Para la generación cíbrida transmitocondrial, utilice las células receptoras mitocondriales que se han agotado a mitocondrias por el tratamiento con rodamina 6G, y realice la fusión con mitocondrias aisladas de las células donantes de mitocondrias. Asegurar la abolición adecuada de la función mitocondrial en las células receptoras y la purificación de orgánulos de las células del donante mediante la siembra de un pequeño número de células tratadas con rodamina 6G y mitocondrias aisladas en un medio de cultivo completo en una placa de seis pocillos. Verifique si no quedan células sobrevivientes en los pozos después de un mes de cultivo.
Para proceder con la fusión, agregue cuidadosamente las células tratadas con Rhodamine 6G al pellet de mitocondrias aislado. Luego centrifugar a 520 g durante cinco minutos para permitir que las células se mezclen con las mitocondrias. Agregue 100 microlitros de polietilenglicol al 50% y resuspenda suavemente el pellet durante 30 segundos Luego deje que la suspensión repose intacta durante otros 30 segundos.
Finalmente, transfiera la mezcla a una placa de seis pocillos con medio de cultivo celular completo fresco y colóquela en la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Por lo general, después de aproximadamente una semana, los cíbridas transmitocondriales deben comenzar a crecer, dando lugar a clones que pueden seleccionarse individualmente o mezclarse en un grupo antes de su análisis. Los fragmentos de restricción obtenidos del análisis del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, o RFLP, de mitocondrias de tipo salvaje diferían del mutante.
El análisis RFLP de las nuevas líneas celulares transmitocondriales indicó que los fragmentos de restricción eran idénticos a los obtenidos en sus respectivos donantes mitocondriales y diferentes de los generados con las líneas celulares receptoras. Además, la diferencia en un perfil típico de genotipado nuclear de ADN de las dos líneas celulares utilizadas en el proceso de hibridación también podría usarse para confirmar la pureza del ADN nuclear.
