Una vez que se obtienen alrededor de 25 millones de células donantes de mitocondrias en el día siete, cosecha las células cultivadas exponencialmente en un tubo de 50 mililitros y recógelas centrifugando a temperatura ambiente y 520 g durante cinco minutos. Lave las células con solución salina tamponada con fosfato frío y sedimente por centrifugación a temperatura ambiente en 520 g durante cinco minutos. Ahora en adelante, realice toda la extracción mitocondrial a cuatro grados centígrados utilizando reactivos fríos y mantenga las células o mitocondrias en hielo.
Después de la tercera centrifugación, desechar el sobrenadante por aspiración utilizando una pipeta de vidrio acoplada a una bomba de vacío y resuspender las células empaquetadas en un volumen de tampón hipotónico igual a siete veces el volumen del pellet celular. Luego transfiera la suspensión celular a un tubo homogeneizador y deje que las células se hinchen incubándolas en hielo durante dos minutos. Rompa las membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes en el homogeneizador acoplado a un mortero accionado por motor que gira a 600 rotaciones por minuto.
En el homogeneizado celular, agregue el tampón hipotónico igual a siete veces el volumen del pellet inicial para generar un ambiente isotónico. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mililitros y centrifugarlo en un rotor fijo a 1, 000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego recolecte solo 3/4 del sobrenadante, dejando un gran margen del pellet para evitar la contaminación con núcleos o células intactas y transfiéralo a otro tubo.
Después de repetir el proceso dos veces, transfiera el sobrenadante que contiene la fracción mitocondrial en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a la velocidad máxima de 18, 000 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lave el pellet enriquecido con mitocondrias con tampón A.Combine el contenido de los dos tubos en uno y centrifugar como se demostró anteriormente.
Repita el proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo. Lavar el pellet obtenido de la última centrifugación utilizando 300 microlitros de tampón A.Cuantificar la concentración de proteína mitocondrial utilizando el ensayo de Bradford. Antes de la fusión con la línea celular receptora mitocondrial, evaluar la ausencia de contaminantes del núcleo en la fracción mitocondrial mediante inmunodetección de proteínas nucleares.
Alternativamente, realice una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o la amplificación QPCR de un gen nuclear.
