en los puntos. </li><li> Hacen que las agujas de microinyección: La aguja está hecho de un tubo especial capilar que contiene un filamento de vidrio interior, este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Estos se extraen en una máquina de aguja-tirador. Utilizamos un Narishige PP-830 extractor con un ajuste de calor de 24,8. Varias agujas se tiran a la vez y se almacenan en una pequeña caja de plástico. Agujas múltiples pueden ser fácilmente &quot;montado&quot; en una tira de plastilina para almacenamiento a largo plazo. </li><li> Punta de la aguja &quot;interruptores&quot;: La punta de la aguja de microinyección se tira tan bien que en realidad es cerrado a fin, y debe ser rota abierta con pequeños fragmentos de cristal de la cubierta. Estos son preparados por el ajuste de un 18 x 18 mm cubierta de cristal en una toalla de papel y ejerciendo una suave presión hasta que se rompe en varios pedazos. Fragmentos de un tamaño útil es de aproximadamente 3 x 4 mm. </li><li> Crecen de forma silvestre tipo (N2) los gusanos a la etapa adulta temprana para la inyección mediante procedimientos estándar de 6. Preparar adecuadamente organizado cerca de 100 gusanos / construir inyectado. </li></ol> Procedimiento <ol><li> Abra la válvula principal en un tanque de helio que está conectado a un brazo de la aguja de microinyección y el soporte. Cierre la válvula de regulación para permitir que el gas para entrar en la línea, con lo que la presión a 35 psi. Tenga en cuenta que el gas puede ser liberado mediante un pedal. </li><li> Inserte un cargador de aguja en un tubo de la boca pipeteador estándar (que se encuentran en envases de tubos capilares) y la elaboración de una pequeña cantidad de la mezcla de plásmidos (~ 1 l). </li><li> El cargador de la aguja se coloca cuidadosamente en el extremo posterior de una aguja de inyección y se inserta suavemente todo el camino a través de la longitud dela aguja hasta que sienta resistencia. Expulsar a la solución de ADN por soplando suavemente, a continuación, retire el cargador. </li><li> Insertar la aguja en el brazo de la microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la junta de goma interno pequeño. </li><li> Coloque un trozo de aguja rotura de cristal de la cubierta en un borde de una plataforma de agar. Cubrir el fragmento, así como toda la superficie de la almohadilla de agar, con aceite de halocarbonos. Coloque la almohadilla de agar en el escenario de un microscopio invertido. </li><li> Posición de la aguja en el centro del campo de visión con el objetivo de 4X y la iluminación de campo claro, pero aún no se baja en el aceite. Además, la posición del borde interior de la astilla de cristal de la cubierta en el centro, a continuación, centrarse en él (aún con el objetivo 4X). Bajar la aguja en el aceite, con lo que en el mismo plano focal que el trozo de cubierta de vidrio. Levante la ampliación por el cambio con el objetivo de 40X. Centrarse en el borde del casco y la posición de la punta de la aguja, si es necesario. </li><li> La apertura de la punta de la aguja de inyección, suavemente empujar la aguja en el borde de la tapa de vidrio fragmento, mientras que al mismo tiempo la aplicación de un pulso corto de gas a través del pedal. La aguja se rompe lo suficientemente abierta cuando pequeñas gotas de líquido escapar del extremo de la aguja. Exceso de flujo de líquido debido a una abertura muy grande no es deseable, ya que matar a los animales. </li><li> Retire la almohadilla de agar a partir de la etapa de aumento de la aguja hacia arriba, pero no cambiar la posición de X o Y-eje. Deslice la etapa de debajo de la aguja, retire la almohadilla agar y colocarlo en un microscopio de disección. La transferencia de un gusano en la almohadilla, debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce, frotar suavemente hasta que haga contacto con la almohadilla de agar. El gusano húmedos deben adherirse a los secos de agarosa. </li><li> Inyección <ol><li> Coloque rápidamente la parte de atrás pad agar en el escenario, centrando el gusano en el campo de visión. </li><li> Baje la aguja en el mismo plano de enfoque como el gusano. </li><li> Cambie el filtro de Hoffman Iluminación (un tipo de filtro de contraste). Esto permite que los detalles morfológicos del gusano a ser visible. Si Nomarski / DIC óptica están disponibles en el ámbito invertida que funciona tan bien. Utilizando el objetivo 40X, se centran en el &quot;grano&quot; centro sincitial de las gónadas del gusano, por debajo del &quot;nido de abeja&quot;, patrón de los núcleos germinales (elegir la gónada se coloca en el lado de la lombriz frente a la aguja). </li><li> Afinar la posición de la aguja hasta que la punta está también en el foco (el mismo plano que la gónada &quot;grano&quot;). </li><li> Suavemente inserte la aguja en el centro de la gónada y aplicar un breve pulso de la presión del gas para expulsar a una gota o dos de ADN en el brazo de las gónadas. Usted debe observar una ola de expansión de líquido a través de la gónada distal. No asuma más líquido es mejor, ya que un exceso de líquido puede fluir en la curva proximal del brazo de las gónadas, lo que puede detener la producción de ovocitos. Si es posible, dependiendo de la posición del gusano, se inyecta el brazo gonadal otros de la misma manera. </li><li> Es importante trabajar con rapidez, mientras que la inyección de un gusano, ya que puede secarse. La decisión de inyectar el brazo gonadal segundo depende de la rapidez con que puede volver a la posición de la aguja y el gusano. Todo el proceso lo ideal sería que en menos de 1-2 minutos. </li></ol></li><li> Quite la cubierta de vidrio desde el escenario y colóquelo en una microscopio de disección. Aplicar 1μl de buffer M9 (22 mm de KH 2 PO 4, 42 mm de Na 2 HPO 4, 85 mm de NaCl, 1 mM MgSO 4) directamente sobre el gusano inyecta (esto podría implicar sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de halocarbonos). El tampón debe rehidratar el gusano, sino que se va a flotar fuera de la superficie de la placa de agarosa. La transferencia de la lombriz en un plato normal con un pico del gusano. La almohadilla de agarosa puede ser reutilizado varias veces más hasta que se ha convertido en demasiado saturado con tampón y los gusanos ya no se adhieren. </li></ol> Selección de transgénicos <ol><li> Gusanos se inyecta, la generación P 0, se transfieren a platos individuales fresco, sin semillas con bacterias (60 mm) y les permite reproducirse. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen. </li><li> La F 1 se observa la evidencia del marcador de transgénicos (como la fluorescencia), utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Cada portador fluorescentes, F 1, los animales clonados por separado en un plato nuevo (ya que la descendencia de cada F 1 se considera una línea distinta). La F 1 hermafroditas se les permite reproducirse. De nuevo, esto se realiza normalmente en menos de 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen. </li><li> La generación F 2 se observa en los animales transgénicos así. F 2 animales que han heredado y expresan la variedad transgénica se consideran &quot;estable&quot; de línea. NOTA: En la F 1 deedad, puede haber muchos animales transgénicos, pero no son estables. La mayoría de los animales transgénicos F 1 no se propagarán en F 2 líneas estables. NOTA: Para el control de la variabilidad en el número de copias del gen, generar un mínimo de tres líneas independientes estables por la construcción de inyección. </li><li> Cada línea estable independiente debe mantenerse como una línea separada de los gusanos. Cada línea se puede propagar mediante la transferencia de varios animales transgénicos para una nueva placa en cada generación, lo que debe llevarse a cabo utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente si el marcador de selección es fluorescente. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar lo siguiente: - Inyectar directamente en el centro de la gónada - No inyectar demasiado líquido - Trabajar con rapidez para evitar la desecación. Si llegas a tener problemas con la aguja, como se rompe demasiado grande, lo mejor es rehacer una aguja nueva, en lugar de tratar de inyectar con una aguja de menos de ideal. La generación de gusanos transgénicos tiene muchas aplicaciones, tales como: - La identificación de genes mutantes...

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon Oil, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>100 ul Capillary</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary for Needles</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Tool</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>microINJECTOR System</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Scope, Stage, Manipulator</td></tr><tr><td>Dissecting, with Fluorescence</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

Transgénicos Caenorhabditis elegans pueden ser fácilmente creados a través de la microinyección de una solución de ADN plásmido en la gónada 1. El ADN del plásmido se reorganiza para formar concatamers extracromosómico que son heredados de forma estable, aunque no con la misma eficacia que los cromosomas actual 2. Un gen de interés es co-inyectados con un marcador fenotípico obvias, tales como rol-6 o las buenas prácticas agrarias, para permitir la selección de animales transgénicos con un microscopio de disección. El gen exógeno se puede expresar a partir de su promotor nativo para los estudios de localización celular. Por otra parte, el transgén puede ser impulsado por un promotor de diferentes tejidos específicos para evaluar la función del producto del gen en esa célula o tejido en particular. Esta técnica de manera eficiente las unidades de la expresión génica en todos los tejidos de C. elegans, excepto para el embrión o principios de la línea germinal 3. La creación de animales transgénicos es ampliamente utilizado para una variedad de paradigmas experimentales. Este video muestra el procedimiento de microinyección para generar gusanos transgénicos. Además, la selección y mantenimiento de líneas transgénicas estables C. elegans se describe.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.9K vistas.  University of Alabama. Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Video: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Investigación

Genética

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Biología del Desarrollo

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Biología

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioingeniería

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

Generación de transgénicos y knockouts en especies de Strongyloides por microinyección

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Inmunología e Infección

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Resumen

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Capítulos en este video

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Generación de transgénicos y knockouts en especies de Strongyloides por microinyección

El cultivo